PLoS ONE: Undersøgelse Migration Inhibition og Apoptotiske Effekter af Fomitopsis pinicola Chloroform Uddrag på menneskelige Kolorektal Cancer SW-480 Cells

Abstrakt

Baggrund

Fomitopsis pinicola (Sw Ex Fr.. m) Karst

(FPK), der tilhører den Basidiomycota fungal klasse er en af ​​de mest populære medicinske svampe i Kina. Det har været anvendt i mange sygdomme: kræft, hjertesygdomme, diabetes og så videre. Imidlertid har lidt undersøgelse af pro-apoptotiske effekt og migration hæmning af FPK chloroform ekstrakt (FPKc) blevet rapporteret og den mulige involverede mekanisme er ikke blevet belyst.

Metodologi /vigtigste resultater

Kemisk analyse blev udført ved HPLC som viste ergosterol (ES) koncentration var 105 ug /mg. MTT-assay viste, at FPKc selektivt kunne inhibere SW-480 celler levedygtighed med IC

50 af 190,28 ug /ml. Sårheling og transwell assay viste, at FPKc kunne hæmme migration af SW-480 celler naturligvis FPKc kunne også faldet drastisk de matrixmetalloproteinaser-2, 9 (MMP-2 og MMP-9) udtryk. Annexin V-FITC /PI farvning, nuklear Hoechst 33342 farvning og DNA-fragmentering analyse afslørede, at FPKc og ES kunne fremkalde SW-480 celler apoptose. Den apoptose proces tæt involveret i ROS ophobning og nedbrydning af GSH, aktivering af caspase 3, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) nedbrydning. FPKc kunne også opregulere P53 udtryk og dermed føre til G1 fase anholdelse. Når SW-480-celler blev forbehandlet med N-acetylcystein (NAC), den ROS-generering, cellelevedygtighed og apoptotisk forhold blev delvist afvist, hvilket indikerede, at ROS var lodret i pro-apoptose proces induceret af FPKc. Øvrigt i hele processen, ES, som tidligere er fundet i FPKc havde den samme virkning som FPKc. Således kunne vi konkludere, at ES, som en af ​​de højeste rigelige komponenter i FPKc, kan også være en af ​​de aktive bestanddele.

Konklusion /Betydning

FPKc kunne hæmme migration af SW-480 celler, inducerer SW-480 celler G1 fase anholdelse og forårsage ROS-medieret apoptose effekt. Og ES kan være en af ​​de effektive bestanddele i hele processen

Henvisning:. Wang Y, Cheng X, Wang P, Wang L, Fan J, Wang X, et al. (2014) Undersøgelse Migration Inhibition og Apoptotiske Virkninger af

Fomitopsis pinicola

Chloroform Uddrag på human tyktarmskræft SW-480 celler. PLoS ONE 9 (7): e101303. doi: 10,1371 /journal.pone.0101303

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: December 19, 2013; Accepteret: 3 juni 2014; Udgivet 3. juli, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en tumor med fleetness stigende verdensomspændende hvert år. Hvert år næsten halvdelen af ​​de diagnosticerede patienter ville være døde af sygdommen [1]. CRC betragtes som den tredje mest almindelige ondartede tumor og den tredje dødsårsag ved cancer i USA [2]. Selvom forekomsten af ​​CRC er meget lavere i Asien sammenligne med det i USA, er det blevet hastigt stigende i Kina [3]. Mens traditionel behandling for CRC herunder kirurgi, strålebehandling, og aktuelle kemoterapeutiske muligheder har været ude af effektivitet og har mange bivirkninger [4]. Alle disse problemer understrege betydningen at finde en ny agent for CRC. Som traditionel kinesisk medicin har været mere og mere populære, er det blevet betragtet som potentiel terapeutisk middel på grund af sin høje effektivitet og sikkerhed [4].

Fomitopsis pinicola (Sw. Ex Fr.) Karst

(FPK), der tilhører den Basidiomycota svampe klasse er en af ​​de mest almindelige træ rode svampe og vidt udbredt i mange lande i verden, såsom Japan, Korea, Kina og Sverige [5]. FPK blev traditionelt brugt som en helsekost kilde til planternes vækst regulering og diabetes i Japan [6], [7]. FPK som et ikke-toksisk naturprodukt har været mere og mere attraktivt for forskere, og dets ekstrakter er blevet rapporteret at have anti-inflammatorisk, anti-mikrobiel, anti-svampe og anticancervirkning [8], [9], [10]. For anticancer effekt af FPK, forskning fokuserede primært på sin ethylacetat og ethanol ekstrakter. Eksempelvis Ren G demonstrerede både petroleumsether og ethylacetat ekstrakter af FPK har cytotoksiciteten mod nogle tumorcellelinjer såsom Hela og SMMC-7721 [11]. Hung-Tsung Wu fra Taiwan har vist F. pinicola ethanol ekstrakt har anticancer effekt på S180 celler in vitro og in vivo. Han viser også, at det kunne udløse Homo sapiens hepatoma (HepG2), lungekræft (A549), kolorektal cancer (HCT-116) og brystkræft (MDA-MB-231) celler apoptose [12]. Og for FPK chloroform ekstrakt (FPKc), er der kun én rapport at demonstrere sin anti-fungal virkning [10]. Til vores bedste viden, har lidt information om anticancer effekt af FPKc blevet offentliggjort. Derfor er det første formålet med vores undersøgelse var at vurdere, om FPKc kan udøve sin anticancer effekt i vores eksperimentelle system, så først og fremmest fokusere på at undersøge migration hæmning og pro-apoptose effekt af FPKc og potentialet involverede mekanismer.

Endvidere den kemiske analyse af FPK ekstrakter, som primært pege n-hexan og methanol ekstrakter af FPK indeholder nogle triterpenoids såsom ergosterol, ergosterol derivater, lanostane triterpener og så videre [13], [14]. Mens er aldrig blevet undersøgt den kemiske analyse om FPKc. Fordi ergosterol (ES, figur 1) er blevet rapporteret at vid udbredelse i mange former for svampe og vise nogle anticancervirkning [15], [16]. Således den anden Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de kemiske komponenter af FPKc og undersøge, om ES arbejdede da FPKc gennemført sin anticancer effekt.

Metoder og Materialer

Indsamling og udarbejdelse af chloroform ekstrakt

Ingen specifikke tilladelser var nødvendige for det sted, hvor FPK blev opsamlet, og denne undersøgelse ikke involverer truede eller beskyttede arter.

den friske FPK blev opsamlet i juli 2011 fra Pingheliang, syd af Qinling Mountains, Shaanxi-provinsen, Kina (breddegrad, 33 ° 27’N, længdegrad, 108 ° 30 ‘Ø, højde, 2305 m). Det blev bekræftet af Prof. Yaping Xiao og deponeret i Undervisningsministeriet, Key Laboratory for lægeplante Resource (MPR) og Natural Pharmaceutical Chemistry, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi, PR China.

ethanol ekstrakt af FPK blev opnået gennem ultralydsekstraktion metoden og derefter koncentreret med en rotationsfordamper (RE-2000 a; Belong, Shanghai, Kina). For det tredje blev det tørret med en fryse-tørretumbler (ALPHA1-2, KRISTUS, Tyskland) og til sidst frysetørret. Ethanolekstraktet blev derefter fraktioneret ved chloroform (CHC

3). Chloroformen fraktion blev homogeniseret i 70% ethanol, og supernatanten blev filtreret under anvendelse af 0,22 mm filtre.

HPLC-analyse

Bestemmelsen af ​​FPKc og ES blev evalueret gennem højtydende væskekromatografi (HPLC) analysemetode. LC-systemet bestod af Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) med en kvaternær pumpe, en termostat kolonne rum og Shimadzu LC løsning software. Adskillelse af fytokemikalier blev opnået på en Shim-pack VP-ODS C18-kolonne (Shimadzu, 1504,6 mm; 5 mm partikelstørrelse). Den mobile fase bestod af acetonitril og vand. En gradienteluering program blev anvendt som 10-100% acetonitril (volumen /volumen) ved 0-80 min, 100% -85% ved 80-90 min, holde 85% ved 90-100 min. Søjlen Temperaturen blev holdt konstant ved 40 ° C, og den mobile fase Strømningshastigheden var 0,8 ml /min. Detektionsbølgelængden var 254 nm og 20 pi prøver blev injiceret. Re-ligevægt varighed var 15 min mellem de enkelte kørsler.

Kalibreringskurver

ES standard blev bragt i Sima, Tianjin, Kina. Renheden blev vist at være større end 98%. Kalibreringskurver blev konstrueret med fortyndinger på 2000, 1000, 500, 250, 125 ug /ml i methanol. Et volumen på 20 pi blev injiceret med tredobbelte og kalibreringskurver var baseret på de gennemsnitlige peak inden for hver kromatogram. Kalibreringskurverne viste en R

2 af 0,993 til ES.

Cell kultur

SW-480, SW-620, Caco-2 og HEK-293 celler blev købt fra cellebank af det kinesiske Academy of Science, Shanghai, Kina. SW-480, SW-620 Caco-2 og HEK-293-cellelinjer blev dyrket i RPMI-1640, L-15 og DMEM-medium, henholdsvis. Alle af dem blev dyrket med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) og 1% glutamin i 100 cm

2 vævskulturkolber under en befugtet 5% CO

2 og 95% luft atmosfære ved 37 ° C.

Cell levedygtighed

for at vurdere effekten af ​​FPKc på SW-480, SW-620 og Caco-2 celler levedygtighed blev celler podet i 96-brønds plader (5 × 10

4, 1 x 10

5 og 1 x 10

5). Forskellige koncentrationer af FPKc blev anvendt på SW-480 (120, 160, 200, 240 ug /ml, 70% ethanol blev anvendt som opløsningsmiddel kontrol) og SW-620 (40, 80, 120, 160, 200, 240 ug /ml) og Caco-2 (40, 80, 120, 160, 200, 240, 280 ug /ml) celler. Forskellige doser af ES (0, 12, 24 ug /ml; 100% ethanol) blev tilsat i SW-480-celler. Derefter blev alle cellerne inkuberet i 48 og 72 t. Humane embryoniske nyre

293

(HEK-293) celler blev anvendt som normale celler i modsætning til at vurdere den cytotoksiske anticancer aktivitet af FPKc. Levedygtigheden af ​​de fire cellelinjer blev bestemt ved anvendelse MTT-assayet [17]. Absorbansen ved 570 nm blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek ELX800, USA). Cellelevedygtigheden af ​​FPKc og ES-behandlede prøver blev derefter opnået ved sammenligning med kontrollen. (Alle de nævnt i denne artikel henvist til tørvægt koncentration).

Cell motilitet

Cell motilitet blev evalueret ved scratch sår og transwell assay. For ridse såret assay: SW-480-celler blev udpladet i 24-brønds plader i 24 timer, derefter celler i individuelle brønde blev såret ved at skrabe med en pipettespids, og cellerne blev inkuberet med den angivne koncentration af FPKc og ES til 12 og 24 timer. Cellerne blev fotograferet under fasekontrastmikroskopi (x 200 forstørrelse).

I Transwell assay 5 × 10

5-celler blev podet i øverste kammer med serum-frit medium indeholdende 0,3% BSA og medium indeholdende 10% serum blev tilsat til det nederste kammer af Corning kammer (polycarbonat filter med 8 mm porestørrelse skær, Corning Pharmingen, San Diego, CA). Efter inkubation i 36 timer, cellerne flyttet til undersiden af ​​membranen blev påvist ved at tørre den øvre side med vatpind og farvning undersiden celler med 0,1% krystalviolet opløsning. Celler flyttet til undersiden af ​​membranen blev observeret under mikroskop, og krystalviolet klæbet i undersiden celler blev opløst i 33% eddikesyre blev OD-forholdet af opløsningen målt ved 570 nm ved mikropladelæser.

Immunofluorescens

efter FPKc inkubation i 24 timer blev celler anbragt som folowing: fikseret med 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 og blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA), mellem hvert trin celler blev vasket af PBS til tre gange. Efter cellerne blev blokeret, blev de inkuberet med anti-MMP-9 og MMP-2-antistoffer (indkøbt fra Santa Cruz) natten over og farvet med den tilsvarende sekundære antistof udføres af immunoglobulin FITC (Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Beijing, Kina ) ved 37 ° C i mørke i 1 time, og derefter Celler blev afbildet med fluorescensmikroskop (Nikon E 600).

Hoechst 33342-farvning

Hoechst 33342-farvning blev udført for at detektere ændringer af kerner morfologi af SW-480 celler efter FPKc og ES behandling. De behandlede celler blev farvet med 10 pM Hoechst 33342 i 15 minutter ved 37 ° C, hvorefter de farvede celler blev vasket tre gange med PBS og iagttaget under anvendelse af en fluorescens mikroskopi med standard excitationsfiltre (Nikon, Japan). Excitation bølgelængde var 346 nm og emission bølgelængde var 460 nm

Flowcytometrianalyse af DNA fragmentering

Den metode til at analysere DNA-fragmentering var flow fluorocytometric detektion af DNA hypoploidy efter tilsætning propidiumiodid (PI.; Sigma, St. Louis, USA) til de døende celler og permeabilisering dem ved fryse-optøning [18]. For at undersøge virkningen af ​​FPKc og ES på DNA beskadigelse af SW-480 og HEK-293-celler, udførte vi oligonucleosomal DNA-fragmentering ved flow fluorocytometry. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med forskellige koncentrationer af FPKc og ES i 12 t. Celler blev derefter farvet med 5 pg /ml PI og analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af flowcytometri.

Cellecyklusanalyse

SW-480 blev podet i 24-brønds plader, og derefter behandlet med FPKc og ES (0, 240 og 24 ug /ml) i 24 timer. Derefter blev cellerne høstet og anbragt som følgende trin: vasket to gange med kold PBS indeholdende 1% BSA (Sigma, St. Louis, USA), fikseret med 70% iskold ethanol ved -20 ° C natten over, derefter vasket to gange med kold PBS , inkuberet med 100 ug /ml RNase A (Sigma, St. Louis, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, efter at farvet med 50 pg /ml PI for 30 minutter i mørke og endelig analyseret med flowcytometri (Millipore, USA).

Annexin V-FITC /PI-farvning eksperiment

Phosphatidylserin tjener som en følsom markør for celler, som undergår apoptose, når den externalized til den ydre folder [19]. forholdet af apoptotiske celler blev således målt med et Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt, SW-480, SW-620 og HEK-293-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af FPKc og ES i 24 timer ved 37 ° C, hvorefter de behandlede celler blev høstet og resuspenderet i 200 pi bindingsbuffer. Efter tilsætning af 2 pi Annexin V-FITC og 2 pi PI i cellesuspensionen blev prøverne inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Den apoptotiske indeks blev straks bestemt ved flowcytometri.

Påvisning af intracellulær reaktive oxygenarter (ROS) generation

Nogle spiselige svampe, såsom Pleurotus abalonus kunne provokere ROS-medieret apoptose [20] . I denne undersøgelse målte vi også ændringer i det cellulære ROS niveau gennem den oxidative konvertering af den følsomme fluorescerende probe 2 ‘, 7′-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) til fluorescerende 2′, 7’-dichlorofluorescein (DCF). DCFH-DA let diffunderer gennem cellemembranen og enzymatisk hydrolyseres af intracellulære esteraser til dannelse af ikke-fluorescerende DCFH, som derefter hurtigt oxideres til dannelse stærkt fluorescerende DCF i nærvær af ROS, og fluorescensintensiteten er proportional med ROS-produktion. SW-480 og HEK-293-celler i plader med 24 brønde blev behandlet med den nævnte koncentration af FPKc og ES i 3 og 6 timer (HEK-293-celler kun i 6 timer). Cellerne blev høstet og vasket to gange med PBS, resuspenderet i 500 pi 10 pM DCFH-DA (indkøbt fra Molecular Probes Inc., Invitrogen, CA, USA) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Prøverne blev derefter straks detekteret ved flowcytometri. Histogrammer blev analyseret ved anvendelse FCS Express V3.

Glutathion bestemmelse

SW-480-celler blev inkuberet i 24-brønds plader, og så blev de behandlet med FPKc og ES i 3 timer og 5 timer. Derefter blev de behandlede celler høstet og vasket to gange med PBS. Total glutathion koncentrationer blev udført af Glutathion Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering institut, Kina) ifølge producentens protokol. Til sidst blev prøverne målt ved 405 nm med mikropladelæser (Bio-Tek ELX 800, USA).

Western blotting farvning

SDS-PAGE og immunoblotting blev udført ifølge standardprocedurer. Kort fortalt, efter behandling med FPKc (240 ug /ml) og ES (24 ug /ml) i 0 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer blev cellerne lyseret ved RIPA buffer på is. De proteinprøver blev adskilt på en 10% SDS polyacrylamidgel, og derefter blev gelen overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA) og blottet med primære antistoffer (caspase-3, spaltes-RARP, Bcl-2, P53 blev købt fra Cell Signaling Technology, USA) natten over ved 4 ° C. De bundne primære antistoffer blev derefter mærket med IRDye 680 konjugeret IgG (Li-cor, Biosciences) ved stuetemperatur i 1 time. Og den infrarøde fluorescens blev påvist med Odysseen infrarød billeddannelse-system (Li-Cor Bioscience, Lincoln, NE).

Statistisk analyse

Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer, og data blev udtrykt som betyder ± SD. IC50-værdier blev beregnet ved regressionsanalyse. Dataene blev udsat for en analyse af Duncans test multiple område (SPSS version 18.0). En væsentlig forskel blev vurderet til at eksistere på et niveau ** p. 0,01

Resultater

HPLC

HPLC-analysen er blevet adgang til at identificere ES og de kemiske komponenter af FPKc. Dataene er vist i figur 2, på de samme forsøgsbetingelser, ES standard viste sin retentionstid på 83,8 min (figur 2B); FPKc vises seks vigtigste toppe og omfattede et højdepunkt med samme retentionstid af ES, hvilket indebærer ES kan være en af ​​de vigtigste komponenter i FPKc (figur 2A); Fra området af toppene, det afslørede ES rangeret det andet i FPKc; Fra den kvantitative bestemmelse af ES i FPKc med HPLC, vi spekulerede ES besad 105 ug /mg (ca. 10% i det samlede FPKc).

FPKc og ES standard blev identificeret ved HPLC-PDA ved 254 nm som beskrevet i det eksperimentelle afsnit.

cytotoksiske virkninger af FPKc og ES

Figur 3A-C viste cytotoksiciteten af ​​FPKc på SW-480, SW-620 og Caco-2-celler henholdsvis som var på en dosis- og tidsafhængig måde. Når SW-480-celler blev behandlet med 120 og 240 ug /ml FPKc i 48 timer, tabet cellelevedygtigheden var 34.99 ± 1,08% og 65,20 ± 2,34%, IC

50 blev beregnet som 190,28 pg /ml; For SW-620 celler, celle levedygtighed faldt til 74,61 ± 0,99% og 29,52 ± 1,28%, når koncentrationen var 80 og 160 mg /ml henholdsvis IC

50 blev beregnet som 143,26 pg /ml. Caco-2 udført mindre følsomme end de ovennævnte 2 cellelinier. Efter 72 h inkubation med FPKc, Caco-2 begyndte at udføre levedygtighed tab, cellelevedygtigheden var 71,65 ± 0,003% med 200 ug /ml FPKc, og når dosis øges til 280 pg /ml cellelevedygtigheden faldt til 47,16 ± 0,011% og IC

50 var 371,5 pg /ml.

SW-480, SW-620, levedygtighed Caco-2 og HEK-293-celler efter FPKc (A, B, C, D) og ES (e) behandling blev målt ved MTT-assayet. Hver værdi blev udtrykt som en middelværdi ± S. D. af mindst tre uafhængige bestemmelser. Envejs ANOVA blev anvendt til sammenligninger af multipel gruppe betyder efterfulgt af Dunnetts t-test. * P 0,05 og ** P 0,01 versus kontrol. (fejlmargener = S. D., n = 3).

Figur 3D viste cytotoksiske aktivitet af ES, og celler skader var 34,52 ± 0,58%, når ES dosis var 24 mg /ml efter 48 h inkubation. Til sammenligning under de samme eksperimentelle betingelser, 240 pg /ml FPKc forårsagede 65,20 ± 2,34% cellernes levedygtighed tab, hvilket tyder på nogle andre cytotoksiske komponenter eksisterende i FPKc.

Til sammenligning figur 3E afspejlede cytotoksicitet af FPKc på menneskers normale embryoniske 293-celler (HEK-293), blev en relativt svagere celleskader observeret i HEK-293-celler sammenlignet med SW-480 celler under den samme dosis af FPKc, hvilket tyder FPKc har nogle selektiv tumor celledræbende virkning.

migration hæmning af FPKc og ES på SW-480 celler in vitro

for at bestemme om FPKc påvirkede migration evne SW-480 celler, sårheling og transwell assay blev udført (figur 4A). Den sårhelende evne af celler afspejlede deres bevægelse og migration på overfladen, hvor de blev forankret til for vækst. I SW-480-celler, sammenlignet med 0 timer efter sårdannelse, efter 12 h inkubation, hver tætte celler i kontrol voksede gradvist til mellemrummet af såret; celler i 120 ug /m FPKc behandlede gruppe udviste lille forskel med kontrol; mens celler i 240 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES behandlede grupper sjældent voksede til mellemrummet af såret. Når inkubationstiden forhøjes til 24 timer blev evnen hos migration celler faldt med hver dosis af FPKc. Og antallet af celler med 120 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES ændrede sig ikke meget sammenligning med kontrollen, mens 240 pg /ml behandlede gruppe faldt synligt. Salg

SW-480 celler i 24- brønds plader blev såret ved at skrabe med en pipettespids, og cellerne blev inkuberet med FPKc og ES i 12, 24 timer. Cellerne blev fotograferet under fasekontrastmikroskopi (x 200 forstørrelse). Figur 4B, Analyse af ændring i migration på SW-480 celler ved Transwell assay. Celler i hver gruppe flytte til den nedre overflade af filteret blev farvet med krystalviolet og fotograferet under et lysmikroskop ved × 200. b) OD-forhold på krystalviolet blev målt. Fejl- søjler repræsenterer SD af midlerne fra tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p. 0,01 versus ubehandlede kontrol

Transwell assay blev ansat til yderligere at bekræfte migrationshæmning induceret af FPKc på SW-480 celler. Og figur 4B viste, at efter 24 timers inkubation med FPKc, den cellemigrering evne faldt til 28,28 ± 0,07% sammenligning med kontrollen; og for ES-gruppen, migration var 51,92 ± 0,85%, som bekræftede sårheling analysen. De to resultater viste FPKc og ES kunne hæmme celle migration naturligvis.

Immunofluorescens

MMP’er er lodret i cellen migration og bevægelse. MMP-2 og MMP-9 blev detekteret ved immunfluorescens eksperiment i dette studie. Figur 5 viste MMP-2 og MMP-9 blev højt udtrykt med lyse grøn fluorescens i kontrolgruppen. Og for ES og FPKc grupper, faldt begge enzymer markant sammenlignet med kontrollen.

SW-480-celler blev fikseret og forarbejdet til immunofluorescens, MMP-9 og MMP-2 blev visualiseret under anvendelse FITC-mærket andet antistof ( grøn). Scale barer, 100 um.

Morfologiske forandringer som følge af FPKc og ES på SW-480 celler

Morfologisk undersøgelse blev udført af Hoechst 33342. Som vist i figur 6, kerner af kontrolceller blev ensartet farvet, og kontrasten fase angivne normal SW-480 cellemorfologi med små øer af epitelceller. Men celler efter FPKc og ES behandling i 48 timer viste signifikante morfologiske ændringer: kondenseret kromatin og fragmenteret punktformig blå nuklear fluorescens blev set på en dosis-afhængig måde. Når FPKc dosis var 240 ug /ml, den nukleare farvning var naturligvis og fase billeder viste, at celler ændret til unormal runde type, og antallet af celler blev reduceret tydeligt.

SW-480-celler behandlet i 48 h blev farvet med Hoechst blev observeret 33342. Morfologiske ændringer under fluorescerende mikroskop.

DNA fragmentering induceret af FPKc og ES

PI farvning ved flowcytometri blev brugt til at evaluere DNA-skader forårsaget af FPKc og ES. Som vist i figur 7A, FPKc ved 120 ug /ml udløste en 1,8 gange stigning i DNA-skader i SW-480-celler, og 240 ug /ml FPKc førte til en koncentrationsafhængig forøgelse af DNA fragmentation med 7,2 gange, sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,01). En tilsvarende stigning med 4,2 gange i rød fluorescens intensitet SW-480-celler blev også opnået via inkubation med ES (24 ug /ml). Figur 7B viste 240 pg /ml FPKc inducerede 18,26 ± 0,28% DNA-skader på HEK-293 (ca. 1,6 fold af kontrol), som angivet HEK-293 udført langt mindre DNA-skader (p 0,01) end for SW-480 celler (p .. 0,01) på samme dosis af FPKc behandling

Begge Cellerne blev behandlet med FPKc og ES for 12 (PI) og analyseret ved flowcytometri

cellecyklusstop induceret af FPKc og ES

til behandling af cancer, cellecyklusstop er blevet betragtet som et af de vigtigste mål. Som vi alle ved, kræftceller altid holde uhæmmet celledeling, fordi deres genmutation som kontrollerede celledelingen [21]. At evaluere effekten af ​​FPKc behandling på fordelingen af ​​cellerne i cellecyklus, gennemførte vi DNA cellecyklusanalyse ved flowcytometri. Figur 8 viste virkningerne af FPKc og ES på cellecyklussen fase (G1, S og G2 /M) fordeling af SW-480-celler. Efter FPKc behandling 24 timer, ophobning af SW-480 celler i G1 steg fra 39,27 ± 0,56% til 56,77 ± 0,5%; mens til ES behandling, ophobning var op til 65,22 ± 0,54%. Resultaterne viste, at FPKc og ES kunne inducere SW-480 celler cellecyklusstandsning i G1-fasen.

SW-480-celler blev høstet og fikseret i 70% alkohol og derefter farvet med PI. Endelig blev de farvede celler analyseres ved hjælp af en flowcytometer.

Apoptose effekt induceret af FPKc og ES

cellecyklusstop er tæt knyttet til apoptose, og afbrydelse af cellecyklusprogression kan i sidste ende føre til apoptotisk /nekrotisk død [22]. For yderligere at evaluere apoptose indeks, FPKc og ES kunne provokere, Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning blev anvendt. Fra figur 9A, var det tydeligt at se FPKc kunne udløse SW-480 celler apoptose i en dosisafhængig måde efter inkubation i 24 timer. Den sene apoptose ratio (øverst til højre) steg fra 15,40 ± 0,53% til 31,82 ± 0,93% sammen med stigningen i FPKc koncentration fra 120 til 240 ug /ml, mens kontrollen var kun 6,42 ± 0,5%. Interessant nok kunne ES (24 ug /ml) også inducerer phosphatidylserin eksternalisering, forholdet mellem sene og tidlige fag apoptose var 28,90 ± 0,63% (øvre og nedre højre).

Celler blev dobbelt-farvet med Annexin V- FITC og PI og derefter analyseret ved flowcytometri. Alle eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Resultaterne repræsenterede gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** p 0,01 angivet statistisk signifikante forskelle versus kontrolgruppen

Figur 9B viste apoptose ledet af FPKc på HEK-293 celler.. Efter inkubering med 240 ug /ml FPKc i 24 timer, apoptose på de behandlede celler var 11,83 ± 3,2% og kontrolgruppen var 9,63 ± 3,7%, hvilket afslørede, at der var nogen stor forskel på de to grupper.

heri SW-620-celler blev også testet ved AnnexinV /PI assay og figur 9C viste, at FPKc kunne inducere SW-620-celler apoptose især tidligt apoptose. Efter 24 timers inkubation med FPKc, forholdet mellem de første apoptose celler var fra 3,13 ± 0,40% til 12,23 ± 0,51% og 15,20 ± 0,40%, da FPKc dosis øges fra 0 til 80 og 160 ug /ml.

ROS akkumulation induceret af FPKc og ES på SW480 celler

Den intracellulære ROS produktionen blev analyseret ved flowcytometri med DCF farvning. De i figur 10A data tydede de intracellulære ROS-niveauer blev forøget efter FPKc og ES behandling. På 3 timer, ca. 34.33 ± 0,45%, 82.77 ± 1,05% og 50,33 ± 0,53% af cellerne i 120 og 240 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES behandlede grupper udviste lyse DCF fluorescens, mens kun 5,40 ± 0,45% af celler i kontrolgruppen udviste lyse DCF fluorescens. Når inkubationstiden øges til 6 timer, havde procentdelen af ​​celler med lyse DCF fluorescens ikke ændre meget i FPKc behandlede celler, ES behandlede celler steg til 71,10 ± 1,7%. Og figur 10B viste efter FPKc behandling, HEK-293 udviste ringe ROS akkumulering sammenligning med kontrollen.

SW-480 (A) og HEK-293 (B) celler blev behandlet med FPKc og ES, og ROS niveauer blev målt ved flowcytometri efter farvning med DCFH-DA. SW-480 celler blev forbehandlet med NAC (5 mM) i 1 time, derefter intracellulære ROS generation (C), DNA-skader (D), celle levedygtighed (E) og apoptose (F) blev påvist.

for yderligere at validere, at ROS var involveret i FPKc induceret apoptotisk effekt af SW-480 celler, blev ROS skraldemanden-NAC forbehandlet med SW-480 celler. Som forventet i nærvær af 5 mM antioxidant NAC, ophobning af ROS faldt til 4,26 gange i forhold til kontrollen, mens FPKc gruppe var 10,15 fold i forhold til kontrollen (figur 10C).

Det er blevet rapporteret, at overdreven mængder af ROS kan forårsage oxidativ skade på lipider, proteiner og DNA, hvilket fører til tumorigenese eller celledød [23]. I denne undersøgelse målte vi DNA-beskadigelse efter co-behandling med NAC. Og resultaterne viste, at DNA-beskadigelse kunne naturligvis vendes ved NAC: DNA-skader indeks var 38.85 ± 2,7%, når cellerne blev behandlet med 240 ug /ml FPKc i 24 timer, NAC co-behandlingsgruppen var kun 8,20 ± 0,71%, mens kontrollen var kun 6,50 ± 0,5% (Figur 10D). Resultaterne viste, at FPKc-induceret DNA-beskadigelse kan være forbundet med ROS akkumulering

Cytotoksiciteten virkning FPKc på SW-480-celler var stort set vendes ved NAC (p 0,01, figur 10E).. De levedygtige celler var omkring 85,73 ± 0,14% og 69,62 ± 0,21% ved forbehandling med NAC, sammenlignet med omkring 55,42 ± 2,00% og 39,44 ± 0,64% ved behandling med 120 og 240 pg /ml FPKc hhv.

annexin V-FITC /PI dobbelt farvning-assay viste også, at forbehandling med NAC delvist kunne beskytte SW-480 celler fra FPKc induceret apoptose (fig 10F). Disse resultater viste, at akkumuleringen af ​​intracellulær ROS deltog i FPKc-induceret apoptose af SW480-celler.

Ændringer i intracellulær glutathion koncentration forårsaget af FPKc

Som GSH udtømning er blevet betragtet som en af ​​de vigtige faktor, der forårsager ophobning af reaktive oxygenarter (ROS) [24] er koncentrationen af ​​GSH i SW-480-celler blev evalueret efter FPKc og ES behandling (figur 11). Når cellerne blev behandlet i 3 timer, den intracellulære GSH-koncentration faldt til 70,38 ± 1,50%, 29,23 ± 1,00% og 50,14 ± 1,70% af kontrollen med 120, 240 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES hhv. Og når inkubationstiden steg til 5 h, har GSH-indholdet i SW-480 celler ikke ændre meget efter FPKc behandling; mens de ES behandlede prøver, cellulære GSH faldt til 42,18 ± 1,00%, hvilket var i overensstemmelse med ROS generation.

Intracellulær GSH koncentration af SW-480 celler efter FPKc og ES-behandlinger blev målt ved 405 nm med mikroplade læser.

Undersøgelse af indholdet af proteiner, der er forbundet med cellecyklus og apoptose

den underliggende mekanisme FPKc-induceret ændring af protein-ekspression er involveret i cellecyklus og apoptose i SW-480-celler blev yderligere belyst ved Western blotting assay (figur 12). Niveauerne af Actin tjente som en intern kontrol. Det konstateredes, at ekspressionen af ​​det anti-apoptotiske protein Bcl-2 blev nedsat, når cellerne blev behandlet med 240 ug /ml FPKc i 48 timer; og de ES (24 ug /ml) behandling celler blev Bcl-2-niveau faldt, når de inkuberes i 24 og 48 timer. I denne undersøgelse, spaltet caspase-3 og spaltes PARP blev evalueret, og resultaterne viste begge af dem blev opreguleret efter inkuberet med FPKc og ES i 24 timer og 48 timer.