PLoS ONE: EGFR-Målrettet Hybrid plasmoniske Magnetiske Nanopartikler Synergistisk Fremkald Autophagy og apoptose i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er overudtrykt i 80% af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og er forbundet med ringe overlevelse. I de senere år har EGFR-målrettet inhibitorer blevet testet i klinikken for NSCLC. På trods af fremkomsten af ​​nye lægemidler og deres anvendelse i behandlingen af ​​kræft, den samlede overlevelsesrate for lungekræftpatienter er stadig 15%. At udvikle mere effektive behandlinger for lungekræft vi har kombineret den anti-EGFR-antistof (Klon 225) som en molekylær terapeutisk med hybrid plasmoniske magnetiske nanopartikler (NP) og testet på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler.

Metodologi /vigtigste resultater

Cell levedygtighed blev bestemt ved trypan-blå assay. Celleprotein ekspression blev bestemt ved Western blotting. C225-NP’er blev påvist ved elektronmikroskopi og konfokal mikroskopi, og EGFR ekspression under anvendelse af immuncytokemi. C225-NP udviste en stærk og selektiv antitumorvirkning på EGFR-udtrykkende NSCLC-celler ved at inhibere EGFR-medieret signaltransduktion og induceret autofagi og apoptose i tumorceller. Optiske billeder viste specificitet interaktioner mellem C225-NP og EGFR NSCLC celler. Ingen binding af C225-NP blev observeret for EGFR-null NSCLC-celler. C225-NP udviste højere effektivitet i induktion af celledrab i sammenligning med den samme mængde af frit C225 antistof i tumor celler med forskellige niveauer af EGFR. Derudover, i modsætning til C225-NP, fri C225 antistof inducerede ikke autofagi i celler. Men den terapeutiske effektivitet af C225-NP gradvis nærmede sig niveauet af frie antistoffer som mængden af ​​C225-antistof konjugeret pr nanopartikel blev reduceret. Endelig fastgørelse C225 til NP var vigtigt for at producere den forbedrede tumorceller drab som tilsætning af blanding af fri C225 og NP viste ikke den samme grad af celledræbende aktivitet.

Konklusioner /Betydning

vi viste for første gang den molekylære mekanisme af C225-NP inducerede cytotoksiske virkninger i lungekræft celler, der ikke er karakteristisk for frie molekylære terapeutika dermed øge effektiviteten af ​​behandlingen mod NSCLC

Henvisning:. Yokoyama T, Tam, J., Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) EGFR-Målrettet Hybrid plasmoniske Magnetiske Nanopartikler Synergistisk Fremkald Autophagy og apoptose i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10,1371 /journal.pone.0025507

Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA

Modtaget: August 9, 2011; Accepteret: September 5, 2011; Udgivet: November 7, 2011

Copyright: © 2011 Yokoyama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Cancer Institute giver R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE i lungekræft), CA16672, og The Joans Legacy: United mod lungekræft. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) overudtrykkes i 80% af NSCLC og er forbundet med ringe overlevelse [1]. I de senere år har EGFR-målrettet inhibitorer blevet testet i klinikken for NSCLC [2] – [6]. Imidlertid har de nye molekylære lægemidler produceret beskedne stigninger i patientens overlevelse i overlevelse af patienter, der fik standard ikke-målrettede behandlinger. Som et resultat af den samlede overlevelsesraten for patienter med lungecancer er stadig under 16% [7]. Således er der fortsat incitament til at udvikle og afprøve nye behandlingsformer. Vores tilgang til at overvinde den begrænsning af de nuværende behandlinger har været at kombinere molekylære lægemidler med nye inden for nanoteknologi og test mod lungekræft.

Det er blevet overbevisende vist, at nanoteknologi kan levere unikke løsninger til revolutionere diagnostik og behandling af mange ødelæggende sygdomme såsom cancer [1], [8] – [11]. Et bestemt område af stor interesse er udvikling af nanopartikler for molekylær specifik billeddannelse, terapi og kombineret imaging /terapi [12] – [13]. Multiplexing forskellige typer af nanopartikler (NPS) og rettet mod molekyler giver en fælles platform for flere imaging applikationer med en høj grad af fleksibilitet [14] – [15]. Selvom billedbehandling og fototermisk behandling med plasmoniske og hybride plasmoniske nationale parlamenter er blevet ganske grundigt undersøgt, er de molekylære mekanismer i NP interaktioner med levende celler ikke fuldt forstået. For nylig blev det påvist, at NP’er interagerer med celler i en størrelse-afhængig måde med 40-50 nm NP’er viser den største celleoptagelse [16]. Men i denne undersøgelse de molekylære signalering virkninger efter NP’er optagelse blev ikke undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse vi kombineret anti-EGFR-antistof (klon 225) som en molekylær terapeutisk med hybride plasmoniske magnetiske NP’er og studerede den molekylære interaktioner mellem EGFR-målrettet NP (225-NP) i størrelsesområdet på 40-50 nm og human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler. Den 225-NP består af en paramagnetisk jern kerne, der er omgivet af en guld lag og er funktionaliseret med monoklonale anti-EGFR-antistoffer (klon 225). Vi brugte humane lunge kræftceller med forskellige niveauer af EGFR og ændrede overfladen sammensætning af NP at belyse mekanismer disse interaktioner. Vores indledende mål var at bruge C225-NP som et billeddannende middel målrettet mod EGFR overekspression lungecancerceller. Uventet fandt vi, at C225-NP selektivt blev cytotoksisk for EGFR-overekspression lunge kræftceller ud over, hvad man kunne forvente fra ukonjugeret antistof. Vores resultater giver en ny retning mod øget styrken af ​​molekylære specifikke lægemidler gennem deres tredimensionelle arrangement på nanoskala hjælp nationale parlamenter som skabeloner.

Resultater og Diskussion

225-NP-behandling regulerer EFGR- signalvejen og dræbe lunge tumorceller mere effektivt end normale celler

først undersøgte vi EGFR (phosphoryleret og total) udtryk i flere humane NSCLC cellelinier, der er vildtype (H1229), muteret og overudtrykt (HCC827, H1975 , H3255), amplificeret (H1819), eller null (H520) for EGFR og sammenlignes med EGFR i normale lungefibroblaster (MRC-9 og WI38) og normale humane bronchiale epithelceller (NHBE) ved Western blotting. Både total og phosphoryleret EGFR (pEGFR) udtryk blev påvist i alle testede bortset H520 celler, som er null for EGFR cellelinjer. Imidlertid pEGFR ekspressionsniveauer varierede blandt de cellelinier med høj ekspression påvist i HCC827, H1819 og H3255-celler (figur 1A). H1299-celler havde en mellemliggende ekspressionsniveau af pEGFR. I modsætning hertil normale celler (NHBE, MRC-9, og WI38) og H1975 celler udtrykte lave niveauer af pEGFR. Behandling med C225-NP signifikant (P = 0,05) faldt levedygtighed EGFR positive HCC827, H1299 og H1819 cancerceller sammenlignet med behandling med kontrol-IgG-NP (figur 1b.). De C225-NP-medierede hæmmende virkninger dog varierede blandt de testede cancer cellelinjer og var uafhængig af EGFR mutationsstatus. Ingen inhibitoriske virkninger blev observeret i C225-NP-behandlede H520 celler sammenlignet med IgG-NP-behandlede celler. Blandt de normale celler, MRC-9, men ikke NHBE celler viste nogle inhibitoriske virkninger, når de behandles med C225-NP og sammenlignet med IgG-NP behandling (figur 1b). Men de inhiberende virkninger observeret i C225-NP-behandlede MRC-9 (9%) celler var mindre end de inhiberende virkninger observeret i C225-NP-behandlede tumorceller (14-18%).

(a ) Ekspression af phosphoryleret og total EGFR i normale og NSCLC-celler. (B) Cell drab i respons på EGFR-målrettet C225-NP på NSCLC og normale celler. De viste resultater er midlet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. * P-værdi. 0,05 vs IgG-NP på H1299, HCC827, og H1819 celler

Derefter vurderede vi det protein udtryk for phosphoryleret EGFR og EGFR-associerede signalmolekyler i tumor og normale celler efter behandling med IgG- eller C225-NP. Reduceret ekspression af phosphoryleret-EGFR, -Akt, -p38MAPK, og p44 /42MAPK efter C225-NP behandling sås i HCC827 og H1299-celler sammenlignet med celler behandlet med kontrol-IgG-NP (figur 2). I H520 celler ekspressionen af ​​alle disse proteiner forblev uændret ved behandling med 225-NP og sammenlignet med celler behandlet med IgG-NP (figur 2). Immunohistokemisk analyse viste pEGFR ekspression blev markant reduceret (35%;

P

0,05) i HCC827 celler ved 30 og 60 minutter efter behandling med C225-NP sammenlignet med pEGFR ekspression i IgG-NP-behandlede celler (8 -12%, figur S1). I normale (MRC-9 og NHBE) celler, der var ingen markant reduktion i pEGFR eller de associerede proteiner analyseres fra IgG-NP- og C225-NP-behandling (figur 2). Salg

inhiberende virkninger C225- NP på phosphoryleret EGFR og nedstrøms signalmolekyler i menneskelig lungekræft og normale celler. C225-NP-behandling reducerede ekspressionen af ​​phosphorylerede (p) former af EGFR, AKT, p38 MAPK, og P44 /42 MAPK i EGFR-positive tumorceller, men ikke i normale celler. Der var ingen effekt på EGFR-null H520 tumorceller.

225-NP-behandling giver større antitumoraktivitet end C225 og NP behandling alene

Dernæst vi bestemt bidrag individuelle komponenter, der udgør C225-NP på de observerede væksthæmmende effekter i tumorceller. HCC827 tumorceller behandlet med AuFe alene og gratis C225-antistof alene reducerede cellelevedygtigheden med 12-14% i forhold til ubehandlede kontrolceller, mens kombinationsbehandling med fri C225-antistof plus AuFe reduceret celleantal med 22% (figur 3a). Interessant C225-NP stærkt reduceret celleantal (48%; P 0,05), der var markant højere end den inhiberende virkning af individuelle bestanddele (225-antistof, AuFe), der angiver konjugering af C225 antistoffer til NP øger anticancer aktivitet af C225- NP’er. For yderligere at validere vores resultater vi sammenlignet de inhiberende virkninger af C225-antistof med klon 29.1-antistof. Både Klon 225 og Klon 29.1 antistoffer binder til EGFR. Imidlertid Klon 29.1 modsætning Klon 225 binder til et kulhydrat rest på ydre del af EGFR og hæmmer ikke EGF-medieret EGFR-signalering [17]. Behandling af HCC827 celler med C225-NP producerede den største inhiberende virkning (~42%; P 0,05; figur 3b), der var signifikant højere sammenlignet med den inhiberende virkning ved Klon 29,1-NP (~14%) og andre kontrolbehandlinger (~ 7% -15%). Disse resultater demonstrerer konjugation af klon 225 antistoffer mod AuFe NP giver en unik egenskab der forbedrer antitumoraktivitet over EGFR-positive cancerceller. Svarende til vores resultater, konjugering af anti-ErbB2-antistof til sfæriske guld NP vist øget drab af brystcancerceller i sammenligning med anti-ErbB2-antistoffet og NP alene [18]. I denne undersøgelse cytotoksiciteten blev undersøgt som en funktion af NP størrelse. Men undersøgelsen ikke ind på molekylær mekanisme for forøget tumorcelledrab. Betydningen af ​​overfladekoncentrationen af ​​antistoffer bundet til nanopartikler også blev ikke analyseret.

(a) HCC827 celler behandlet med C225-NP viste signifikant tumordræbende virkning sammenlignet med behandling med AuFe, 225 antistof og AuFe plus C225 antistof. * P-værdi er 0,05. (B) Sammenligning af de hæmmende virkninger af 29,1-NP med C225-NP på HCC827 celler. C225-NP behandling produceret en større dræber effekt end gjorde 29,1-NP behandling i forhold til andre behandlingsgrupper. * P-værdi er. 0,05

225-NP-behandling inducerer autofagi og apoptose i EGFR-positive tumorceller, men ikke i EGFR-negative tumorceller

Her til at bestemme molekylære mekanisme af C225-NP-medieret tumorvækst inhibering udførte vi flowcytometrisk analyser på C225-NP-behandlede HCC827 og -H520 celler. Som vist i figur 4a, sub-G1 population, som viser procentdelen af ​​apoptotiske celler, forøget på en dosis-afhængig måde efter behandling med C225-NP (9% -20%) på HCC827 celler sammenlignet med kontrol-IgG-NP- behandlede celler (4% -8%). C225-NP behandling markant øget antallet af celler i sub-G1 population end gjorde behandling med Clone 225 antistof alene ved ækvimolær koncentration (figur S2). Som forventet var der ingen stigning i antallet af celler i sub-G1 population i C225-NP-behandlede H520 celler sammenlignet med andre behandlinger (figur 4A). Således C225-NP effektivt induceret apoptose på EGFR HCC827 celler, men ikke i EGFR null H520 celler.

(a) Procentdel af NSCLC celler behandlet med forskellige doser (0,6, 1,2 og 2,4 × 10

10-partikler) af IgG-NP eller C225-NP for 72 timer, der var i sub-G

1 fase af cellecyklus. Denne procentdel blev bestemt ved DNA flowcytometrisk analyse. Ubehandlede celler og celler behandlet med C225 antistof alene tjente som kontrol. En dosis-afhængig stigning i antallet af HCC827 celler i subG1 fase blev observeret i begge IgG-NP- og C225-NP behandlinger. Stigningen i antallet af celler i subG1 var signifikant højere i C225-NP behandling end i IgG-NP (

* P 0,05). Der var ingen markant stigning i subG1 fase i H520 celler mellem IgG-NP- og C225-NP-behandlinger. (B) Påvisning af GFP-LC3 prikker indikerer autofagi på NSCLC celler, som ikke er blevet behandlet eller behandlet med C225 antistof, IgG-NP eller C225-NP (3 x 10

9-partikler) i 72 timer på kammer dias.

Scale bar = 50 um

(c) Kvantificering af antallet af celler med GFP-LC3 prikker på ubehandlede og behandlede NSCLC-celler. Antallet af celler med GFP-LC3 prikker var højere i C225-NP-behandlede HCC827 celler sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. I H520 celler var der ingen stigning i antallet af GFP-LC3 prikker når de behandles med C225-NP og sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. De viste resultater er midlet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. * P-værdi. 0,05 vs ubehandlet kontrol C225 antistof og IgG-NP på HCC827 celler

For nylig er det blevet vist, at quantum dots inducerer størrelsesafhængig autofagi i humane mesenchymale stamceller [19]. Vi undersøgte derfor, om autofagi opstod i NSCLC celler efter behandling med C225-NP. Den grønt fluorescerende protein (GFP) tagged ekspressionsvektor LC3 er et nyttigt redskab til detektering autofagi [20]. På fluorescerende mikroskopi viste GFP-LC3-transficerede HCC827 celler diffus fordeling af GFP-LC3 for ubehandlede celler, og celler behandlet med Clone 225 antistof alene og med IgG-NP, hvorimod de celler behandlet med C225-NP viste GFP-LC3 punktformig prikker indikerer autophagic vakuoler (figur 4B). Procentdelen af ​​celler med GFP-LC3 punktformig prikker forøget efter behandling med C225-NP for HCC827 celler (figur 4c, P 0,05). Induktion af autophagy bestemt ved GFP-LC-3 prikker blev også markant forøget i C225-NP-behandlede H1299 celler sammenlignet med andre behandlingsgrupper (fig S3). I modsætning hertil mængden af ​​GFP-LC3 punktformig prikker var ikke forskellig i C225-NP behandlede H520 celler og kontrolgrupper (figur 4b, c).

Vi undersøgte dernæst de celler behandlet med C225-NP for tilstedeværelse og timing af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning og LC3 ekspression, som er molekylære markører indikerer celler, som undergår apoptose og autofagi hhv. PARP-spaltning var tydelig ved 24 timer efter behandling med IgG-NP- og C225-NP af HCC827, men ikke H520 celler; men PARP spaltning var højere med C225-NP end med kontrol-NP i HCC827 celler (figur 5a). Den LC3 proteinet eksisterer i to cellulære former, LC3-I og LC3-II. LC3-I omdannes til LC3-II ved konjugation til phosphatidylethanolamin, og mængden af ​​LC3-II er tæt korreleret med antallet af autophagosomes [21]. I HCC827 celler, behandling med C225-NP stærkt øget mængden af ​​LC3-II på en tidsafhængig måde (figur 5a). Desuden nye oplysninger tyder, at akkumuleringen af ​​LC3-II er mere nøjagtigt repræsenteret i autophagic flux i nærvær af lysosomale inhibitorer [22]. I nærvær af proteaseinhibitorer E-64-D og pepstatin A, endogen LC3-II steg efter behandling med IgG-NP og C225-NP i HCC827 celler (figur 5b). Stigningen i LC3-II var større i celler behandlet med C225-NP end IgG-NP. Stigning i LC3-II i nærvær af proteaseinhibitorer blev også observeret i C225-NP-behandlede H1299 celler (data ikke vist). I modsætning hertil blev mængden af ​​LC3-II ikke steget i H520 celler under 72 timer behandling med C225-NP sammenlignet med behandling med IgG-NP (figur 5a). Disse resultater indikerede, at C225-NP forårsagede både apoptose og autofagi samtidig i EGFR-udtrykte NSCLC-celler. Overraskende autophagy blev også observeret i IgG-NP-behandlede celler omend mindre end den observeret i C225-NP-behandlede celler og havde mindre virkning på tumor- celledrab. Vi hypotesen, at den autofagi tærskel i C225-NP-behandlede celler er stærkere på grund af tilstedeværelsen af ​​anti-EGFR-antistoffer og virker som en død aktivator fører til aktivering af caspasekaskaden og apoptotisk celledød. I modsætning hertil autofagi i IgG-NP-behandlede celler sandsynligvis tjener som en overlevelse signal og beskytter mod celledød. Yderligere forskelle kan eksistere, og vi er i øjeblikket ved at undersøge mekanismen i laboratoriet.

(a) Celleproteiner blev lyseret på det angivne tidspunkt efter behandling med IgG-NP partikler eller C225-NP (0,6 × 10

10-partikler) og udsat for Western blotting. I HCC827 men ikke i H520 celler, øget PARP-spaltning og blev observeret LC3-II efter 48 timer og 72 timer efter behandling med C225-NP og sammenlignet med IgG-NP behandling og ubehandlet kontrol. Intensiteterne af mængden af ​​LC3-II bånd blev semi-kvantificeres ved ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (b) HCC827 celler blev behandlet med IgG-NP eller C225-NP i 68 timer, cellerne blev yderligere dyrket med eller uden proteasehæmmere [10 ug /ml E-64-d og 10 ug /ml pepstatin A (BIOMOL International LP, Plymouth Meeting, PA)] i 4 timer. Cellulære proteiner blev lyseret og immunblottet med anti-LC3 antistof. LC3-II proteinniveauer blev forøget i nærvær af proteaseinhibitorer i alle de grupper, hvilket indikerer forekomst af autofagi. De intensiteter af mængden af ​​LC3-II bånd blev semi-kvantificeret ved ImageJ software (National Institutes of Health).

For at analysere sammenhængen mellem C225-NP og autophagy, vi bestemt lokalisering af C225 NP og autophagic vakuoler, ved hjælp transmissionselektronmikroskopi (TEM). HCC827 celler behandlet med Clone 225 antistof eller IgG-NP udstillet meget få autophagic funktioner, mens mange autophagic vakuoler blev observeret efter behandling med C225-NP (figur 6;

P

0,05). Interessant, mens hovedparten af ​​C225-NP’er blev observeret inde autophagic og tomme vakuoler, nogle NP’er blev også observeret inde kernerne. Svarende til TEM-analyse, konfokal mikroskopi afslørede også nogle NP’er inde kerner i C225-NP-behandlede celler (figur 7). Selv om vi kunne påvise tilstedeværelsen af ​​NP’er i kernen af ​​cellerne vi ikke kvantificere antallet af NP’er stede inde i cellekernen. Dette er på grund af nogle af de begrænsninger, der findes med TEM og konfokal mikroskopi teknikker. For eksempel vil kvantificering af procentdelen af ​​kernelokalisering kræve analyser af flere celler gennem totale cellulære volumen, som er upraktisk at anvende et sådant høj opløsning teknik som TEM. Tredimensionel lokalisering af NP’er med konfokal mikroskopi kompliceres af den kendsgerning, at efter cellulær optagelse NPS ophobes i perinukleære rum. Derfor optisk opløsning er ikke tilstrækkelig til separate NP’er, som er placeret i umiddelbar nærhed af kernemembranen på det cytoplasmatiske og nukleare sider. Desuden kan konfokal mikroskopi fra meget lyse objekter såsom NP’er resultere i en stærk ude af fokus signal, der kan føre til misfortolkning af tredimensionale fordeling af nanopartiklerne. Begrænsningerne for tredimensionale lokalisering af NP’er under anvendelse konfokal optisk mikroskopi er for nylig blevet demonstreret i [23], hvor konfokal mikroskopi groft overvurderet cytosoliske optagelse af quantum dots.

elektronfotomikrografier viser ultrastruktur en celle, herunder kerne (N), af HCC827 celler behandlet med C225-antistof (0,065 ug /ml), IgG-NP, eller C225-NP (0,6 × 10

10 partikler) i 72 timer. (I) Ubehandlede celler (ii) C225 antistof-behandlede celler (iii) IgG-NP-behandlede celler (iv) C225-NP-behandlede celler (v) en forstørrelse af området boxed i (iv). Pilen angiver NP, og pilespidsen viser autophagosomes der omfatter restmateriale og NP i cytoplasmaet (vi) C225-NP opdaget inde i kernen. Pilen angiver NP i kernen.

Scale bar = 1 um.

(Vii) Autophagosomes blev kvantificeret som beskrevet i Materialer og Metoder. * P-værdi. 0,05 vs kontrol, C225 antistof og IgG-NP i 48 og 72 timer

(Top række) Konfokal billeder viser DAPI farvede kerner (blå) og C225-NP (rød ). Pile i “midten” kolonne point til C225-NP lokaliseret i en kerne. Pile i kolonnerne mærket “top” og “bund” punkt til det samme område i xy-planet af kernen, men på steder over og under midten af ​​kernen, hhv. I både “top” og “bund” billeder, pilene ikke længere peger på røde pletter, som angiver, at de røde pletter i “midten” billede er faktisk i kernen. (Nederste række) Cartoon angiver z position hvert billede i kernen, hvor den røde vandrette linje repræsenterer den relative dybde position i kernen, at tværsnitsarealet billeder (øverste række) blev taget på.

Scale bar = 10 um

.

I fremtidige studier, vi har planer om at kvantificere andelen af ​​nationale parlamenter til stede i kernen af ​​tre-dimensionelle røntgen tomografisk billeddannelse af hele celler med tilstrækkelig prøveudtagning størrelse og opløsning [24] og bestemme bidraget fra nukleare NP’er i cellesignalering arrangementer.

C225-NP er specifik for EGFR-udtrykkende tumorceller og forbehandling med C225 antistof ophæver C225-NP-medieret tumor celle drab

Vi brugte mørk-felt reflektans mikroskopi at karakterisere specificiteten af ​​C225-NP-interaktioner og mulighederne for den optiske detektering af lungekræft celler. Dark-field reflektans billeder viste høj koncentration og internalisering af C225-NP i HCC827 celler efter 24 timer behandling (figur 8). I modsætning hertil lidt-til-ingen optagelse blev observeret i HCC827 celler behandlet med IgG-NP. I H520 celler, ingen forskel i NP-binding og optagelse blev observeret mellem celler behandlet med C225-NP og IgG-NP (figur 8).

HCC827 og H520 celler podet på kammerskiver blev behandlet med IgG-NP eller C225- NP (0,2 × 10

10 partikler). Ubehandlede celler fungerede som kontrol. Ved 24 timer efter behandling blev cellerne vasket, fikseret og billeder blev taget under mørkefeltsmikroskopi. Scale bar er 50 mikron. Selektiv binding og optagelse af C225-NP, men ikke IgG-NP blev observeret i HCC827 celler. I H520 celler var der ingen binding og optagelse af C225-NP sammenlignet med IgG-NP.

For at bestemme specificiteten af ​​C225-NP binding og optagelse, blev udført blokerer eksperimenter. HCC827 celler blev forbehandlet med overskud af fri klon 225-antistof før behandling med IgG-NP eller C225-NP. Dark-field reflektans billeder viste, at binding og internalisering af C225-NP specifikt blev blokeret i nærvær af fri klon 225-antistof i sammenligning med celler, der ikke blev forbehandlet med antistoffet (figur 9a). Vi yderligere besluttet, om blokering af EGF-receptoren påvirker C225-NP-induceret cytotoksicitet. Dæmpning af cytotoksicitet medieret af C225-NP blev observeret i nærvær af fri klon 225-antistof, der var ledsaget af markant reduktion i C225-NP-medieret apoptose og autofagi (figur 9b, 9c). Lignende resultater blev også opnået, når H1299 celler blev behandlet med C225-NP i nærvær af klon 225-antistof (figur S4 a-c). Tilsammen disse resultater viste, at C225-NP interagerer selektivt med EGFR-udtrykkende NSCLC celler, og producerer molekylær specifik forøget terapeutisk virkning på EGFR-udtrykkende NSCLC celler.

(a) Den højre søjle viser billeder af HCC827 celler forbehandlet med C225-antistof (2 ug /ml) i 15 minutter før inkubering med enten IgG-NP (midterste række) eller C225-NP (nederste række). Celler, der er vist i venstre kolonne blev ikke behandlet med frie C225 antistoffer. Objektglassene blev vasket, fikseret og filmede med mørkefeltsmikroskopi. Binding og optagelse af C225-NP blev fuldstændigt hæmmet i overværelse af C225 antistof. I IgG-NP-behandlede celler havde C225-antistof ingen effekt. Scale bar er 50 mikron. (B) Hæmning effekt på cytotoksicitet C225-NP ved forbehandling med gratis C225 antistof. Efter behandling med /uden C225-antistof (0,065 ug /ml) i 6 timer, blev cellerne behandlet med enten ikke-konjugeret NP (guld-jern: AuFe), IgG-NP eller C225-NP i yderligere 66 timer. Antallet af levedygtige celler blev talt som beskrevet i Materialer og Metoder. De viste resultater er midlet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. * P-værdi 0,05 vs AuFe alene, C225 antistof alene, IgG-NP eller C225 antistof plus C225-NP. (C) Hæmning virkninger på C225-NP-induceret apoptose og autofagi efter forbehandling med C225 antistof. Cellulære proteiner blev lyseret efter behandling med C225-NP (0,6 × 10

10 partikler) i 66 timer i nærvær eller fravær af fri C225-antistof (0,065 ug /ml). Proteiner blev separeret ved 7,5% eller 15% SDS-PAGE, og immunblottet med anti-PARP og anti-LC3 antistoffer. Den anti-β-actin-antistof blev anvendt som en kontrol for protein lastning og overførsel. De intensiteter af mængden af ​​LC3-II bånd blev kvantificeret ved ImageJ software (National Institutes of Health). C225-NP-medieret aktivering af apoptose og autofagi som angivet ved spaltning af Capase-3, PARP og LC3-II blev markant ophævet under tilstedeværelse af fri C225 antistof. Alle dark-field billeder blev erhvervet ved hjælp af Leica, DM6000 mikroskop udstyret med 20 × dark-field objektiv og Xe-lampe hvidt lys belysning.

Density af 225 antistof bundet til NP er vigtig for 225-NP medieret tumorcelledrab

for at undersøge afhængighed af terapeutiske effekt af NP’er af densiteten af ​​klon 225-antistoffer på NP overflade vi co-konjugeret Klon 225 og ikke-specifik IgG-antistof i forhold på 01:00, 1:01, 1:03, 1:10, 1:40 og 0:01. Den gennemsnitlige totale mængde antistoffer pr NP blev holdt det samme derfor tætheden af ​​klon 225-antistoffer gradvist faldt som den relative mængde af den ikke-specifikke IgG forøget. For eksempel er forholdet 1:00 svarede til de oprindelige C225-NP konjugater, som havde den højeste tæthed af klon 225 antistoffer, mens forholdet 0:01 svarede til NP’er med kun ikke-specifikke IgG-antistoffer. Den relative massefylde af antistoffer på overfladen af ​​NP’er blev bekræftet under anvendelse af et fluorescerende assay (se Materialer og fremgangsmåder).

Behandling med C225-NP’er (01:00 forhold) signifikant (

P

. 1 :1; 01:03; 01:10; 01:40; 00:01) af C225 og IgG co-konjugeret til NP overflade. Celler (HCC827, H1299 og H520) behandlet med NP’er (0,6 × 10

10 partikler) i 72 timer. Antallet af levedygtige celler blev talt som beskrevet i Materialer og Metoder. De viste resultater er midlet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. * P-værdi 0,05 for C225-NP (01:00) vs NP er med 1:01 til 01:40 og 00:01 NP på HCC827 og H1299 celler. H520 celler viste ingen hæmmende effekt, når de behandles med NP er forskellige nøgletal. (B) Antallet af GFP-LC3 prikker induceret af C225-NP (01:00) -Behandling på HCC827 og H1299 celler faldt med ændringer i C225:IgG antistof-forholdet. De viste resultater er midlet ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg. * P-værdi 0,05 for C225-NP (01:00) vs 1:01 til 01:40 og 00:01 NP på HCC827 og H1299 celler. (C) C225-NP (01:00) -medieret reduktion i det phosphorylerede EGFR og P44 /42MAPK udtryk blev ophævet i HCC827 og H1299 celler, når de behandles med NP s af 1:01 og 1:40 ratio.

Disse resultater viser, at NPS produceret den største terapeutiske virkning, når de blev overtrukket kun med C225-antistoffet. Udskiftning af antallet af C225-antistof med ikke-specifik kontrol antistof på overfladen af ​​NP resulterede i reduceret anticanceraktivitet. Desuden er denne undersøgelse viser også specificiteten af ​​225-NP-medieret tumor celle drab.

Som konklusion, vi viste, at EGFR-målrettet C225-nationale parlamenter selektivt optages af EGFR-udtrykkende NSCLC celler og produceret forbedret antitumor aktivitet ved at inducere både apoptose og autofagi. Den forbedrede tumor celledræbende aktivitet produceret af C225-NP tilskrives unikke egenskaber, frembragt ved konjugering af klon 225 antistof med AuFe NP. Så vidt vi ved har vi vist for første gang, at konjugation af plasmoniske nanomaterialer med biologiske såsom Clone 225 resultater i synergistiske antitumor egenskaber ledsaget af induktion af autophagy og apoptose. Denne forskning åbner et nyt paradigme i udviklingen af ​​terapeutiske midler, der er rettet mod evnen til at styre nanoskala arrangement af multiple Ab’er på partikeloverfladen til forbedret målretning og terapi.

Nylige prækliniske undersøgelser viste, at kombinere EGFR-målrettet af tre uafhængige forsøg. Scale bar er 50 mikron. af tre uafhængige forsøg.