PLoS ONE: Holoclone Forming Celler fra bugspytkirtelkræftceller berige tumorfremkaldende celler og repræsenterer et Novel Model for Undersøgelse af Cancer Stamceller

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de direkte årsager til kræft-relaterede dødsfald. Højt kemoresistens er en af ​​de største hindringer for klinisk behandling. I de senere år har cancerstamceller blevet bredt identificeret og angivet som oprindelse kemoresistens i multi-typer faste tumorer. Stigende beviser tyder på, at kræft stamceller bor i cellerne kan danne holoclones kontinuerligt. Men i pancreascancer, holoclone-dannende celler er ikke blevet endnu karakteriseret. Derfor er målet med vores nuværende undersøgelse var at identificere de holoclone-dannende bugspytkirtlen cancer stamceller og udvikle en in vitro kontinuerlig kolonidannelse system, som i høj grad vil lette undersøgelsen af ​​kræft i bugspytkirtlen stamceller.

Metode /Principal resultaterne

kræft i bugspytkirtlen cellelinie BxPC3 blev forelagt til monoklonale dyrkning for at generere kolonier. Baseret på de morfologier blev kolonier klassificeres og analyseret for deres kapacitet sekundær kolonidannelse, langsigtet overlevelse i

n vitro

, tumordannelse

in vivo

, og resistens. Flowcytometri og kvantitativ RT-PCR blev udført for at detektere ekspressionsniveauet af cancer stamceller forbundet celleoverflademarkører, regulatoriske gener og microRNA i forskellige typer af kolonier. Tre typer af kolonier med distinkte morfologier blev identificeret og betegnes som hologram, mero- og paraclones, hvor kun holoclones genereret efterkommere kolonier af alle tre typer i yderligere passager. Sammenlignet med mero- og paraclones, holoclones besad højere kapacitet for langsigtet overlevelse, tumor initiering, og kemoresistens. Den præferentielle udtryk for cancer stamceller relateret markør (CXCR4), regulatoriske gener (BMI1, GLI1, og GLI2) og microRNA’er (MIR-214, MIR-21, mir-221, miR-222 og miR-155) i holoclones var også fremhævet.

konklusioner /Signifikans

Vores resultater indikerer, at pancreas-tumor-initierende celler med højt kemoresistens blev beriget i holoclones afledt af BxPC3 cellelinie. Generation af holoclones kan tjene som en ny model til at studere cancer stamceller, og tilskriver udvikle nye kræftlægemidler

Citation:. Tan L, Sui X, Deng H, Ding M (2011) Holoclone dannende celler fra bugspytkirtelkræftceller Berig tumorfremkaldende celler og udgør en Novel Model for Undersøgelse af cancer stamceller. PLoS ONE 6 (8): e23383. doi: 10,1371 /journal.pone.0023383

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: Marts 20, 2011; Accepteret: 15 Juli 2011; Udgivet: 3 August, 2011

Copyright: © 2011 Tan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en Undervisningsministeriets tilskud (705.001) (https://www.moe.edu.cn/), National Natural Science Foundation of China for Creative Forskningsgrupper (30.421.004) (https://www.nsfc.gov. cn), og 111 Projekt til HD. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft er i øjeblikket den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald. Mindre end 5% af patienterne overlever i 5 år efter diagnosen med median overlevelse periode på 4 til 6 måneder [1], [2]. Selvom kirurgisk resektion betragtes som den mest effektive metode til terapi, dens gennemførlighed fortsat lav på grund af lokal avancement og tidlig metastaser [3]. Desuden er kemoterapi betragtes som en vigtig mulighed i klinisk terapi, men det normalt producerer dårlige effekter [4], [5] .Derfor, er det nødvendigt at dechifrere mekanismerne bag det høje niveau kemoresistens af bugspytkirtelkræftceller.

i de senere år cancer stamceller (eller betegnes som tumorfremkaldende celler) er blevet identificeret som en integreret del i multi typer af faste tumorer [6] – [11]. Cancerstamceller ikke blot resultere i tumor initiering og vækst, men også fungere som oprindelsen af ​​cancer metastase, tilbagefald og resistens mod kemo- eller stråleterapi [12] – [14]. Derfor er det videre arbejde med opdagelse og fjernelse af kræft i bugspytkirtlen stamceller stadig ønskede at kunne erobre de hindringer i klinisk terapi.

Nylige undersøgelser på voksne og cancer stamceller har korreleret stamceller egenskaber med morfologi kolonier genereret fra enkelte celler [15] – [20]. Ifølge kriterierne for koloni størrelse og borderline defineret af banebrydende værker i keratinocyt cellelinier blev kolonierne klassificeret og betegnes som holoclones, meroclones og paraclones [21]. Lignende at stamceller i hårsækkene [15], okulær [16], og epidermal [17], cancer stamceller prostata [19] og gliom [20] blev påvist at opholde sig i holoclones. Holoclones afledt fra prostatacancer-cellelinie PC3 indledt tumordannelse i NOD /SCID-mus udelukkende og prolifererede in vitro håndfast [19]. Celler i holoclones afledt af gliom-cellelinje U251 kunne generere tumor sfærer i serumfrit tilstand og differentiere til slægter af neuroner, astrocytter og oligodendrocytter [20]. Interessant nok blev stamcellerelateret gener stærkt udtrykt i holoclones afledt af både prostatakræft og gliomcellelinier [19], [20]. Disse spor foreslog, at udbredelsen af ​​holoclones fra kræft cellelinjer kunne tjene som en alternativ strategi for berigelse af cancer stamceller [20]. Men i bugspytkirtelkræft, holoclones er ikke blevet identificeret, og dens sammenhæng med egenskaber af cancer stamceller er ikke blevet bestemt endnu.

I den foreliggende undersøgelse, vi rettet heterogeniteten i bugspytkirtelkræft cellelinier BxPC3 [22] og PC3 [23] baseret på morfologi kolonier afledt fra enkelte kræftceller og viste, at cancer stamceller egenskaber blev beriget i holoclones udelukkende. Desuden er vores arbejde indikerede holoclone dannende celler tillægge kemoresistens, som udtryk for sin potentielle værdi for at udvikle kemoterapeutiske stoffer.

Resultater

bugspytkirtelkræftceller udviser heterogen kapacitet til at generere forskellige koloni morfologier i klonal kultur

det første mål for vores undersøgelse var at bestemme, om de forskellige klonale morfologier findes i bugspytkirtelkræft cellepopulation, så monoklonalt dyrkningen udførtes (fig. 1A) med pankreatisk cancercellelinie BxPC3. Denne cellelinie blev afledt fra primære loci af pancreas adenocarcinom og med typiske epitel-morfologi. Efter belagte, en portion af celler døde, mens de andre blev holdt levedygtige og dannede kolonier inden for 3 dage efter udpladning og viste en spektrum af skelnelige morfologier efter 5-7 dage. Baseret på forskelle i morfologi blev kolonier defineret som holoclones, meroclones og paraclones (Fig. 1B, C, D) [21]. Holoclones var klynger af homogene, små og tætpakkede celler med regelmæssige og glatte koloni grænser (fig. 1B). Paraclones bestod af dispergerede og større celler med fragmenterede grænser (fig. 1d). Meroclones udstillet mellemliggende morfologier (Fig. 1C). Disse mophologies blev opretholdt, hvis størrelsen af ​​kolonier steg. Med parallelle assays udført med PC3 cellelinie blev tre typer af kolonier identificeret (fig. S1A, B, C) med de morfologier svarende til dem afledt af BxPC3 cellelinie. Kolonien sammensætning var den samme i disse to cellelinjer: næsten halvdelen af ​​kolonierne var meroclones, hvorimod holoclones og paraclones udgjorde ca. 20-30% af de dannede kolonier (Fig 1E, fig S1D..). Derfor er disse data viste mangfoldigheden af ​​klonale morfologier i bugspytkirtelkræft cellepopulation.

(A) Skematisk afbilder proceduren til udledning BxPC3 celle klonale kulturer og funktionelle assays. Lavere paneler viser repræsentative holoclones (B), meroclones (C) og paraclones (D) fra BxPC3 kulturer. Alle fotografierne blev taget efter 2 uger efter udpladning (Bar, 100 mikron). På dette tidspunkt blev hver type kolonier tælles (E). Resultaterne fra gentagne forsøg (n = 4) er præsenteret som middelværdi ± sem i histogram.

Forskellige typer af kolonier besidder differentierede kapacitet til selv-fornyelse og langsigtet spredning

da den klonale morfologiske diversitet i bugspytkirtelkræftceller var blevet angivet, bør den sekundære kolonidannelse kapacitet vurderes. Til dette formål blev celler fra alle tre typer af kolonier isoleret og genudpladet med lav densitet (mindre end 200 celler pr brønd af 6-brønds plade) i flere passager. Ved første passage, de holoclones genereret tilsvarende fordeling af sekundære holoclones og meroclones (næsten 50% hver), med begrænset antal (mindre end 10%) af paraclones (fig. 2A, fig. S2A). I parallelle analyser, celler isoleret fra meroclones produceret en sjælden antal sekundære holoclones men en langt højere procentdel af paraclones (Fig. 2C, fig. S2C). sjældne celler af paraclones blev imidlertid holdt levedygtigt efter re-plating og genererede kun sekundære paraclones ved lav frekvens (data ikke vist). At følge den udviklingsmæssige skæbne kolonier, blev typiske kolonier af forskellig type, udvalgt til langsigtet kultur. Celler i udvalgte kolonier blev passeret rutinemæssigt ved klontæthed under almindelig tilstand. For kolonier afledt BxPC3 cellelinje, alle 12 holoclones var levedygtige og bredte sig håndfast, mens 12 af 18 meroclones og 13 af 15 paraclones gradvist blev afbrudt (fig. 3) under parallel kultur af 140 dage. Ligeledes i løbet af 60 dages passage af kolonier afledt af PC3 cellelinie, 8 af 9 holoclones var i robust ekspansion, mens 4 af 8 meroclones og 6 af 8 paraclones faldt i kort periode (fig. S3). Interessant, kun celler, der stammer fra holoclones regenereret hele spektret af oberst morfologiske fænotyper og restaureret proportioner af hver type af kolonier (fig. 2B, Fig. S2B) svarende til de observerede i usorterede forældre cellelinjer under lav tæthed kultur proportioner. Baseret på den særskilte udseende udstillet ovenfor kapacitet langsigtede selvfornyelse

in vitro

primært bosat i holoclones, men ikke meroclones eller paraclones.

Celler isoleret fra enkelte kolonier blev udsået på lav densitet under almindelig tilstand. (A) Ved den indledende passage, holoclones (n = 8), hovedsagelig produceret lignende frekvenser af efterkommer holoclones og meroclones, hvorimod meget lavere procentdele af paraclones blev genereret. (B) Efter passager af endnu en måned, holoclones (n = 8) genererede hele spektret af afkom-kolonier ved frekvenser svarende til dem, tilbageholdes i usorterede parentale cellelinjer. (C) Meroclones (n = 8), hovedsagelig producerede paraclones og meroclones og få holoclones blev genereret.

Holoclones (n = 12, rød linje), meroclones (n = 18, grøn linje) og paraclones (n = 15, blå linje) blev dyrket i almindelig tilstand i 20 uger, og levetiden af ​​hver koloni blev registreret. De fleste af de meroclones og paraclones blev afbrudt gradvist, mens alle de holoclones forblev levedygtige (p 0,01).

Holoclones, men ikke meroclones eller paraclones, initiere tumor dannelse og support tumor seriel transplantation i NOD /SCID-mus

for robusthed holoclones var blevet vist

in vitro

, var det vigtigt at evaluere

in vivo

tumorgenecity af tre typer af kolonier. For at estimere tumordannelse kapacitet af hver type koloni blev serietransplantation assays udført. For det første usorterede BxPC3 celler indledt tumordannelse på en dosisafhængig måde. 100% af mus injiceret med 10

6 eller 10

5 BxPC3 celler udviklede xenotransplantattumorer efter 14 dage, og mus injiceret med 10

4 eller 10

3-celler også udviklede xenotransplantattumorer efter 21 dage med 100% effektivitet (tabel 1). Derefter blev tre holoclones, tre meroclones og to paraclones plukket ud til transplantation. 10

4 holoclone celler dannede tydelige tumorer i 100% af musene (15 af 15 mus) inden for 18 dage. Tværtimod blev ingen synlige tumorer dannet af celler fra mero- eller paraclones (0 af 36 mus, 10

4~10

5 celler pr mus) inden for 2 måneder (tabel 1). I et yderligere skridt, celler i xenotransplantattumorer afledt holoclones blev derefter renset og re-transplanteres til NOD /SCID-mus (10

4 celler pr mus). Inden 18 dage, alle modtagende mus (18 af 18 mus) udviklede tydelige tumorer (tabel 1). Serietransplantation assays blev ligeledes udført på PC3 cellelinie. Usorteret parental cellelinje, 3 holoclones, 2 meroclones og 2 paraclones var ansat. Alle holoclones afledt af PC3 cellelinje var i stand til at udvikle tumor udelukkende korte latenstid (tabel S3)

Exnograft tumorer afledt af usorteret BxPC3 cellelinje og tilsvarende holoclones blev analyseret med H . E farvning. De histologiske karakteristika xenograft tumor speciments blev visualiseret og viste højt niveau af lighed mellem tumorprøver fra usorteret cellelinie (fig. S4A, B) og tilsvarende holoclones (fig. S4C, D).

Med den signifikante forskel tumor kapacitet dannelse blandt distict typer af kolonier, blev det foreslået, at svulsten-initiering kapacitet

in vivo

blev beriget i holoclones snarere end meroclones eller paraclones.

Kræft stamceller relateret overflademarkører, gener og microRNA udtrykkes forskelligt i forskellige typer af kolonier

Baseret på egenskaberne af holoclones

in vitro

in vivo

, var det nødvendigt at analyse udtryk for celle -langlinefartøjer markører og regulatorer er forbundet med cancer stamceller i tre typer af kolonier. Derfor blev flow-cytometri og kvantitativ RT-PCR anvendes samtidig. Flow-cytometrisk analyser viste, at CD133 var negativ (fig. 4A) og CD44 var positiv (fig. 4C) i holoclones, meroclones og paraclones. Alle typer af kolonier indeholdt både CXCR4

+ og CXCR4

– celler, men de procenter af CXCR4

+ -celler var meget højere i holoclones end i meroclones og paraclones (Fig 4B.). CD24 intensitet (fig. 4D, fig. S5) var signifikant stærkere i paraclones end i holoclones. Lignende resultater blev opnået med kvantitativ RT-PCR.

CD133

var ikke påviselig og

CD44

viste mindre end 1,3 gange af opregulering i holoclones end i paraclones (fig. 4E). Men udtryk for

CD24

i holoclones blev nedreguleret til over 5 gange end i paraclones (fig. 4F). Expression niveau af

CXCR4

var omkring 3 gange højere i holoclones end i paraclones (fig. 4G). Desuden Angivelse af

BMI-1

,

GLI1

,

GLI2

,

GLI3

og en liste over kræftrelaterede microRNA’er blev også kvantificeret.

BMI-1

,

GLI1

GLI2

var opreguleret i holoclones snarere end i paraclones, mens ekspressionsniveauet af

GLI3

ikke var signifikant ændret mellem tre typer af kolonier (fig. 5A). MikroRNA’er var viste differentielt udtrykte og grupperet i to grupper: Den ene gruppe var opreguleret i holoclones, herunder

miR-214

,

miR-21

,

miR-221

,

miR-222

, og

miR-155 Hotel (fig 5B.); den anden gruppe blev nedreguleret i holoclones, herunder

Lad-7a

miR-30c

,

miR-30b

,

miR-30a

(fig. 5C). Den differentielle ekspression af markører og myndigheder antyder også tendens til, at stamceller egenskaber blev besat af holoclones snarere end andre to typer af kolonier.

Celler isoleret fra holoclones, meroclones og paraclones blev undersøgt med flowcytometri for celleoverflademarkører cancerstamceller. CD133 (A) var fuldstændig negative i alle tre typer af kolonier. Den CXCR4

+ celler (B) var påviselige i alle typer af kolonier, men betydeligt beriget i holoclones. CD44 (C) var stærkt positiv og med lille forskel blandt forskellige typer af kolonier, mens CD24 (D) blev udtrykt på et højere niveau i paraclones end i holoclones. mRNA niveau af

CD44

(E),

CD24

(F) og

CXCR4

(G) i hologram, mero- og paraclones blev også kvantificeret med real- time PCR (

GAPDH

som intern reference) og lignende tendenser blev viste (*, p 0,05).

BMI1

,

GLI1

og

GLI2

var opreguleret i holoclones, mens ekspressionen af ​​

GLI3

viste ingen signifikant ændring blandt forskellige typer af kolonier (A). De microRNA blev grupperet i to grupper, som blev forhøjet (B) og undertrykt (C) i holoclones hhv. Alle udtryk værdier i forskellige former for kolonier blev normaliseret mod dem i paraclones (*, p 0,05).

Holoclones udviser meget højere kemoresistens end meroclones og paraclones

Det er velkendt, at kemoresistens er en af ​​de vigtigste egenskaber af cancer stamceller, så her vi bad om holocoloes besidde denne evne. Derfor cellerne isoleret fra disse tre typer af kolonier og behandlet med gemcitabin og 5-FU under stigende koncentration. Blandt hele koncentrationsinterval testet, overlevelsesprocenten af ​​celler, der stammer fra holoclones var væsentligt højere end dem fra meroclones og paraclones (fig. 6A, B). IC

50 værdi af 5-FU var 2,59 × 10

3 nM i holoclones, som var meget højere end for meroclones (1,24 × 10

2 nM) og paraclones (15.10 Nm). At analysere genekspression ændring induceret af lægemiddelbehandling blev kvantitativ RT-PCR udført med cellen behandlet med lægemidler. Efter behandling med 50 nM af 5-FU i 12 timer, udtryk for narkotika-indtagelse transportører (

SLC28A1

,

SLC28A2

,

SLC28A3

,

SLC29A1

,

SLC29A2

,

SLC29A3

) var alle opreguleret i paraclones uden effekt i holoclones meste (kun

SLC28A1

blev nedreguleret ca. 2 gange) (fig. 6C) .Med den parallelle behandling af gemcitabin, blev påvist lignende respons af disse gener (fig. 6C). Tilsammen

SLC28A1 /A2

SLC29A1 /A3

var almindeligt opreguleret mere dramatisk i paraclones end i holoclones efter behandlinger af gemcitabin eller 5-FU. Denne forskel svar kunne være, i det mindste delvis, invovled i variationen af ​​kemoresistens mellem tre typer af kolonier

Celler isoleret fra holoclones, meroclones og paraclones blev behandlet med kemoterapeutiske lægemidler med stigende koncentration:. 1, 5, 10 , 50, 100 nM af gemcitabin (A) eller 5, 10, 50, 100, 500 nM af 5-FU (B). For hver koncentration værdi blev tre brønde sat som gentagelse i et enkelt forsøg og tre gange for repræsentative forsøg blev udført. Udtrykket ændringer i kemo-drug indtagelse transportører blev kvantificeret i holoclones og paraclones henholdsvis efter behandlet med 50 nM kemo-drug i 12 timer. (C) (*, p 0,05).

Diskussion

I nærværende undersøgelse, vi demonstreret stamcelle egenskaber holoclones og anførte, at et panel af stamceller associerede gener og microRNA blev fortrinsvis udtrykt i holoclones. Desuden afslørede vi et højt niveau kemoresistens i holoclones og foreslog den potentielle værdi af holoclones i studiet af cancer stamceller.

Vi er de første til at vise heterogenitet i clonoal morfologier af bugspytkirtelkræftceller. Svarende til opførslen af ​​keratinocyt [21] og flere cancercellelinier [18] – [20], når celler af BxPC3 og PC3-cellelinje blev udpladet monoklonalt blev en serie af kolonier med forskellige morfologier udviklet (Fig 1A.). Baseret på den morfologiske diversitet, holoclones (fig. 1B, fig. S1A), meroclones (fig. 1C, fig. S1B) og parclones (fig. 1D, fig. S1c) kan let identificeres.

Endvidere , vores resultater viste, at stamceller-lignende cancerceller blev beriget i holoclones stedet mero- eller paraclones. Under

in vitro

formering, celler i holoclones genereret en høj procentdel af afkom holoclones ved den første runde af passage (fig. 2A, fig. S2A). Efter flere passager, celler i holoclones genereret kolonier med full-range af morfologiske egenskaber svarende til den, der er afledt af usorterede forældrenes cellelinjer (fig. 2B, fig. S2B). Men meroclones generere et begrænset niveau af holoclones og meget højere procentdele af paraclones (Fig. 2C, fig. S2C). Under langtidsbehandling af passager

in vitro

viste holoclones mere robusthed og konstant spredning, mens mero- og paraclones faldt hurtigt (fig. 3, fig. S3). Med de forskelle, der er vist ovenfor, forskellige former for kolonier besad forskellen kapacitet af selv-fornyelse og spredning kapacitet. Vigtigere, holoclones serielt indledt tumorudvikling

in vivo

mens mero- og paraclones gjorde ikke (tabel 1, tabel S3), der betragtes som den udbredte gyldne standard til identifikation af cancer stamceller. Som et uundværligt supplement, de xenotransplantattumorer afledt BxPC3 holoclones viste lignende histologiske karakteristika med dem tumorvæv stammer fra usorteret BxPC3 cellelinje (fig. S4). I prostatakræft-cellelinier PC3 [19] og DU145 [24], tilsvarende karakteristika for holoclones

in vitro

in vivo

var blevet angivet, og tjente som beviser til støtte for stamcelle egenskab holoclones.

desuden udtryk for celleoverflademarkører, gener og microRNA blandt forskellige typer af kolonier også foreslog stamcelle egenskab holoclones. For det første celleoverflademarkørerne af pancreascancer stamceller, CD44, CD24, og CD133, blev evalueret. Baseret på to uafhængige rapporter, blev bugspytkirtelkræft stamceller identificeret som befolkning CD44

+ CD24

+ ESA

+ eller CD133

+ viste dog disse to populationer lille overlap med hinanden [10 ], [11]. Ifølge resultaterne af flowcytometri (fig. 4A, C) og kvantitativ RT-PCR (fig. 4E) assays, ekspression af

CD133

(ikke-detekterbar) og

CD44

(stærkt udtrykt) var både undistinguishable blandt tre typer af kolonier. Ekspressionen af ​​

CD24

blev nedreguleret i holoclones end i paraclones (fig. 4F, fig. S5), som er potentielt varierede fra tidligere rapport [10]. Svarende til den uventede udtryk status

CD133

[11], [25] og

CD24

[10] i pancreas cellelinier BxPC3 og PC3, divergerende udtryk for

CD133

i en bestemt cellelinje blev også rapporteret i æggestokkene kræftcellelinjer OVCAR3 og SKOV3 [26] – [28], som måske i det mindste delvis på grund af nogle ubestemte forandringer som følge under langvarig dyrkning

in vitro

. Desuden har CD133- cancer stamceller blevet identificeret i gliom og foreslået som mere oprindelige drevet kraft tumor udvikling end CD133 + celle populationen [29]. For yderligere vurdering af stamcelle egenskaber holoclones blev en række gener og mciroRNAs forbundet med kræft stamceller kvantificeret. Blandt generne opreguleret i holoclones,

BMI1

(fig. 5A) har vist sig at spille central regulerende rolle i selv-fornyelse af neurale [30], brystkirtler [31], hæmatopoietisk [32] stamceller og multi typer kræft stamceller [31], [33], [34]. Hvad mere er,

BMI1

promotor er blevet udnyttet til at drive EGFP som en intracellulær markør til at berige bloddannende stamceller [35]. Svarende til vores resultater,

BMI1

havde været for nylig rapporteret fortrinsvis udtrykt i holoclones afledt af gliom-cellelinje [20]. Højden af ​​

GLI1

GLI2

i holoclones (fig. 5A) antyder højere aktivitet af Hedgehog signalering, hvilket var i overensstemmelse med det højere

SHH

udtryk i CD44

+ CD24

+ ESA

+ cancer stamceller isoleret fra humane primære bugspytkirtelkræft prøver [20]. The Hedgehog signalvej spiller også en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​kræft stamceller i brystkirtler [31] og hjerne [36].

CXCR4

, den centrale formidler af metastaser, var opreguleret i holoclones (fig. 4B, G) også. I CD133

+ bugspytkirtelkræft stamceller, CXCR4

+ delpopulation er mere indgribende end autolog CXCR4

– delpopulation [11]. Blandt microRNA opreguleret i holoclones,

miR-214

,

miR-221

,

miR-222

og

miR-155 Hotel (fig. 5B) var almindeligt overudtrykt i brystkræft stamceller [37]. Men

Lad-7a

(fig. 5C), hvilket var signifikant nedreguleret i holoclones, spiller en negativ rolle i selv-revewal, tumorgenicitet, og kemoresistens af brystkræft stamceller [12]. Tilsvarende blev MIR-30a /b /c (fig. 5C) overudtrykkes også i paraclones. I brystkræft, denne microRNA familie hæmmer selv forny af stamceller, inducerer apoptose, og reducerer metastaser til lungerne [38].

Højere kemoresistens blev angivet i holoclones snarere end i meroclones og paraclones (Fig . 6A, B), hvilket er i overensstemmelse med den støttende rolle af cancer stamceller i kemoresistens tidligere rapporteret [11], [13]. I overensstemmelse med den robuste kemoresistens i holoclones, gener og microRNA at opretholde kemoresistens, herunder

BMI1

[39],

GLI1 /2

[40],

CXCR4

[41 ],

miR-214

[42],

miR-21

[43], og

mir-155

[44] (fig. 4G, fig. 5A, B) blev opreguleret i holoclones. Som reaktion på lægemiddelbehandlinger, ekspressionen af ​​lægemiddel-indtagelse transportører, hvoraf det højere ekspressionsniveau blev korreleret med en forøget overlevelse for patienter [45] – [48], blev induceret i paraclones fortrinsvis (Fig 6C.). Det betyder, at lægemidlet i-take øges hurtigere i paraclones end i holoclones. Dette kunne være en af ​​de potentielle oprindelse fortrinsret overlevelse for kræft stamceller versus ikke-stamceller kræftceller i kemoterapi.

Tilsammen kan de kolonier med distinkte morfologier og i forskellige stadier af differentiering tjene som en potentiel model til analyse af cancer stamceller (fig. 7). Med denne model kan gener og microRNA potentielt korrelerede med cancer stamceller identificeres. Endnu vigtigere er, kan parallel evaluering af chemotheraputic lægemidler udføres på cancer stamceller og autologe ikke-stamceller cancerceller. Det betyder, at klonale morfologier baseret cancer stamceller model vil være nyttigt at føre til den nyere forståelse af kemoresistens, som bør være helt forskellige fra dem, der opnås fra heterogene cancer cellepopulationer, og vil være nyttigt at overvinde kemoresistens i cancerterapi.

De bugspytkirtelkræft stamceller og deres afkom i differentiering kan udvikle sig til enkelte kolonier med forskellige morfologier. Baseret på in vivo og in vitro egenskaber, Holoclones svarer til de cancer stamceller /progenitorceller, mens paraclones svarer til de fuldstændigt differentierede celler og meroclones svarer til cellerne i den mellemliggende fase. Generne og microRNA, der forbinder med cancer stamceller og støtte kemoresistens, herunder

BMI1

,

GLI1 /2

,

CXCR4

,

mir-21/214 /221/222/155

, er beriget med holoclones. Men den

Lad-7

og

mir-30a /b /c

er beriget i paraclones.

Materialer og metoder

Cell linjer

Menneskelig pancreas adenocarcinom cellelinie BxPC3 (købt fra Cell Bank of China Academy of Sciences, Shanghai, Kina) og PC3 blev (købt fra Kina Union Medical Collage, Beijing, Kina) dyrkes i RPMI-1640 (Hyclone ) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hyclone) og passeret som 1:10 med 0,25% trypsin /EDTA (Hyclone). Disse cellelinje blev etableret fra primære pancreas duktalt adenokarcinom og med typiske epitel morfologi [22], [23]. BxPC3 [22] var afledt af europæisk afstamning og PC3 [23] blev afledt fra kinesisk.

Kemiske stoffer

Lyofiliseret pulver af gemcitabin (Lilly) blev opløst i Calsium /Magnesium fri PBS (Hyclone ) og opbevaret ved -20 ° C med koncentration på 4 mg /ml. 5-FU-opløsning (Roche) blev opbevaret ved -20 ° C med koncentration på 25 mg /ml. Før brug blev lagrene fortyndet til arbejder koncentrationer (5, 10, 50, 100, og 500 nM for 5-FU, og 1, 5, 10, 50, og 100 nM for gemcitabin) med dyrkningsmedium.

Dyr

Alle forsøg blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Peking University (autorisationsnummer var IRB00001052-09051). NOD /SCID-mus blev købt fra Experimental Animal Sciences Center i Peking University og vedligeholdes i standard tilstand i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.

Enkelt celle kloning

Celler blev høstet ved 70% -80% af sammenløb med Accumax (Chemicon) og resuspenderet i medium uden serum. Enkelt celle blev podet i hver brønd i 96-brønds plader med MoFlo flowcytometri (DakoCytomation). To dage efter udpladning blev plader med 96 brønde kontrolleres med mikroskopi. Brønde indeholdende kun én levedygtige celler blev markeret. Og derefter blev mediet opfrisket hver 3. dag. Kolonier blev klassificeret som hologram, mero- og paraclones efter deres morfologier. 14 dage efter flow-cytometrisk sortering blev typiske kolonier udvalgt til yderligere forsøg.

Tumor celle implantation

Udvalgte kolonier blev udvidet og høstet med Accumax (Chemicon), tælles og resuspenderes i 01:01 blanding af RPMI-1640 og Matrigel (BD). Alikvoter af cellesuspensionen blev injiceret subkutant i dorsolaterale del af NOD /SCID-mus. Tumor latenstid (dvs. tid fra injektion til detektering af tydelige tumorer) blev bestemt. Inden for 9 uger efter implantation, blev tumorbærende mus aflivet. I mellemtiden blev xenotransplantattumorer dissekeret ud kirurgisk og vejet. Mus med ingen tegn på tumor byrde blev holdt i mindst 9 uger siden implantation og derefter undersøgt på obduktionen at bekræfte, at de var tumor-fri.

For seriel transplantation blev xenotransplantattumorer hakket i små stykker med en saks, suspenderet i M199-medium, og fordøjet ved 37 ° C i ca. 3 timer med 200units /ml ulturapure collagenas IV (Worthington Biochemicals). Yderligere mekanisk fordøjelse blev udført med en 25-ml pipette hver 15 minutter. Efter fordøjelse blev cellesuspensionen filtreret gennem en 40-um nylonnet og forsigtigt påført på det øverste lag af Histopaque-1077 gradient (Sigma-Aldrich) (1~3 × 10

6 celler /ml Histopaque anvendes i samlet volumen på 3 ml) og derefter centrifugeret ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Levedygtige kerneholdige celler blev opsamlet ved grænsefladen, mens de røde blodlegemer, døde celler og rester blev elimineret. Den høstede enkelt-cellesuspension blev anvendt til transplantation som beskrevet ovenfor.

kemoresistent assay

Celler fra den samme type kolonier blev høstet, poolet sammen og podet i 96-brønds plader med densitet på 5000 celler /brønd. 24 timer senere blev mediet opfrisket og narkotika (gemcitabin eller 5-FU) blev tilsat.