PLoS ONE: Plasma Proteome Profiler associeret med inflammation, angiogenese, og kræft

Abstrakt

Tumor udvikling er ledsaget af en kompleks vært systemisk reaktion, der omfatter inflammatoriske og angiogene reaktioner. Begge tumorafledte og systemisk respons proteiner påvist i plasma fra cancerpatienter. Men i betragtning af deres ikke-specifikke karakter, kan systemiske respons proteiner forvirre påvisning eller diagnose af neoplasi. Her har vi anvendt en dybtgående kvantitativ proteom tilgang til at analysere plasma protein ændringer i musemodeller af subakut lokalirriterende-drevet inflammation, autoreaktive inflammation og matrix associeret angiogenese og sammenlignet resultater til tidligere beskrevne fund fra musemodeller af polyoma middle T-drevet brystkræft og Pdx1-Cre Kras

G12D INK4a /Arf

lox /lox-induceret kræft i bugspytkirtlen. Blandt de forstyrrende modeller, ca. 1/3 af alle kvantificerede plasmaproteiner udviste en signifikant ændring i overflod sammenlignet med kontrolmus. Af de proteiner, der ændrede i overflod, de fleste var unik for hver model. Ændrede proteiner indgår de involverede i akut fase reaktion, inflammation, ekstracellulær matrix remodellering, angiogenese, og TGF-signalering. Sammenligning af ændringer i plasmaproteiner mellem confounder modeller og de to kræftmodeller afslørede proteiner, der var begrænset til kræft-bærende mus, hvilket afspejler den kendte biologi af disse tumorer. Denne fremgangsmåde giver et grundlag for at skelne mellem protein ændringer i plasma, der er kræft-relaterede og dem, der er en del af en ikke-specifik host reaktion

Henvisning:. Kelly-Spratt KS, Pitteri SJ, Gurley KE, Liggitt D, Chin A, Kennedy, J., et al. (2011) Plasma Proteome Profiler associeret med inflammation, angiogenese, og Cancer. PLoS ONE 6 (5): e19721. doi: 10,1371 /journal.pone.0019721

Redaktør: Pierre Bobé, Institut Jacques Monod, Frankrig

Modtaget: 11. december 2010; Accepteret: 14. april, 2011; Udgivet: 12. maj 2011

Copyright: © 2011 Kelly-Spratt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af The Paul G. Allen Family Foundation, de NCI musemodeller af menneskelig Cancer Consortium (MMHCC) program og de Kanariske Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den effektive behandling af kræft er afhængig af en præcis diagnose på det tidligste stadium af sygdommen og prognosen forbedres betydeligt, hvis kræften opdages tidligt [1]. Blod-baserede tests til tidlig påvisning af kræft er ideelle, da blod trækker er billige, minimalt invasiv, og rutine i klinisk praksis. Mens begrebet en blod-baserede cancer test er enkel, har dens anvendelse været en udfordring, til det punkt, at meget få nye kræft biomarkører er FDA godkendt i de senere år [2]. Desuden de for tiden i brug, såsom CA125 og PSA for æggestokkene og prostatakræft henholdsvis væsentligt begrænset af høje falsk positive satser og over-diagnose [3], [4]. En stor forhindring for udviklingen af ​​hidtil ukendte blod baserede biomarkører har været den tekniske udfordring spørgekriterierne plasmaet proteom [5]. En anden hindring har været valg af sag /kontrol sammenligninger i biomarkør opdagelse [6]. Niveauer af kandidat biomarkører fra kræftpatienter ofte sammenlignet med raske individer. I disse undersøgelser, er det vanskeligt at kontrollere for genetiske eller miljømæssige variabler, samt ikke-kræft “forstyrrende” betingelser. For eksempel, inflammation og angiogenese er kendetegnende for kræft, men også forekomme under infektioner, kronisk inflammation, auto-reaktive sygdomme og andre tilstande, som ikke er specifikke for kræft [7]. Mens nogle biomarkør undersøgelser har brugt inflammatoriske tilstande som kontroller [8], [9], betyder det ikke fjerne behovet for at bestemme området af proteiner, der opstår med inflammatoriske tilstande. Det faktum, at mange kandidat kræft biomarkører mangler tilstrækkelig specificitet at være nyttig argumenterer for en ny tilgang [1], [6].

Inflammation og angiogenese spiller vigtige roller i alle faser af kræft progression, herunder tumor initiering , vækst og metastatisk spredning. Faktisk kroniske inflammatoriske tilstande er stærke risikofaktorer for cancer [10]. Inflammation tilskynder og fremmer carcinogenese ved at forårsage celle og genom skader, stimulere cellulære omsætning via cytokiner og vækstfaktor release, og skabe et væv mikromiljø, der kan forbedre invasion, migration og angiogenese. Endelig immunsystemet styrer også kræft progression gennem immunosurveillance og immunoediting [11]. Inflammation er en kompleks proces vedtaget af værten til at styre vævsskade mod patogene, traumatisk eller toksisk skade og er generelt kategoriseres i en akut, hurtig reaktion, et subakut overgangsfase, og en vedholdende men langsomt udvikler kronisk tilstand. Den akutte inflammatoriske respons involverer en hurtig levering af blodkomponenter, plasma, neutrofiler, og leukocytter til stedet for infektion eller skade, efterfulgt af en tilstrømning af makrofager til at løse og reparere skaden [12]. Akut fase proteiner, der findes i plasmaet er defineret som enten positiv eller negativ alt efter om de stiger eller falder under en inflammatorisk lidelse. Hvis en akut inflammatorisk reaktion ikke løser skaden, er en overgang lavet til en udviklende subakutte fase, derefter til en kronisk inflammatorisk tilstand. Kronisk inflammation, såsom den, der ses i nogle autoreaktive betingelser, kan være “aktiv”. Dette er karakteriseret ved vævsremodellering, makrofager, T- og B-celler, angiogene og andre faktorer. Kronisk betændelse kan til gengæld føre til overdreven vævsskader, immun deregulering, og autoimmunitet [10], [13].

Angiogenese, spiring af nye blodkar fra allerede eksisterende kar, er forpligtet til at levere ilt og andre næringsstoffer til at understøtte tumorvækst; og graden af ​​vaskularisering er en prognostisk faktor, der korrelerer med tumor aggressivitet [14]. Imidlertid er angiogenese også forbundet med ikke-kræft forhold såsom sårheling, vævsreparation, rheumatoid arthritis og andre kroniske inflammatoriske sygdomme [15]. Således inflammation og angiogenese er intimt involveret i cancer samt andre fælles patologier. Disse betingelser udløse komplekse og dynamiske systemiske reaktioner, men omfanget af overlapning mellem det systemiske respons på kræft og ikke-kræft betingelser er stort set ukendt.

For at karakterisere den systemiske reaktion på kræft og inflammation, vi anvendte plasma proteomics til musemodeller for subakut inflammation, kronisk inflammation og angiogenese. Musemodeller overvinde nogle vigtige forhindringer for biomarkør opdagelse, herunder teknologiudvikling [16]; mere præcis matchning af sager og kontroller for at reducere genetisk, alder og miljømæssige variabler; udspørgende de dynamiske ændringer i plasmaet proteom gennem sygdomsprogression; og integration af resultater med de omfattende biologiske videnbaserne [17]. Carrageenan injektioner blev anvendt til at modellere subakut inflammation [18]. Denne model repræsenterer en subkutikulær reaktion udvikler lokal irritation og nekrose ligner det, der kan ses efter tumor nekrose. For kronisk inflammation, anvendte vi en collagen-induceret model af arthritis [19]. Denne model er associeret med antigen-antistof-komplekser, der er i overensstemmelse med en auto-reaktiv læsion, med infiltration af mononukleære celler, knogleombygning, fibroplasi og vaskulær vækst omkring leddet. FGF injektioner blev anvendt til at stimulere angiogenese, resulterer i hurtig indvækst af blodkar og understøttende stromale elementer [20].

Et stort antal plasmaproteiner ændret i overflod i hver model, der afspejler den komplekse biologi hver tilstand. Disse plasma profiler blev sammenlignet med dem, der tidligere er identificeret i to velkarakteriserede musemodeller for pancreas [21] og brystkræft [22]. I brystcancer-modellen, er oncoproteinet polyoma middle T-antigen (PyMT) drevet af MMTV LTR og er begrænset til brystepiteliet. Disse mus udvikler karcinomer, der ligner human brystcancer og som er forbundet med leukocytinfiltration og efterfølgende pulmonær metastase [23]. Udvikling af bugspytkirtelkræft i Pdx1-Cre Kras

G12D INK4a /Arf

lox /lox model indebærer progression fra pancreas intraepitelialneoplasi (PanINs) til pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), trofast den gentog den humane sygdom [24]. Her viser vi, at størstedelen af ​​plasma protein ændringer identificeret i disse tumormodeller var unikke for hver model og ikke ses i confounder modeller. Desuden er mange af disse proteiner har kendte roller i udviklingen af ​​kræft. Identifikation og karakterisering af protein profiler associeret med cancer versus ikke-kræft patologier kan anvendes til at forstå det komplekse biologi værtens respons på cancer og til at prioritere kandidat biomarkører, der er forbundet med cancer.

Materialer og metoder

Dyreforsøg

Dyreforsøg blev udført under IACUC regler som godkendt af FHCRC anvendelsen af ​​dyr udvalg (protokol # 1311). Ti kvindelige FVB mus blev anvendt for hver betingelse parret med ti kuld ubehandlede kontroller. At modellere akut inflammation, som går over i subakut inflammation, anvendte vi en velkendt pro-inflammatorisk lokalirriterende, carrageenan, et kulhydrat fremstillet af tang [18]. Dette blev leveret via en svamp implantat, som opretholder carrageenan frigivelse og bidrager med en klassisk fremmedlegeme respons. 10 × 10 mm kirurgiske svampe blev injiceret med 1% carrageenan (Sigma C1867-5G) og implanteret subkutant i den højre flanke. Plasma blev opsamlet ved hjertepunktur 3 uger senere. Plasmaproteinerne identificeret fra disse mus skal svare til et sent tidspunkt subakut reaktion på carrageenan og tilhørende svamp effekt, snarere end initiering af den akutte inflammatoriske respons, der forekommer inden for 72 timer. At evaluere proteinprofilen forbundet med kronisk inflammation, anvendte vi en collagen-induceret arthritis musemodel [19]. Bovint kollagen type II (CII) (BD Biosciences, San Jose, CA) blev emulgeret med komplet Freunds adjuvans (Pierce, Rockford, IL) ved en slutkoncentration på 4 mg /ml og i alt 0,1 ml blev injiceret intradermalt nær bunden af halen. Dette resulterer i udviklingen af ​​kronisk arthritis i bagpoterne inden 14-21 dage. Mus blev overvåget hver 2-3 dage for udviklingen og progressionen af ​​arthritis og plasma opsamlet ved udvikling af hævede bagpoter på 4 uger. At modellere angiogenese, matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) plus FGF (500 ng /ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev injiceret subkutant i den højre flanke resulterer i hurtig indvækst af blodkar og støtte stromale elementer, men med lidt associeret inflammation [20]. Plasma blev opsamlet 3 uger senere. For disse modeller blev blod fra eksperimentelle og kontrolmus opsamlet ved hjertepunktur, anvendelse af en 1 cm

3 sprøjte og en 23 g nål og anbragt i en K3-EDTA rør (Webster Veterinary Supply, Sterling, MA) [17 ]. Plasma blev isoleret ved centrifugering ved 2000 x g i 5 minutter, og portioner overført til kryohætteglas og nedfrosset ved -80 ° C.

prøvetagning for pancreas- [21] og bryst [22] cancer musemodeller har været tidligere beskrevet. Kort fortalt blev mus for kræft i bugspytkirtlen proteomisk analyse opnås ved avl Pdx1-Cre

INK4a /ARF

lox /lox og

Kras

G12D

INK4a /Arf

lox /lox-mus. Eksperimentel Pdx1-Cre

Kras

G12D

INK4a /ARF

lox /lox mus og kontrol

Kras

G12D

INK4a /Arf

lox /lox og Pdx1-Cre

INK4a /ARF

lox /lox musene blev aflivet på 5,5 og 7 ugers alderen. For både case og kontrol mus blev dødbringende koma induceret ved injektion mus intraperitonealt med en 0,6-0,8 ml 5% Avertin (2,2,2-tribromethanol, Sigma). Denne forskel i eutanasi metode introducerer en potentiel, selvom sandsynligvis mindre, advarsel, når man sammenligner bugspytkirtlen modellerne til de andre modeller. En 1-ml sprøjte med en 22 g nål blev anvendt til hjertepunktur at udtage blod. Blod blev anbragt i K3-EDTA-rør (Fisher) og centrifugeret ved 4 ° C i 5 minutter ved 3000 rpm. Plasma blev fjernet og opbevaret ved -80 ° C.

For brystkræft musemodel, transgene FVB /N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul /J (PyMT) mus blev opnået fra National Cancer Institute og opdrættet internt at opnå plasmaprøver fra tumorbærende mus og kontroldyr fra samme kuld på to tidspunkter for udvikling af brystkræft. PyMT heterozygote hanner blev krydset til FVB vildtype hundyr til at generere den kohorte PyMT heterozygote og vildtype hundyr for at studere. For at undgå bias, blev PyMT transgene og kontrol mus parret ved fravænning og blev matchet med hensyn til alder, strøelse, og bur. Alle mus blev fodret standard chow (Harland Tekland, 8664) og syrnet vand

ad libitum

og holdt på en 12 timers lys-mørke cyklus. Begyndende ved 5 uger gamle, blev musene palpering hver anden dag for at detektere brysttumorvækst. Brysttumorer fik lov til at udvikle sig til enten 0,5 eller 1 cm i diameter, hvorefter hver tumorbærende mus og en kontrolgruppe blev aflivet back-to-back på samme dag af CO

2 inhalation. Blod blev opnået ved hjertepunktur, og plasma blev isoleret og opbevaret som beskrevet for inflammation og angiogenese musemodeller.

Immunodepletion af rigelige proteiner og isotopisk mærkning

50 pi plasma fra 5 mus blev samlet for hvert sæt af case og kontrolprøver. Puljer blev immundepleteret af de øverste tre mest forekommende proteiner (albumin, IgG og transferrin) under anvendelse af en MS-3-søjle (4,6 x 10 mm, Agilent). Den immunodepletion Søjlen blev ækvilibreret med puffer A ved (0,5 ml /min) i 13 min og portioner af kombinerede sera blev injiceret efter filtrering gennem et 0,22 um sprøjtefilter. Gennemløbet fraktioner blev opsamlet i 10 minutter ved en strømningshastighed på buffer A på 0,5 ml /minut, kombineret og opbevaret ved -80 ° C. Søjlen bundne materiale blev udvundet ved eluering i 8 minutter med buffer B ved 1 ml /min. Efterfølgende blev immundepleteret prøver koncentreret ved anvendelse af Centricon YM-3 enheder (Millipore Corp, Bedford, MA) og re-fortyndet i 8 M urinstof, 100 mM Tris pH 8,5, 0,5% OG (octyl-beta-D-glucopyranosid, Roche). Efter udtømning og bufferudskiftning blev proteinkoncentrationer bestemt ved Bradford-assays: angiogenese 2,5 mg (tilfælde) og 3,8 mg (kontrol), kronisk inflammation 4,3 mg (tilfælde) og 3,8 mg (kontrol), og akut inflammation 2,8 mg (tilfælde) og 3,1 mg (kontrol), og hele mængden af ​​protein for hver prøve blev anvendt til efterfølgende acrylamid mærkning. Prøver blev reduceret med DTT (0,66 mg DTT /mg protein), og isotopiske mærkning af cysteinrester på intakte proteiner blev udført. Kontrolprøver blev mærket med lys 12C acrylamid isotop (7,1 mg /mg protein) ( 99,5% renhed, Fluka), og eksperimentelle prøver blev mærket med den tunge 13C-acrylamid isotop (Cambridge Isotope Laboratories, 7,4 mg /mg protein) til 1 time ved stuetemperatur. Puljer af kontrol- og eksperimentelle prøver blev derefter kombineret for intakt protein separation.

Intact protein separation

De kombinerede isotopmærkede prøver blev adskilt af en automatiseret online 2D-HPLC-system styret af Workstation Class-VP 7,4 (Shimadzu Corporation). De kombinerede mærkede plasmaprøver blev separeret i den første dimension på en anionbyttersøjle (Poros HQ /10, 10 mm ID x 100 ml, Applied Biosystems) under anvendelse af en 8 trin-eluering (fra 0 mM NaCl til 1000 mM NaCl) ved 0,8 ml /min. Fraktioner fra hver af de 8 anionbytning separation elueringstrin blev automatisk overført til en omvendt fase-søjle (PorosR2 /10, 4,6 mm ID x 100 ml, Applied Biosystems) for en anden dimension til separation. En 25 min gradienteluering (fra 5% til 95% mobil fase B) blev anvendt ved 2,4 ml /min. 3 fraktioner blev opsamlet per minut, med hver fraktion indeholdende 800 uL. 576 omvendt fase fraktioner blev opsamlet i alt (8 anionbytnings fraktioner hver adskilt i 72 omvendt fase fraktioner). Mobil fase A for anionbytningskromatografi bestod af 20 mM Tris (Sigma), 6% isopropanol (Fisher), 4 M urinstof, pH 8,5 og mobil fase B var den samme sammensætning og pH som A med 1 M NaCI (Fisher) blev tilsat . Mobil fase A til omvendt fase-kromatografi bestod af 95% vand, 5% acetonitril, 0,1% TFA (Supelco), og mobil fase B bestod af 90% acetonitril, 10% vand, 0,1% TFA.

Mass spektrometri analyse

-opløsning fordøjelse blev udført med lyofiliserede prøver fra omvendt fase (anden dimension) fraktioneringstrin. Proteiner i enkelte fraktioner blev resuspenderet i 0,25 M urinstof (Fisher) indeholdende 50 mM ammoniumbicarbonat og 4% acetonitril og derefter fordøjet natten over med 200 ng af modificeret trypsin (Promega) ved 37 ° C. De resulterende peptidblandinger blev forsuret med 5 pi af 1% myresyre. Alikvoter blev underkastet massespektrometri shotgun-analyse efter pooling af flere på hinanden følgende fraktioner (proteinkoncentration estimeret ved UV-sporet). 12 puljer af individuelle fraktioner omvendt fase for hver af de 8 anionbytnings trin blev skabt ved at kombinere følgende sekventielle fraktioner: 1-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30, 31-32, 33 -34, 35-36, 37-38, 39-40, 41-42, og 43-72. 96 fraktioner blev analyseret for hvert eksperiment ved en LTQ-Orbitrap (Thermo) massespektrometer koblet med et nanoLC-1D (Eksigent). Den væskekromatografi separation blev udført i en 25 cm søjle (Picofrit 75 um id, Nye mål, pakket i-hus med MagicC18 harpiks) under anvendelse af en 90 min lineær gradient fra 5 til 40% af acetonitril i 0,1% myresyre ved 300 nl /min for shotgun analyse. Ca. 10 ug protein blev injiceret pr fraktion. Spektre blev erhvervet i et data-afhængig mode i

m

/

z

intervallet 400-1800, herunder udvælgelse af de 5 mest rigelige +2 eller +3 ioner af hver MS-spektret for MS /MS-analyse. Masse spektrometer parametre var kapillær spænding på 2,0 kV, kapillær temperatur på 200 ° C, opløsning på 60.000, og målværdi på 1.000.000.

Databehandling

Erhvervede data blev automatisk behandles af de Computational Proteomics Analyse System (CPAS) [25] rørledning ved hjælp af X! Tandem søgealgoritme [26] konfigureret med komet score modul plug-in. PeptideProphet [27] og ProteinProphet [28] blev anvendt til validering af søgeresultater og protein inferens. Kvantificering blev udført ved hjælp af Q3 kvantificering værktøjet [29]. Tandem massespektre blev søgt mod udgave 3.48 i muse IPI databasen [30]. Alle identifikationer med en PeptideProphet sandsynlighed større end 0,2 blev forelagt ProteinProphet, og de efterfølgende protein identifikationer blev filtreret på et minimum 5% fejlrate. For kvantificering blev nøgletal for proteiner beregnet ved hjælp af kun de peptider der opnåede PeptideProphet sandsynlighed på mindst 0,75. Protein grupper tildelt af ProteinProphet blev kombineret med fælles gen symbol og herefter benævnt “protein”. Case /kontrol-forholdene for hvert protein blev beregnet som gennemsnittet log2 forhold på tværs af alle peptider tildelt til proteinet. Over 1.000.000 MS /MS-spektre blev opsamlet og proteiner med 2289 unikke gen navne blev identificeret på tværs af de 3 forsøgsmodeller.

Statistisk signifikans af protein kvantificering ved massespektrometri blev bestemt ved to metoder. For proteiner med multiple parret MS begivenheder af tunge og lette acrylamid blev en one-sample t-test anvendes til at beregne en p-værdi for den gennemsnitlige forhold mellem hele proteinet i alle fraktioner. For det andet blev sandsynligheden for forholdet for hver MS begivenhed beregnet ud fra fordelingen af ​​nøgletal i en kontrol-kontrol eksperiment, hvor den samme prøve blev delt og mærket med tunge og lette acrylamid. Hvis p-værdien for den enkelte begivenhed var 0,05, blev protein-forholdet betragtet som statistisk signifikant

Netværk analyse

De øgede og faldt proteiner identificeret fra IPAs analyse blev anvendt til biofunction. og sti analyse ved hjælp Ingenuity pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). IPA database består af proprietære ontologi, der repræsenterer 300.000 biologiske gener, proteiner og molekylære og cellulære processer.

Enzyme linked immunosorbent (ELISA) analyser

Plasma niveauer af PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2 blev målt ved anvendelse af kommercielt tilgængelige muse DuoSet kits opnået fra R 0,05) og af disse, to til tre gange så mange blev nedsat i modsætning til forøget i alle tre modeller (tabel 1, fig S1). Når vi betragter kun proteiner kvantificeret i alle tre musemodeller, sammenligninger af plasma-profiler mellem modellerne viste en 35% overlapning i ændrede proteiner mellem subakut og kronisk inflammation modeller, sammenlignet med kun 15% overlapning mellem betændelse modeller og angiogenese-modellen ( tabel 1). På grund af den begrænsede prøvetagning af massespektrometeret, blev en række proteiner ikke kvantificeret i alle tre musemodeller. Når vi ikke kræver proteiner skal kvantificeres i alle tre musemodeller, overlapningen af ​​op- og ned-regulerede proteiner er vist i figur 1A og 1B henholdsvis. Sammenligninger af ændringer i protein niveauer for hver model afslørede en stærk korrelation mellem subakut og kronisk inflammation, med en Pearson test score på 0,67 (figur 1C), mens sammenligninger af hver betændelse model til angiogenese model afslørede mindre end 50% korrelationer (Pearson test snesevis af 0,49 og 0,31, henholdsvis). Således plasmaprofiler var mere ens mellem betændelse modeller end mellem angiogenese og enten inflammation model, der afspejler den underliggende biologi af disse betingelser. Endvidere er de fleste af ændrede proteiner var unikke for hver confounder model, hvilket viser biologisk specificitet. De relative hyppighed af de enkelte proteiner identificeret i hver af de tre modeller er anført i tabel S1.

Venn-diagram sammenligning (A) øges, og (B) faldt proteiner i plasma fra subakut og kronisk inflammation og angiogenese modeller sammenlignet med kontrolmus. Diagrammer viser antal proteiner, enten forhøjede eller reducerede i hver model, og som er unikke eller deles mellem hver af de 3 modeller. Størstedelen af ​​enten øges eller mindskes proteiner var unikke for hver model. (C) korrelationskurver for kvantificerede proteiner. Case /kontrol (log2) nøgletal for hver kvantificerede protein plottes på X- og Y-akser. Graferne afspejler overflod forskelle i specifikke proteiner mellem to modeller. Proteomisk sammenligninger mellem kronisk versus subakut inflammation sammenligning er mere ens (R = 0,67) end sammenligninger mellem enten betændelse model og angiogenese model (R = 0,49 og 0,31, henholdsvis).

Vi derefter sammenlignede proteomiske profiler af disse confounding modeller til tidligere opnåede profiler fra tidlige og sene stadie brystkræft [22], og at profiler fra tidlig fase (PanINs) og sent (PDAC) bugspytkirtelkræft [21]. I modsætning til de confounder modeller, blev en nogenlunde lige antal proteiner steg og faldt i tumorbærende mus sammenlignet med ikke-tumorbærende mus (tabel 2). Af disse ændrede proteiner, det store flertal ( 75%) blev ikke ændret i konfoundere (tabel 2). Tre mønstre af plasmaprotein fordeling blev observeret: forhøjet i både konfoundere og kræftmodeller (figur 2A), steg i konfoundere men uændret eller nedsat i cancer (figur 2B) og fald i konfoundere og voksede i cancer (figur 2C). Kun 27% af proteiner med ændrede niveauer i undersøgelsen blev forøget i både konfoundere og cancer, mens den største kategori, og at 55% af den samlede, bestod af proteiner, der var nedsat i konfoundere men steg i tumorbærende mus. Relative niveauer af repræsentative proteiner, der udviser disse mønstre er vist i figur 3. Bemærk, lysyloxidase gerne 1 (Loxl1) og proteoglycan 4 (Prg4) er reduceret i plasma fra konfoundere og voksede i både bryst- og pancreatiske tumorbærende mus, mens fedtsyre syntase (Fasn) og lipocalin2 (Lcn2) forhøjes i både konfoundere og kræft modeller (tabel S1)

(A) Proteiner steg i både konfoundere og kræftmodeller i forhold til kontrolgruppen ( . 1,25 gange, s 0,05), (B) proteiner steget i konfoundere og faldt i kræftmodeller, og (C) proteiner faldt i konfoundere og steg i kræftmodeller (rød = op, grøn = ned, sort = ingen ændring, grå = ikke kvantificeret).

Plots viser massespektrometri baseret log2 sag /kontrol nøgletal for specifikke proteiner i hvert confounder og kræft model, der viser differentierede overflod mønstre. Loxl1 repræsenterer proteiner, der er reduceret i konfoundere og forhøjede i kræftmodeller. Fasn viser elevation i alle modeller, men mere så i Panin. Prg4 er forhøjet primært i bugspytkirtelkræft model. Lcn2 er forhøjet i inflammation og i højere grad i de kræftmodeller, men ikke angiogenese model.

For at verificere forskellen overflod observeret ved massespektrometri, ELISA-analyser blev udført på udvalgte proteiner baseret på kommercielle tilgængelighed (PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2) (Figur 4). Bemærk, insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF1) og insulinlignende vækstfaktor-bindende protein 5 (Igfbp5) blev nedsat eller uændret i konfoundere men steg i bryst tumorbærende mus. Lipocalin 2 (Lcn2) blev forøget i alle modeller, men til et højere niveau i tumorbærende mus, mens blodpladefaktor 4 (PF4) blev reduceret i subakut inflammation men steg i kronisk inflammation og cancer. Andre plasmaproteiner, der specifikt er steget i tumorbærende mus inkluderet acetyl-CoA acetyltransferase 1 og 3, fedtsyrebindende proteiner 1 og 4, fibulin, peroxiredoxins 1, 5 og 6, SPARC, og thrombospondins 1 og 4.

ELISA-analyse af PF4, IGF1, Igfbp5, og Lcn2 viser forøget plasmakoncentration i PyMT bryst tumorbærende mus sammenlignet med enten subakutte eller kroniske inflammation mus. Plasma fra ubehandlede mus blev anvendt som kontrol.

plasmaprotein ændringer observeret med betændelse

Vi analyserede næste de ændrede plasmaproteiner fra hver confounder tilstand. I subakut inflammation model, der er større end 50% af de øgede proteiner spiller en kendt rolle i inflammation, herunder positive akutfaseproteiner [31], samt kemokinerne Ccl8 og PF4 (også kendt som Cxcl4) (tabel S1). Blandt de faldt proteiner var fem komplementproteiner samt udskilte signalproteiner såsom Rbp4, IGF1, Igf2, TGFp, og Pdgfb. Komplementkaskaden er vigtig i den akutte fase respons, mens IGF1 og RB4 er negative akut fase-proteiner. Netværk analyse knyttet mange af de proteiner med ændrede niveauer til intracellulær (NF-KB) og udskilt (IL-1 og TGFp) immunsystem-regulator (figur 5A, B) [10]. TGFp selv blev reduceret, som var flere proteiner involveret i TGFp-signalering. Kollektivt, proteomanalyse af plasma identificeret kendte akutte fase proteiner, proteiner forbundet med inflammatoriske regulatorer såsom TGFp, og yderligere proteiner (f.eks cytoskeletproteiner aktinerne, cofilins, VASP, profilin, og destrin) ikke tidligere er forbundet med inflammation (tabel S1).

Top netværk tildelt af Ingenuity Pathway Analyse for både forøget og nedsat proteiner fra subakut inflammation (A, B), kronisk inflammation (C, D) og angiogenese modeller (E, F). Netværk for subakut model viser rigelige fibrinogen og ECM-proteiner, den kroniske model giver fremtrædende vækstfaktor og kollagen netværk mens angiogenese-netværket viser kemokin og koagulations proteiner. [Rød = øget, grønne = faldet, hvid = ingen ændring i overflod i tilfælde vs kontrol mus, 1,25 fold p. 0,05]

Som i subakut inflammation model, et betydeligt antal. af proteiner steg under kronisk inflammation havde kendt links til inflammation. Især dog færre akutfaserespons proteiner blev identificeret end med subakut model (tabel S1). En anden væsentlig kategori af proteiner ændret med kronisk inflammation er involveret i ekstracellulær matrix remodellering (figur 5C). Mange af disse blev reduceret og er mål for MMP2 protease, som selv blev øget. Som i subakutte model, TGFp og proteiner er knyttet til dens regulering eller signalering blev reduceret, herunder Ltbp1, Ltbp4, og Vasn (figur 5D).

Plasma protein signatur for angiogenese

Et betydeligt antal de ændrede proteiner identificeret i den angiogene model har kendt mekanistiske links til angiogenese og /eller udtrykkes i endotelceller, såsom thrombospondin 1 og 4, renin 1 og 2, blodpladefaktor 4, trefoil-faktor 1, og kollagen bindende protein 2, samt andre proteiner ikke tidligere associeret med angiogenese. Desuden, ændringer i komplement-proteiner og koagulationsfaktorer, som har forbindelser til angiogenese, blev observeret (fig 5E) [32] [33].