abstrakt
Baggrund
Flere medlemmer af zinkfingerproteinet familie har for nylig vist sig at have en rolle i cancer initiering og progression. Zink finger protein 367 (
ZNF367
) er medlem af zinkfingerproteinet familie og udtrykkes i embryonale eller føtale erythroid væv, men er fraværende i normalt voksent væv.
Metode /vigtigste resultater
Vi viser, at
ZNF367
er overudtrykt i binyrebark karcinom, ondartet fæokromocytom /paragangliom og kræft i skjoldbruskkirtlen i forhold til normalt væv og godartede tumorer. Brug både funktionelle knockdown og ektopisk overekspression i flere cellelinjer, viser vi, at
ZNF367
hæmmer celleproliferation, invasion, migration og adhæsion til ekstracellulære proteiner
in vitro
in vivo
. Integreret gen og microRNA udtryk analyser viste en omvendt korrelation mellem
ZNF367
og miR-195 udtryk. Luciferaseassays viste, at miR-195 direkte regulerer
ZNF367
udtryk og at miR-195 regulerer cellulær invasion. Desuden integrin alfa 3 (
ITGA3
) udtryk blev reguleret af
ZNF367
.
Konklusioner /Betydning
Vores resultater tilsammen tyder på, at
ZNF367
regulerer kræft progression
Henvisning:. Jain M, Zhang L, Boufraqech M, Liu-Chittenden Y, Bussey K, Demeure MJ, et al. (2014)
ZNF367
Forhindrer Cancer Progression og er målrettet efter miR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10,1371 /journal.pone.0101423
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
Modtaget: 12. februar 2014 Accepteret: 6 Jun 2014; Udgivet: 21 Jul 2014
Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation
Finansiering:. Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogram for Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Nogle af medforfatterne er ansat af et kommercielt selskab -SAIC Frederick INC, der er ingen interessekonflikt. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.
Introduktion
Vores viden om de biologiske begivenheder, som hæmmer eller fremmer metastatisk spredning af endokrine kræft lokalt og til fjerne steder er begrænsede [1]. Forståelse af de molekylære begivenheder involveret i kræft progression har stor betydning for at identificere mål for terapeutisk fordel. Genomisk, genetiske og epigenetiske fremgangsmåder er blevet anvendt til at identificere ændringer i gener /veje, transkriptionsfaktorer, eller gen signaturer ved sammenligningen af den normale, primære tumorer, og /eller metastase. Imidlertid har disse analyser ikke ofte skelnes mellem initiativtagere, hæmmere eller passager markører i kræft initiering og progression, og sjældent definere en specifik mekanisme til dysreguleret genekspression.
Endokrine kræftformer er en forskelligartet gruppe af maligne sygdomme, der udviser den fulde spektrum af biologiske opførsel af maligne tumorer: ugidelig vækst til hurtigt progressive kræftformer med dårlig overlevelse. Således endokrine cancere repræsenterer en fremragende model til undersøgelse af de molekylære faktorer, der påvirker kræft initiering og progression. Identificering genetiske ændringer er fælles for disse forskelligt opfører endokrine tumortyper er blevet vist at spille en vigtig rolle i mange typer af humane cancere. For eksempel,
BRAF
mutationer er meget udbredt i kræft i skjoldbruskkirtlen og andre kræftformer, og er forbundet med en mere aggressiv sygdom i kræft i skjoldbruskkirtlen [2], [3].
SDHB
mutationer blev oprindeligt identificeret i familiær paragangliom, men blev senere fundet at være fremherskende i nyre kræft og gastrointestinale stromale tumorer, og for nylig hypofysetumorer [2], [4], [5]. Således opdager de molekylære ændringer i forbindelse med endokrine kræft initiering og /eller progression forventes at spille en vigtig rolle i en bred gruppe af menneskelige maligniteter.
I denne undersøgelse har vi bestemt den mekanisme af genekspression regulering og funktion af
ZNF367
i en række endokrine kræft (papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, binyrebark karcinom, fæokromocytom /paragangliom).
ZNF367
(også kendt som
ZFF29
og
CDC14B
) er medlem af zinkfingerproteinet familie, med en unik Cys2His2 zink finger motiv, er udtrykt i embryonale eller føtal erythroide væv, og er fraværende i andre normalt voksent væv [6], [7]. For nylig er der blevet fundet flere zinkfinger-proteiner, der skal dysreguleret i cancer, til at fungere som tumorsuppressorer /promotorer, og forårsage resistens mod kemoterapi [8] – [10]. Men rollen som
ZNF367
i kræft er ikke undersøgt,. Her rapporterer vi, at
ZNF367
er overudtrykt i en række endokrine kræft, og at det hæmmer
in vitro
in vivo
vækst, cellulære invasion, migration og vedhæftning . Desuden
ZNF367
overekspression er forbundet med tabet af miR-195 udtryk, der direkte er rettet mod
ZNF367
. Endelig
ITGA3
reduceres med
ZNF367
overekspression, om en miR-195-
ZNF367
–
ITGA3
akse, der fungerer til at hæmme udviklingen af kræft.
Metoder
Vævsprøver og dyreforsøg
Vævsprøver blev indkøbt på en Institutional Review Board-godkendt klinisk protokol efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01005654) . Vævsprøverne blev opsamlet på tidspunktet for kirurgi, og de blev straks lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Et-hundrede-og-fem menneskelige adrenocortikale (19 normal binyrebarken, 79 kortikale adenomer, 7 adrenocorticale carcinomer), 47 skjoldbruskkirtlen væv (8 normal, 39 papillær kræft i skjoldbruskkirtlen), og 68 (19 normale adrenale medulla, 28 godartede, 21 ondartet pheochromocytoma /paragangliom) vævsprøver blev anvendt i denne undersøgelse. Alle Diagnosen blev bekræftet ved en endokrin patolog, og tumor prøver blev bekræftet at indeholde ≥ 80% tumorceller /kerner. Diagnosen adrenocortical carcinoma og malign fæokromocytom /paragangliom var baseret på tilstedeværelsen af grov lokal invasion og /eller fjernmetastaser og en Weiss score på 3 for adrenocortical carcinoma. Normal binyrebarken og medulla blev indsamlet fra raske organdonorer bruger laser capture mikrodissektion under en Institutional Review Board-godkendt protokol. To offentligt tilgængelige datasæt af genom-dækkende genekspression analyse adrenocorticale tumor prøver blev anvendt til at evaluere
ZNF367
mRNA-ekspression (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 og https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).
The National Cancer Institute Animal Care og brug Udvalg godkendte protokollerne for dyr pleje og håndtering i den nuværende studere. Enhver mus oplever markant unormale neurologiske tegn, blødning fra enhver åbning, nedsat mobilitet, hurtigt vægttab, invaliderende diarré, ru pels, foroverbøjet kropsholdning, besværet vejrtrækning, sløvhed, vedvarende recumbence, gulsot, blodmangel, selvforskyldt traumer, bliver døende eller ellers bliver ude af stand til at skaffe føde eller vand, eller med en tumor 2 cm eller større i diameter er blevet straks aflivet ved CO
2 kammer.
cellelinjer, cellekultur, reagenser, siRNA, og miR- 195 transfektion
SW13 binyrebark carcinom cellelinje (ATCC, Rockville, MD) blev dyrket og opretholdt i DMEM-medium suppleret med 1% insulin transferrin selen (ITS; BD Biosciences, San Jose, CA) og 2,5% Nu -Serum i (BD Biosciences) i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%
2 atmosfære. Den BD140A adrenocortical carcinoma-cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Dr. Kimberly Bussey (TGEN, Pheonix, Arizona), og det blev dyrket i RPMI-medium suppleret med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% penicillin-streptomycin, og 1 % L-glutamat. Den humane papillær thyroidcancer (TPC-1) cellelinien blev opretholdt i DMEM suppleret med FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), fungizon (250 ng /ml), TSH (10 IU /L ), og insulin (10 pg /ml). Humane embryoniske nyre (HEK293) celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS, 1% Pen-strep (Gibco, Grand Island, NY) og 1% L-glutamat (Gibco). Alle cellelinjer blev bekræftet af korte tandem repeat profilering på 14. oktober 2012.
ZNF367 siRNA’er (s46962, s46963) og negative kontrol siRNA’er (AM4613) blev anvendt ved en endelig koncentration på 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, CA). Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev anvendt til celle transfektion af siRNA’er. Modne miRNA precursor, præ-MIR-195, og tilfældig rækkefølge pre-MIR-negativ kontrol (Applied Biosystems) ved 5 nM blev transficeret ind SW13-celler under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). For
ZNF367
overekspression i HEK293-celler, celler (8 × 10
5 i hver 6 brønd) blev transficeret med en
ZNF367
cDNA konstruere eller en tom vektor (OriGene, Rockville, MD ) under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen).
Immunhistokemi
Formalin-fikserede og paraffin-indlejrede vævssnit blev de-paraffinized og derefter rehydreret under anvendelse xylen og ethanol. Antigen genfinding blev afsluttet under anvendelse af en 10% citratpuffer pH 6,0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) i en trykkoger ved 120 ° C i 10 minutter. Vævssnit blev inkuberet med 6% hydrogenperoxid for at standse endogen peroxidaseaktivitet i 30 minutter (Dako, Carpinteria, CA), efterfulgt af inkubation med serum i en time (Dako, Carpinteria, CA). Primær anti-ZNF367 polyklonalt kaninantistof (Sigma, St. Louis, MO; HPA015785) ved 5 ug /ml fortynding blev anvendt natten over ved 4 ° C. Anti-kanin sekundært antistof blev anvendt (Dako Envision anti-kanin, Carpinteria, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Sektioner blev udviklet ved anvendelse 3,3′-diaminobenzidin DAB som kromogen (Dako, Carpinteria, CA), og de blev modfarvet med hæmatoxylin. Sektionerne blev dehydreret og monteret med vectamount monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Den immunfarvning af ZNF367 blev vurderet ved lysmikroskopi (Nikon, Tokyo, Japan), og billeder blev scannet ved 20X forstørrelse.
RNA-præparat, revers transkription, og real-time kvantitativ PCR
RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens, ifølge producentens anvisninger (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Totalt RNA (200-500 ng) blev revers-transkriberet under anvendelse af en høj kapacitet Reverse Transcription cDNA kit, og cDNA blev amplificeret i henhold til fabrikantens anvisninger (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR primere og prober til
ZNF367
(Hs00400665_m1),
ITGA3
(Hs01076873_m1), og
GAPDH
(Hs_99999905_m1) blev opnået fra Applied Biosystems.
Western blot
Lysater blev fremstillet med 1% SDS plus 10 mM Tris [pH 7,5] puffer, og Western blot blev udført på 10% SDS-PAGE-gel. Primære kanin polyklonale antistoffer, anti-ZNF367 (HPA015785, Sigma, MO) og anti-ITGA3 (Sigma; SAB1100194) blev anvendt ved 5 pg /ml og 2 ug /ml, og anti-GAPDH (sc-32233; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) blev anvendt ved 1:1,000 fortynding. Sekundært anti-kanin-antistof blev anvendt ved 1:5,000 fortynding (Cell Signaling, Danvers, MA).
Celleproliferation
Celler blev podet i en koncentration på 2.000 celler i en plade med 96 brønde i seks gentagelser. Den CyQUANT ™ assay-kit (Invitrogen) blev anvendt til at evaluere celleantallet, ifølge producentens instruktioner.
klongenicitetsassayet
HEK293-celler (8 x 10
5) blev transficeret med den tomme vektor eller
ZNF367
konstruere. Efter 24 timer blev cellerne trypsiniseret, resuspenderes i medierne, og talt. Cellerne blev igen udsået i 6-brønds plader ved 250, 500 og 1000 celler. Efter 10 dage blev mediet fjernet fra brøndene og vasket to gange med iskold PBS. Kolonierne blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og farvet med 2 ml krystalviolet i 60 minutter på en vippende platform. Pladerne blev vasket tre gange med PBS og lufttørret, og kolonierne blev fotograferet i FluorChem Imager (San Jose, CA).
Cell invasion og migration assay
Cellulær invasion og migration var vurderet ved hjælp af BD BioCoat Matrigel invasion Chamber (BD Biosciences) ifølge fabrikantens protokol. 1 × 10
5-celler podedes på indsatsene (8 um pore-størrelse polycarbonatmembraner) med og uden et tyndt lag Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences) pels. Indsatsene blev anbragt i bundbrønde, med 10% serumholdigt dyrkningsmedium som en kemoattraktant. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C. Celler, som invaderede Matrigel matrix eller som vandrede gennem porerne uden Matrigel matrix til den nedre overflade af membranen blev fikseret og farvet med Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ) og talt under et lysmikroskop i fire separate felter med billede J-software (NIH, Bethesda, MD).
celleadhæsionsassayet
SW13 celler blev transficeret med
ZNF367
siRNA og den negative kontrol. Efter 120 timers transfektion blev cellerne trypsiniseret og 1 x 10
5-celler blev udpladet i en 48-brønds plade indeholdende fem adhæsionsmolekyler (fibronectin kollagen I, kollagen IV, laminin I, og Fibrinogen) og inkuberet ved 37 ° C i 90 minutter i overensstemmelse med producentens instruktioner (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Brøndene blev vasket to gange med PBS, og 200 pi af farvningen opløsning blev tilsat og inkuberet i 10 minutter. Brøndene blev vasket to gange med deioniseret vand. Brøndene blev lufttørret, og 200 pi af ekstraktionsopløsningen blev tilsat og inkuberet i 10 minutter. I alt 150 pi blev overført fra hver ekstraherede prøve til en 96-brønds plade, og absorbansen måles ved 560 nm på en SpectraMax M5E mikropladelæser (Sunnyvale, CA).
Genom-dækkende mRNA-ekspression microarray
SW13 celler blev transficeret med
ZNF367
siRNA og den negative kontrol i tre eksemplarer. Efter transfektion blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) kit, ifølge producentens anvisninger. cDNA revers transkription, syntese, forstærkning, fragmentering, og terminal mærkning af 150 ng total RNA blev udført ved hjælp af GeneChip WT Sense Target mærkning og kontrol Reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). I alt 25 ng /pi cDNA blev hybridiseret til Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array GeneChip. Pathway analyse blev udført ved hjælp af DAVID bioinformatik ressourcer (https://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).
I silico
identifikation af microRNA målrette ZNF367
MIR-databaser (Target Scan (https://www.targetscan.org) og mirDB (https://mirdb.org/miRDB/) blev anvendt til at identificere microRNA, der kan målrette
ZNF367
. Kandidat microRNA’er forudsagt at målrette
ZNF367
blev derefter analyseret for at afgøre, om de differentielt blev udtrykt i adrenocortical carcioma og papillær kræft i skjoldbruskkirtlen.
Luciferaseassayreagens
Vild type
ZNF367
3’UTR blev klonet i GoClone konstrukt (koblingsudstyr Genomics, Menlo Park, CA). mutant konstruktion af
ZNF367
3’UTR blev opnået ved at indføre mutation i de første tre nukleotider af frø region (143-150, GCTGCTA – CGAGCTA). for miR-195 Wild-typen
ZNF367
3’UTR eller mutant
ZNF367
3’UTR og den tomme 3’UTR vektor med præ- mIR-195 eller præ-NC blev co-transficeret ind SW13-celler (koblingsudstyr Genomics). Normaliseringen metode til transfektion effektivitet i luciferase reporter assay var ifølge anbefaling af SWITCHGEAR Genomics (Menlo Park, CA) med tom vektor, der anvendes som positiv kontrol for transfektion. Den tomme 3’UTR vektor indeholder en konstitutiv promotor (findes på alle UTR-konstruktioner) og luciferasegenet (RenSP). Denne konstruktion fungerede som en positiv kontrol for transfektion. Celler blev udpladet i 24-brønds plader og cotransficeret med 5 nM MIR-195 eller den negative kontrol (Applied Biosystems), 0,12 ug af vektoren (SWITCHGEAR Genomics), og 0,75 pi Lipofectamin (Invitrogen). Den luminescens blev læst efter 24 timer med lyskontakt assay-system, ved hjælp af en SpectraMax M5E mikropladelæser.
In vivo
xenograft assay
athymiske nøgne hunmus (fem til seks uger gamle, kropsvægt: 20-22 g) blev opnået fra Frederick National Laboratory for Cancer Research dyrefaciliteter (Frederick, MD). Efter 48 timers transfektion med
ZNF367
siRNA og den negative kontrol, tre millioner celler blev resuspenderet i 100 pi DMEM og Matrigel (01:01), og de blev injiceret i flanken af athymiske nøgne mus .
statistiske analyser
Kontinuerlig data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) eller standard fejl af middelværdien (SEM). Kruskal-Wallis test blev anvendt til at sammenligne parametrisk data fra tre eller flere grupper. Den t-test eller Mann-Whitney-test blev anvendt til at sammenligne forskelle mellem to grupper for parametriske og parametriske variabler hhv. The Pearson korrelation test blev anvendt til at identificere korrelationer mellem to grupper. En
s
-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev gennemført med Graph Pad Prism 5,0 statistisk software.
Resultater
ZNF367
er overudtrykt i kræft
ZNF367
sige overudtrykt i adrenocortical carcinoma, papillær thyroidcancer, og malign fæokromocytom /paragangliom, sammenlignet med benigne og normale vævsprøver for hver tumortype (p 0,05; figur 1). ZNF367 proteinekspression var til stede i kernen og cytoplasmaet. Der var stærkere ZNF367 farvning i kernen end i cytoplasmaet i hvert cancer prøve (adrenocortical cancer, papillær thyroidcancer og malign fæokromocytom /paragangliom). For at bekræfte den forhøjede udtryk for
ZNF367
i binyrebark carcinom i en større prøve sæt, vi analyserede udtryk profilering af data fra offentligt tilgængelige datasæt deponeret i genekspression omnibus. I to uafhængige genom-dækkende genekspression datasæt,
ZNF367
blev overudtrykt i binyrebark carcinoma forhold til binyrebark adenom og normale vævsprøver (p 0,001; Figur S1). Disse resultater tyder på, at
ZNF367
er overudtrykt i en række forskellige kræftformer, med ensartede resultater på tværs af forskellige analyser og genomiske platforme brugt.
(A og B) Expression niveau i den normale binyrebarken, godartet adrenocorticale adenomer og adrenocorticale carcinomer; (C og D) normale adrenale medulla, godartede og ondartede fæokromocytom /paragangliom vævsprøver; og (E og F) normal thyroid og papillære kræft i skjoldbruskkirtlen vævsprøver. Y-aksen på hver graf repræsenterer procentdelen af mRNA-ekspression under anvendelse af 2
∧-ACt * 100% -metoden ± SEM. * P 0,05, ** p 0,001, *** p 0,001 (Kruskal-Wallis test). Repræsentative immunhistokemi billeder er fra normale, godartede og ondartede tumor prøver på 20X forstørrelse.
ZNF367
hæmmer celleproliferation, invasion, migration og vedhæftning
Fordi
ZNF367
er overudtrykt i endokrine kræft, vi undersøgte dens virkning på cellulær proliferation, invasion, og migration, begivenheder, der er nødvendige for kræft progression.
ZNF367
blev udtrykt i binyrebark carcinom (SW13, BD140A), papillær thyroidcancer (TPC-1), og HEK293-cellelinier. Således har vi brugt både
ZNF367
Knockdown og overekspression tilgange til at bestemme virkningen af
ZNF367
på cellulær proliferation, invasion, og migration. SiRNA knockdown opnået op til 80% knockdown af ZNF367 mRNA og proteinekspression sammenlignet med siRNA negativ kontrol (figur S2).
ZNF367
knockdown i SW13-celler, forøget cellulær proliferation (30-40% )
in vitro
(3,5 gange)
in vivo
(p 0,05, figur 2).
ZNF367
knockdown også øget cellulær invasion og migration (p 0,05, figur 3A). I betragtning af den dramatiske effekt af
ZNF367
på cellulær invasion og migration i SW13 celler, blev effekten af
ZNF367
knockdown på cellulær invasion og migration også evalueret i BD140A, TPC-1, og HEK293 celle linjer. Knockdown havde en lignende effekt på cellulær invasion og migration af BD140A, TPC-1, og HEK293-cellelinier (p 0,05; figur 3, B-D). Effekten af
ZNF367
på cellulær vækst, invasion, og migration blev også bekræftet ved overekspression
ZNF367
i HEK293 celler.
ZNF367
overekspression nedsat cellulær invasion, migration og kolonidannelse i forhold til den tomme vektor kontrol (Figur 3E-G).
(A)
ZNF367
knockdown stiger celleproliferation . Y-aksen repræsenterer relative fluorescensenheder (RFU), og X-aksen angiver dage efter transfektion. * P 0,05 i forhold til den negative kontrol. Fejl- søjler repræsenterer ± SD. (B)
ZNF367
knockdown øger tumorvækst in vivo. SW13-celler blev transficeret med den negative kontrol (n = 4) og siRNA (n = 4) i den højre og venstre flanke af hver mus. Efter 48 timers transfektion, 3 × 10
6 celler blev injiceret i athymiske nøgne mus, og tumorvæksten blev målt ugentligt. Y-aksen repræsenterer tumorvolumen og X-aksen ugerne tumormåling efter flanke injektion. * P 0,05 og fejl søjler repræsenterer ± SD
ZNF367
overekspression formindsker cellulær invasion og migration.. (A) SW13, (B) BD104A, (C) TPC-1, og (D) HEK293-cellelinier. Efter transfektion blev celler udpladet i et Boyden kammer i 48 timer. Celler blev farvet og talt i 4 felter. Det venstre panel viser den repræsentative billede (12,5X) fra siRNA knockdown og negative kontrolgrupper. Højre panel viser den kvantitative måling af invaderet og migrerede celler i knockdown og den negative kontrol. * P 0,05 og fejlsøjler indikerer ± SD.
ZNF367
overekspression nedsætter koloni nummer, cellulær invasion, og migration i HEK293 celler. (E) Western blot af
ZNF367
overekspression i HEK293 og SW13 celler (Tom vektor, XL4). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (F) Repræsentant klonogene billede for celler med ektopisk
ZNF367
udtryk og dens tilsvarende kontrol (Tom vektor, XL4). (G) Cellular invasion og migration faldt med
ZNF367
overekspression i HEK293 celler. Den kvantitative måling af invaderede og migrerede celler pr gruppe (HEK293-HEK293-Empty vektor eller
ZNF367
) er repræsenteret i søjlediagrammet på højre panel. (H) Det ekstracellulære protein fastgørelse af SW13 celler med
ZNF367
knockdown. Celler blev transficeret med
ZNF367
siRNA og negativ kontrol siRNA, og blev udpladet i vedhæftning plader og inkuberet i 90 minutter. Y-aksen repræsenterer absorbansen ved 540 nm af celler adhærente til hvert protein. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM. * P 0,05, *** p. 0,001
Fordi cellulære invasion og migration kræver celle adhæsion til den ekstracellulære matrix, vi evaluerede effekten af
ZNF367
knockdown på cellulær vedhæftning til ekstracellulære matrixproteiner. Vi fandt øget cellulær adhæsion, med
ZNF367
knockdown, til laminin I (to-tre-fold høj) og fibrinogen (tre-seks gange høj) (p 0,05, figur 3H). Disse proteiner er kendt for at virke for at forbedre cellulær vedhæftning til basalmembranen eller ekstracellulær matrix gennem integrinreceptorer, som giver kræft celleadhæsion og migration.
ZNF367
regulerer ITGA3 udtryk
Vi var interesserede i at identificere genet (r) og sti (er) reguleret af
ZNF367
, da effekten af
ZNF367
på cellulær invasion, migration og vedhæftning, og fordi det er en transkriptionsfaktor forudsiges at regulere genekspression. Brug genom-dækkende mRNA-ekspression analyse i celler transficeret med
ZNF367
og negative kontrol siRNA’er, vi identificeret to kandidatgener (
ITGA3,
serpin peptidase hæmmer, clade B (ovalbumin), medlem 9 [ ,,,0],
SERPINB9
]) muligvis reguleres af
ZNF367
baseret på anvendelse af flere filter kriterier (FDR 0,25, fold-change 1,5, fælles for alle siRNA knockdown og stærk korrelation i udtryk i menneskelig tumor prøver) (fig S3).
ITGA3
blev valgt som en lovende kandidat til yderligere undersøgelse, fordi det spiller en væsentlig rolle i cellulær adhæsion og invasion og valideret til at blive opreguleret op til 2,5 gange med
ZNF367
knockdown (p 0,05, figur 4A) [11]. Desuden blev ITGA3 mRNA-ekspression omvendt korreleret med ZNF367 mRNA-ekspression i humane adrenocorticale tumorprøver (r = – 0,37, p = 0,015; Figur 4B). ITGA3 proteinekspression blev også øget med siRNA knockdown af
ZNF367
(figur 4C). På den anden side, overekspression af
ZNF367
reduceret
ITGA3
ekspression sammenlignet med den tomme vektor (figur 4D-E). Disse data tyder på, at
ZNF367
regulerer cellulær vedhæftning, invasion, og migration gennem sin virkning, i det mindste delvis, på
ITGA3
udtryk.
(A)
ZNF367
knockdown opregulerer
ITGA3
udtryk i SW13 celler. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM. (B) Sammenhængen mellem
ITGA3
ZNF367
mRNA ekspression i adrenocorticale tumorprøver. X og Y akserne repræsenterer log 2-transformerede værdier. (C) Western blot kvantificering af ITGA3 protein udtryk med
ZNF367
knockdown. (D-E) ITGA3 ekspression med ZNF367 overekspression. Fejl søjler repræsenterer ± SEM.
MIR-195 direkte henvender
ZNF367
og regulerer cellulær invasion
For at forstå den mekanisme, som
ZNF367
udtryk dysreguleret i kræft, vi postulerede, at microRNA kan være ansvarlige for
ZNF367
overekspression. For at identificere kandidat microRNA, der kan målrette
ZNF367
, vi forespørges Target scanning og miRDB databaser for microRNA forudsagt at målrette
ZNF367
. I alt 3 ud af 14 microRNA’er, forudsagde at målrette
ZNF367,
viste sig at være udtrykkes forskelligt i binyrebark carcinom (tabel S1). Imidlertid blev kun miR-195 signifikant omvendt korreleret med
ZNF367
udtryk. (R = -0,44; figur 5A)
(A) Sammenhængen mellem miR-195 og
ZNF367
ekspression i en adrenokortikalt tumor. The Pearson korrelationskoefficienten er angivet ved R med dens p-værdi. (B) Ektopisk overekspression af præ-miR-195 resultater i nedregulering af
ZNF367
.
ZNF367
mRNA-ekspression i SW13-celler transficeret med præ-MIR-195 og den før-negative kontrol ved 5 nM for 24 timer (præsenteret som en fold-ændring i forhold til den før-negativ kontrol). Fejl- søjler repræsenterer ± SEM. Højre panel viser Western blot af ZNF367 proteinet fra SW13-celler transficeret med præ-MIR-195 og den negative kontrol. (C) Pre-MIR-195 overekspression øger invasion i SW13-celler sammenlignet med den negative kontrol. Højre panel viser det gennemsnitlige antal invaderede celler på Y-aksen. (D)
ITGA3
mRNA-ekspression øges efter transfektion af miR-195 og den negative kontrol i SW13 celler. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM. (E) bindingsstedet for MIR-195 i
ZNF367
3’UTR, sammen med mutant-konstruktionen i den forudsagte frø region. I det højre panel, viser luciferaseanalyse faldt luminescens i SW13-celler co-transficeret med MIR-195 og den negative kontrol ved 5 nM, med tom vektor, vildtype
ZNF367
3’UTR eller MUT –
ZNF367
3’UTR vektor (muteret i de første tre nukleotider af frø sekvens). Luminescensen blev aflæst efter 24 timers transfektion. Y-aksen er forholdet mellem
ZNF367
3’UTR til den tomme vektor. * P-værdi 0,05 sammenlignet med den negative kontrol. Fejl søjler repræsenterer ± SEM.
For at undersøge om miR-195 regulerer
ZNF367
udtryk, celler blev transficeret med pre-miR-195 og præ-negative kontrol (præ-NC) , som viste reduceret
ZNF367
mRNA og proteinekspression (figur 5B). Desuden overekspression af MIR-195 viste forøget
ITGA3
mRNA-ekspression (to gange) og cellulær invasion sammenlignet med den negative kontrol (p 0,05, figur 5, C-D). For at bekræfte, at
ZNF367
er et direkte mål for miR-195, vi udførte luciferaseassays at bestemme, om miR-195 binder sig til 3’UTR af
ZNF367
mRNA. Vi observerede signifikant reduceret luciferaseaktivitet med miR-195 overekspression i vildtype 3’UTR i forhold til negativ kontrol og muterede
ZNF367
3’UTR-transfekterede celler (p 0,01, figur 5E). Således disse observationer tyder på, at miR-195 negativt regulerer ekspressionen af
ZNF367
ved direkte målrette sin 3’UTR, hvilket resulterer i nedsat cellulær invasion, den mest dramatiske effekt af
ZNF367 Hoteller, som vi observerede i vores funktionelle studier.
diskussion
Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at karakterisere funktionen af
ZNF367
i kræft. Vi fandt, at
ZNF367
blev overudtrykt i en række endokrine cancere (binyrebark carcinom, papillær thyroidcancer, malign fæokromocytom /paragangliom) sammenlignet med benigne og eller normale vævsprøver. Funktionel
in vitro
in vivo
Knockdown og overekspression studier viste, at
ZNF367
regulerer celleproliferation, invasion, migration og vedhæftning. Vi brugte genom-dækkende genekspression analyse for at identificere kandidatgener, der er reguleret af
ZNF367
, og vi identificeret
ITAG3
som et gen, der sandsynligvis medierer effekten af
ZNF367
på cellulær vedhæftning, invasion, og migration. Desuden, simulation analyse af menneskelig tumor prøve genom-dækkende genekspression analyse viste et omvendt forhold mellem
ZNF367
og
ITAG3
udtryk. Endelig viser vi, at dysreguleret
ZNF367
udtryk var forbundet med tabet af miR-195-ekspression i tumorprøver og at denne microRNA direkte rettet mod
ZNF367
og regulerer cellulær invasion, der giver en forståelse af den mekanisme til dysreguleret
ZNF367
udtryk. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at der er en miR-195-
ZNF367-ITAG3
akse, der regulerer endokrine kræft progression.
Dette er den første undersøgelse for at karakterisere udtryk og funktion
ZNF367
i kræft.
ZNF367
knockout i mus har vist nogen signifikante abnormiteter [12].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.