PLoS ONE: Exome Sekventering af Cell-Free DNA fra metastatiske Kræftpatienter Identificerer Klinisk Handlingsrettede Mutationer forskel fra primær sygdom

abstrakt

identifikation af de molekylære førere af kræft ved sekventering er rygraden i præcision medicin og grundlaget for personlig terapi; Men biopsier af primære tumorer giver kun et øjebliksbillede af udviklingen af ​​sygdommen og kan gå glip potentielle terapeutiske mål, især i den metastatiske indstilling. Et flydende biopsi, i form af cellefrie DNA (cfDNA) sekventering, har potentialet til at indfange inter- og intra-tumoral heterogenitet stede i metastatisk sygdom, og, via seriel blod trækker, følge udviklingen af ​​tumoren genomet.

for at bestemme den kliniske anvendelighed af cfDNA sekventering vi udførte hel-exome sekventering på cfDNA og tumor DNA fra to patienter med metastatisk sygdom; kun mindre ændringer i vores sekventering og analyse rørledninger var nødvendige for sekventering og mutation kaldelse cfDNA. Den første patient havde metastatisk sarcoma og 47 af 48 mutationer i den primære tumor blev også fundet i det cellefrie DNA. Den anden patient havde metastatisk brystkræft og sekventering identificerede en

ESR1

mutation i cfDNA og metastatisk site, men ikke i den primære tumor. Dette sandsynligvis forklarer tumorprogression på anastrozol. Betydelig heterogenitet mellem de primære og metastatiske tumorer, med cfDNA afspejler metastaser, foreslog adskillelse fra den primære læsion tidligt i tumor evolution. Dette illustreres bedst ved en aktiverende

PIK3CA

mutation (H1047R), som var klonede i den primære tumor, men helt fraværende fra enten metastaser eller cfDNA. Her viser vi, at cfDNA sekventering forsyninger klinisk handlingsrettede oplysninger med minimal risiko i forhold til metastatiske biopsier. Denne undersøgelse viser anvendeligheden af ​​hel-exome sekventering af cellefri DNA fra patienter med metastatisk sygdom. cfDNA sekventering identificerede en

ESR1

mutation, potentielt forklare en patients modstand mod aromatasehæmning, og gav indsigt i, hvordan metastatisk læsioner adskiller sig fra den primære tumor

Henvisning:. Butler TM, Johnson-Camacho K , Peto M, Wang NJ, Macey TA, Korkola JE et al. (2015) Exome Sekventering af Cell-Free DNA fra metastatiske Kræftpatienter Identificerer Klinisk Handlingsrettede Mutationer Tydelige fra Primary sygdom. PLoS ONE 10 (8): e0136407. doi: 10,1371 /journal.pone.0136407

Redaktør: Kristy L. Richards, Cornell University, USA

Modtaget: November 17, 2014 Accepteret: 4. august, 2015; Udgivet: 28 August, 2015

Copyright: © 2015 Butler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: All .bam sekventering filer findes på det Europæiske Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena) (accessionsnumre ERS700862, ERS700863, ERS700864, ​​ERS700858, ERS700859, ERS700860, ERS700861)

Finansiering.: forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

Konkurrerende interesser:. Chritopher Corless fået støtte forskning honorarer og fra Ion Torrent /ThermoFisher. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Introduktion

I 2014 var der over 500.000 kræftrelaterede dødsfald i USA.; 90% af disse dødsfald fra metastatisk sygdom. [1, 2] Mens kræft er karakteriseret ved klonal progression, metastatiske læsioner og tilbagevendende sygdom kan afvige væsentligt fra den primære tumor, husly unikke mutationer af klinisk betydning. [3] identificere disse forskelle som de dukke kræver seriel prøvetagning af tumor genomet, [4] ofte fra flere metastatiske steder, som kan have begrænsede muligheder på grund af tekniske udfordringer eller økonomiske byrde. Sekventering fra blodplasma, men har potentiale til at identificere disse ændringer uden invasiv forbundet med solide tumorer biopsier. [5-7]

Efter påvisning af mutante former af

KRAS

og

NTM

i plasmaet hos cancerpatienter har forskere forfulgt cfDNA som en form for “flydende biopsi” af en persons cancer, bruger det til at identificere onkogene ændringer i en række forskellige maligniteter. [8-14] Ændringer i cirkulerende tumor DNA (ctDNA) i løbet af behandlingen kan måles nemt via seriel prøvetagning på grund af den minimalt invasiv karakter af blod trækker. [15-19] Tidligere undersøgelser har fokuseret på kvantificering ctDNA niveauer for at måle sygdomsbyrden, [15, 19, 20] søgt efter fremkomsten af ​​resistente mutationer til specifikke behandlinger, [18, 21-23] spores tumor evolution, [18] og vurderet prognose [12, 24, 25], og tilbagefald risiko. [16] påvisning af ctDNA kræver specielt følsomme metoder på grund af sin fortynding af DNA’et fra ikke-cancerceller, med variant allel procenter så lave som 0,01% i tidlig sygdom. [12, 26, 27] undersøgelsen af ​​tumorer af varierende typer og stadier har vist, at mens ctDNA niveauer varierer betydeligt mellem prøver, metastatisk sygdom korrelerer med højere niveauer af cfDNA i plasma og en højere brøkdel af ctDNA. [6, 28] den relative overflod af cfDNA og ctDNA gør det velegnet til hel-exome sekventering [18], som, modsætning paneler med fokus på hotspot eller patientspecifikke mutationer, har potentiale til at identificere hidtil ukendte mutationer, der giver det enestående værdi i studiet af terapeutiske modstand og tumor evolution. Whole-exome sekventering fra plasma har vist høje niveauer af overensstemmelse mellem mutationer i tumor væv og cfDNA i metastatisk sygdom; Men tidligere har dette kun været vist i prøver med usædvanligt høje ctDNA niveauer (33-65% af cfDNA fra tumor oprindelse), i høj grad begrænser dens kliniske anvendelighed. [18]

I denne undersøgelse undersøgte vi mulighederne af hel-exome sekventering fra plasmaet af to patienter med metastatisk sygdom. Vi fandt, at med kun mindre ændringer i vores eksperimentelle og analytiske metoder kunne vi præcist rekapitulere tumor genomet fra plasma, identificere de samme klinisk relevante mutationer identificeret ved sekventering tumorbiopsier, og få nye oplysninger om udviklingen i sygdommen. Disse metoder var følsomme i en prøve med en gennemsnitlig ctDNA variant procentdel på 3,7%, hvilket indikerer ca. 7,4% af cfDNA var tumor oprindelse (ctDNA), tilstrækkelig lav til at identificere ctDNA for en væsentlig del af metastatiske patienter. [6, 12, 16 ] Vi konkluderer, at cfDNA sekventering af patienter med metastatisk cancer giver værdifuld indsigt til studiet og behandling af sygdommen.

Resultater

Patient # 1

En 52-år- gammel kvinde blev diagnosticeret med primær intima sarkom af lungepulsåren, der var inoperabel ved præsentationen. Patienten blev indledningsvis behandlet med stråling efterfulgt af kemoterapi (figur 1) og på dette tidspunkt hendes tumor blev screenet for onkogene mutationer under anvendelse af en multiplex massespektroskopi-baseret assay, som afslørede tilstedeværelsen af ​​

PIK3CA

R88Q og Q546R i primær tumor. [29] som et resultat, hun ind i en fase i klinisk forsøg med en PI3 kinase inhibitor og havde et partielt respons, der varede 12 måneder. Tyve måneder efter diagnosen primær tumor DNA blev screenet igen ved hjælp af en målrettet panel af en Ion Torrent PGM. Dette bekræftede de

PIK3CA

mutationer, men også afsløret

KRAS

G12R. En blodudtagning blev taget på dette tidspunkt, isolering 1 ml fibrinlag og 25 ml af plasma (tabel 1). På tidspunktet for blodopsamling havde patienten talrige læsioner i lungerne, pulmonal og lever (tabel 1). På grund af den høje koncentration af cfDNA i plasmaet (63ng /ml), blev hel-exome sekventering udført. Baseret på den

KRAS

mutation blev patienten derefter indskrevet i en fase Ib klinisk forsøg kombinerer MEK og PI3 kinase inhibitorer. Behandlingen blev standset efter otte måneder som følge af komplikationer som følge af behandling, og patienten døde 30 måneder efter den indledende diagnose.

A) Patient diagnosticeret med intimal spindel celle sarkom af lungepulsåren. Behandlinger og prøve samling er angivet i måneder.

Volumen af ​​plasma indsamlet fra enkelt blodprøve. cfDNA kvantificeres ved hjælp Quan-iT HS pico grøn kit.

Hele-exome sekventering af den primære formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) tumor afslørede 48 somatiske, exoniske mutationer (Fig 2A, tabel 2. vi har udført hel-exome sekventering af cfDNA (524X gennemsnitlig dybde) og med en tærskel på 1,5% variant allel procentdel vi identificeret 47 af de 48 somatiske mutationer i den primære. Ved disse 48 sites middelværdien sekventering dybde i cfDNA var 561X (181-1,197X). den gennemsnitlige variant allel procent på tværs af disse 47 mutationer var 3,7%, hvilket indikerer, at ca. 7,4% af plasma-DNA var tumor oprindelse. Vigtigere, vi identificeret fra plasma de aktiverende

KRAS

G12R mutation og begge aktiverende mutationer i

PIK3CA

(R88Q og Q546R). Styring til sekventering dybde, antal cfDNA mutant læser, eller variant allel procent i den primære væv ikke signifikant bedre korrelation.

a) Anvendelse af en afskæring på 1,5% variant allel procentdel, 46 af de 47 mutationer i tumoren blev identificeret i cfDNA. Estimering fra gennemsnittet variant allel procentdel på 3,8%, blev 7,5% af cfDNA afledt af tumoren. B) Femten yderligere mutationer blev kaldt i cfDNA som ikke blev kaldt i tumorprøven. Fire af disse er til stede i tumoren, men under vores kald afskæring på 10% for tumoren. Gener fremhævet med rødt lykkedes valideret via sekventering på Ion Torrent PGM. Ca. 4.000 genomer af cfDNA blev anvendt som input til de valideringer, giver os en lavere følsomhed bundet af ,025-0,5% afhængig af stedspecifikke baggrund fejlprocent.

Oversigt over sekventering info for alle ti sekventering kører. Alle læser er angivet i millioner. Tiltrædelsespartnerskaber numre for.bam filer uploadet til europæisk Nucleotide Archive forudsat, for sarkom patient alle 3 cfDNA kørsler blev kombineret i en single.bam fil adskilt af read-gruppe.

Femten yderligere mutationer blev identificeret i cfDNA . Blandt disse 11 var ikke til stede i den primære antal og fire var til stede i den primære tumor (Fig 2B), men ved allel frekvenser under vores grænse på 10% for at kalde dem i den primære tumor. Disse mutationer blev valgt til validering ved sekventering på Ion Torrent PGM hvor seks af dem blev bekræftet, otte undlod at validere, og man ikke sekvens (figur 2B). Valideringen 43% fremhæver nødvendigheden af ​​at bruge ortologe sekventering metoder bekræfter tilstedeværelsen af ​​lavfrekvente mutationer i cfDNA. cfDNA variant allel procentdel korreleret dårligt med den primære tumor (figur 3).

A) cfDNA variant allel procentdel er dårligt korreleret med Primær tumor variant allel procent.

Patient # 2

En 41-årig kvinde blev diagnosticeret med eR + HER2 + brystkræft, der havde spredt sig til lymfeknuderne. Patienten gennemgik neoadjuverende kemoterapi (TAC) efterfulgt af en bilateral mastektomi og ooforektomi (Fig 4A). Efter kirurgi, patienten undergik strålebehandling og blev behandlet med trastuzumab i et år og Anastrozole i 33 måneder, indtil opdagelsen af ​​en 4cm liver læsion og knoglemetastaser ved 11

th brysthvirvel (T11). Yderligere kemoterapi og Herceptin blev administreret, men behandlingen blev stoppet efter identifikation af levermetastaser. På dette tidspunkt indsamlet vi en blod tegne ca. 30 minutter før en leverbiopsi blev taget, og opnåede en arkiveret FFPE prøve af den primære tumor. Blodet Lodtrækningen gav 15mls af plasma ved en gennemsnitlig cfDNA koncentration af 98ng /ml (tabel 1). Efter den første plasma prøve patienten gennemgik behandling med anti-HER2 narkotika TDM1 men efter en indledende partielt respons døde 62 måneder efter den første diagnose.

A) Behandlinger og prøveindsamling angivet i måneder. B) 48 samlede somatiske mutationer blev kaldt i den primære bryst tumor og /eller levermetastaser. 38 mutationer blev kaldt i cfDNA anvendelse af en variant allel procentdel cutoff på 1,5%. Gener i rød lykkedes valideret på Ion Torrent PGM gener i blå undladt at validere gener var sorte blev ikke valideret.

Hele-exome sekventering af den primære tumor og levermetastaser afslørede i alt 48 ikke-synonyme somatiske mutationer (fig 4B, tabel 2). Sekventering af cfDNA til en gennemsnitlig dybde på 309X identificeret 38 af disse mutationer med en gennemsnitlig variant allel procentdel på 14%, hvilket indikerer ca. 28% af cfDNA var tumor oprindelse. cfDNA VAP korrelerede godt med VAP i levermetastaser (Fig 5A og 5B), men korrelerede dårligt med den primære tumor (data ikke vist). Yderligere dyb sekventering bekræftede, at en aktiverende

PIK3CA

(H1047R) mutation var kun til stede i den primære tumor, ikke i levermetastaser eller cfDNA, hvilket indikerer, at enten mutationen opstod efter metastase, eller ikke var til stede i subpopulationen der podet metastaser. Sytten yderligere somatiske ikke-synonyme mutationer blev kaldt fra plasmaprøven. En nærmere undersøgelse viste, at otte af disse (47%) var unikt for plasma, potentielt stammer fra metastatiske steder ikke samplet (Fig 5C). To af disse mutationer blev udvalgt til validering via Ion Torrent PGM, både af dem med succes valideret (Fig 5C).

A) cfDNA variant allel procentdel er korreleret med levermetastaser variant allel procent B) Maksimal parsimoni træ viser slægtskab af prøver, gren længde er antal somatiske, ikke-synonyme mutationer C) Sytten yderligere mutationer blev identificeret entydigt i cfDNA, hvoraf 9 har læser støtte dem i det primære og /eller opfyldt, men hvor der ikke kaldes på grund af utilstrækkelig sekventering dybde eller variant allel procent. Gener i rød lykkedes valideret på Ion Torrent PGM gener i blå undladt at validere gener var sorte blev ikke valideret.

Ved sekventering cfDNA fra plasma er vi i stand til at få et øjebliksbillede af tumoren , sandsynligvis fra flere metastatiske steder. Her, den høje korrelation mellem levermetastaser og cfDNA indikerer, at en betydelig information om den aktuelle tumor genomet kunne opnås uden behov for en biopsi. En mutation i

ESR1

(D538G), som har vist sig at bibringe resistens over for østrogen deprivationsbehandling, blev fundet i begge biopsier af metastaser og cfDNA. [30, 31] Denne mutation ikke var til stede i indledende exome sekvens af den primære tumor og dens fravær blev bekræftet ved efterfølgende validering sekventering af

ESR1

til en dybde på 4,272X (fig 6A). Det er sandsynligt, at modstanden af ​​tumoren til aromatase-inhibitoren Anastrozole kan forklares ved den mutante

ESR1

. Denne mutation blev bekræftet i et CLIA laboratorium og anti-østrogen receptor behandlinger blev betragtet mellem cfDNA sekvensering og patient død. I alt 15 mutationer blev udvalgt til validering på Ion Torrent PGM, 13, der blev valideret (fig 4B og 5C). En anden plasmaprøve blev taget under reaktion på TDM1 behandling (som bestemt ved CT-scanning) og otte mutationer til stede i cfDNA prøve forbehandling blev kvantificeret i løbet behandling prøve (Fig 6B). Den cfDNA prøve forbehandling, havde en gennemsnitlig variant allel procentdel på 13% på tværs af disse otte steder, mens den under behandling prøve havde en gennemsnitlig variant allel procentdel af kun 0,04% i de fire steder indeholdende mutant læser og intet påviseligt mutant læser i fire af mutationerne testet.

A)

ESR1

mutation blev sekventeret til større dybde på Ion Torrent PGM. B) Sammenligning af allel frekvenser mellem før og under-TDM1 behandling cfDNA prøver til otte mutationer til stede i forbehandling prøve.

Diskussion

I dette studie har vi vist, at hel-exome sekventering af cfDNA fra patienter med metastatisk cancer kan præcist identificere klinisk handlingsrettede mutationer, og kræver kun minimale ændringer veletablerede sekventering protokoller. Vi var i stand til at sekventere og få værdifulde data fra en plasmaprøve med en gennemsnitlig variant allel procentdel på 3,7%, meget lavere end værdierne påvist i tidligere undersøgelser, og et godt stykke under frekvenserne for en væsentlig del af metastatiske kræftpatienter. [12, 15, 16, 18, 19] Godkendelse af denne fremgangsmåde har potentiale til i høj grad udvide anvendeligheden af ​​sekventering versus biopsi-afhængige fremgangsmåder, som er i øjeblikket standarden for pleje. Mutationer i cfDNA tæt korreleret med mutationer til stede i en synkron metastase prøve, hvilket indikerer, at sekventering cfDNA kan generere et mere præcist billede af en patients metastatisk tumor genom end at lægge en biopsi af den primære tumor. Den cfDNA stramt korrelerer med tumorvæv taget på tidspunktet for erhvervelsen plasma og kan derfor bruges til at tage “snapshots” af kræft genomet. Derudover blev mutationer unikke for cfDNA fundet i både patienter, potentielt repræsenterer læsioner ikke indgik i stikprøven ved biopsi. Validering via ortologe sekventeringsmetoder bekræftet, at disse mutationer ikke var fra normalt væv eller resultatet af sekventeringsfejl og var sandsynligvis fra steder, der ikke er til stede i biopsi. Den manglende evne til at prøve alle metastatiske steder inden for en kræftpatient er en alvorlig begrænsning af de nuværende sekventering teknikker, og kan løses med minimale ændringer til standard sekventering procedurer ved hjælp cfDNA.

De to patienter i dette studie havde høje niveauer af cfDNA i deres plasma (tabel 1), som tilladt os at bruge over 100 ng cfDNA at konstruere vores sekventering biblioteker. Men for mange patienter en koncentration på 10 ng cfDNA pr ml plasma er mere typisk, hvilket indikerer, at multiple blod draws er nødvendige for at få tilstrækkeligt materiale til sekventering. At indse dette, vi vedtog metoderne i den Capp-Seq papir fra Diehn lab [19], der tillader biblioteker skal gøres mere effektivt, kræver mindre indledende input DNA. Ved hjælp af disse metoder vi med succes fremstillede komplekse biblioteker fra mindre end 40 ng af cfDNA og med succes sekventeret ~ 25% af input DNA-molekyler (i modsætning til den effektivitet ~ 1% opnået i vores undersøgelse). Denne forbedring har tilladt os at sekventere tilstrækkeligt cfDNA for næsten alle vores fag.

En anden fordel ved sekventering cfDNA er evnen til at sekventere serielt-indsamlet og minimalt invasive plasmaprøver, der giver mulighed for nær real-time overvågning af tumor-genomet under behandlingen. Identifikationen af ​​nye mutationer kan give behandlinger skal startes eller stoppes, så snart tumor miljø gør det fordelagtigt. I tilfælde af patientens # 2, er det muligt, at seriel cfDNA sekventering ville have identificeret fremkomsten af ​​

kan ESR1

mutation og behandling er blevet justeret fra østrogen deprivationsbehandling (Anastrozol) til en målretning af østrogen receptor selv (

e

g

Fulvestrant..): dette skift, og potentielt andre kan have forsinket progression af sygdommen. Ud over at se efter kendte resistensmekanismer, arten af ​​hel-exome sekventering muliggør identifikation af nye tilbagevendende resistensmekanismer i en kohorte af patienter, der gennemgår den samme behandling, som ikke kan indgå i en målrettet panel. Især under reaktionen af ​​patienten # 2 til TDM1 var der en dramatisk reduktion i niveauet af ctDNA, hvilket gør det næsten ikke kan påvises ved vores sekventering tilgang. Overvågning via exome sekvens i sådanne perioder kræver ekstremt høj sekventering dybde, hvilket ville være uoverkommeligt dyre med de nuværende sekventering omkostninger.

En væsentlig fokus er blevet placeret på den sekventering af primære tumorer og massive sekventering projekter (TCGA

et al

.

)

har afsløret en betydelig mængde information om driver mutationer i en række forskellige kræftformer. Men metastatiske tumorer, som er ansvarlige for de fleste patientgrupper dødsfald, er forholdsvis dublerede. Ved sekventering primære tumorer sammen med serielt indsamlede plasmaprøver er det muligt at overvåge metastatisk progression på et genomisk niveau. I patient # 2 observerede vi en aktiverende

PIK3CA

mutation i den primære tumor, der ikke var set i hverken levermetastaser eller cfDNA. Det er sandsynligt, at enten

PIK3CA

mutation blev klonale efter den metastatiske proces eller at mutationen ikke var til stede i den metastatiske klon; uanset, kan behandling med en PI3K-inhibitor har været effektive i faldende den primære læsion, men ville have været ineffektive mod nogen af ​​fjernmetastaser. I modsætning hertil sekventering af patient # 1 viste, at cfDNA delt indeholdt næsten alle de identificerede mutationer i den primære tumor. Mens vi var ude af stand til at få en prøve af metastase, det lave antal mutationer unikt for cfDNA betyder det ikke urimeligt at antage, at der var relativt få forskelle mellem metastaser og primære tumor. Sekventering cfDNA fra større kohorte af patienter kan hjælpe os med at forstå, hvordan metastatisk progression varierer i forskellige tumortyper og kan identificere terapeutisk relevante mønstre. Den kliniske anvendelighed af denne metode vil i høj grad afhænge systematisk tildeling af målrettede behandlinger til identificerede cfDNA mutationer.

Især tjenester til cfDNA sekventering bliver kommercielt tilgængelige, men er baseret på panelerne, og derfor har begrænset anvendelighed i en forskning indstilling. Vi demonstrerer her, at der er betydelig værdi af hel-exome sekventering fra cfDNA.

Materialer og metoder

Patient indskrivning

Skriftligt samtykke blev opnået fra to patienter med metastatisk cancer for indskrivning i denne undersøgelse. procedurer Undersøgelsen og samtykke blev godkendt af Oregon Health Science University Institutional Review Board og i overensstemmelse med føderale og institutionelle retningslinier. Op til 40 ml blod blev opsamlet i EDTA-rør. Plasma blev isoleret som tidligere [16] beskrevet og opbevaret ved -80 ° C indtil cfDNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid (Qiagen). Buffy coat blev isoleret fra den samme blodprøve og DNA blev ekstraheret under anvendelse af DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Som en del af den førnævnte procedure undersøgelse og samtykke, blev FFPE væv fra patientens primære tumorer erhvervet fra arkiverede patologi prøver. Patient # 1 stikprøve blev erhvervet fra University of Washington Patologi Institut i Seattle, WA (https://www.pathology.washington.edu/clinical/dermpath/contactinfo). Patient # 2 stikprøve blev erhvervet fra Compass Oncology i Vancouver, Washington (https://compassoncology.com). FFPE væv blev ekstraheret under anvendelse af DNA FFPE Tissue kit (Qiagen). Den samme patients levermetastaser blev taget fra en frossen kerne biopsi og ekstraheret med DNeasy Blood Tissue kit (Qiagen).

Whole-exome sekventering

Mindst 100 ng cfDNA og 0.3-2μg af DNA fra fibrinlag og tumorvæv blev brugt til at skabe sekventering biblioteker. Agilent SureSelect XT reagenser og protokol blev anvendt til fremstilling sekventering biblioteker. DNA fra fibrinlag og tumorvæv blev sonikeret til en gennemsnitlig størrelse på 150bp anvendelse af en Covaris E220. Plasma-DNA-prøver blev ikke sonikeret som plasma-DNA allerede er stærkt fragmenteret. Hybrid fange blev udført ved hjælp af Agilent SureSelectXT Menneskelig Alle Exon V4 + UTR’er. 100bp parret ende sekventering blev udført på en Illumina HiSeq 2000. En hel bane var dedikeret til sekventering plasma DNA-prøver og alle andre biblioteker blev sekventeret to-til-en-sporet. For at maksimere sekventering dybde og undgå PCR dubletter, øgedes plasma prøve fra patienten med metastatisk sarkom lavet i tre separate biblioteker, hver sekventeret på en fuld bane hver, hvilket giver en gennemsnitlig sekventering dybde 1,034X. Kun et enkelt bibliotek var nødvendig for at opnå tilstrækkelig dækning af cfDNA for patienten # 2.

Bioinformatik analyse

For at detektere mutationer vi justeret HiSeq parret ende læser med hg19 menneskelig henvisning genom ved hjælp BWA. [32] Vi brugte BWA ALN at finde koordinaterne for input læser og derefter bruges BWA mem for at generere linjeføringer i en sam-format. Vi konverterede sam format til bam (binært) format ved hjælp Samtools import. Efter sortering og indeksering af læser i bam formateret fil, bruger vi Picard Tools [33] MarkDuplicates at fjerne dublerede læser genereres under PCR-amplifikation etape: fjernelse sker ved at finde alt lyder som har identiske 5 ‘koordinater og holde kun læse par med den højeste basen kvalitet beløb. . Efter to eksemplarer fjernelse vi udrettet læser omkring SNVs og indels hjælp af GATK Software Library [34, 35] De tre biblioteker i sarkom patient blev kombineret efter PCR duplikere fjernelse: lokale positioner for at målrette til kursjustering blev kaldt hjælp RealignerTargetCreator og læser blev udrettet hjælp IndelRealigner. Endelig blev kvalitetsresultater kalibreres. Dette blev gjort ved hjælp GATK BaseRecalibrator og PrintReads, som arkiveret lodret læser baseret på den oprindelige kvalitet score, jo dinukleotid, og position i læsning. Sekventering statistik er opsummeret i tabel 2 og blev genereret ved hjælp Samtools flagstat, GAKT DepthOfCoverage, og Bedtools pairToBed.

At kalde mutationer vi sammenlignede de tumor prøver med de normale prøver ved hjælp muTect v1.1.4 hjælp buffy coat som en matchet normal [36] Varianter blev anset somatiske mutationer, hvis:. (a) de ikke var til stede i dbSNP databasen (undtagen hvis varianten var også i COSMIC database fx

KRAS

PIK3CA

mutationer), (b) der var ≥30x sekventering dybde på dette sted i tumoren /plasmaprøven og ≥10x sekventering dybde i matchede normale prøve, (c) det havde en variant allel procentdel af ≥10% for tumorprøverne og ≥1.5% for plasmaprøver, og (d) der var mindst to læser indeholder variant allel. Mutationer i cfDNA blev derefter yderligere filtreret ud, hvis den matchede normale havde 1 læse støtter mutation eller mutationen kun var til stede i en streng af cfDNA. Virkningen af ​​varianter blev kontrolleret ved hjælp Mutation Assessor v2 (www.mutationassessor.org).

Mutation validering

Primere blev designet til at dække et udvalg af mutationer identificeret i hver patient og derefter bruges til PCR forstærke buffy coat, plasma, og tumor-DNA-prøver fra både patienter. For hver prøve blev ampliconer poolet i ækvimolære mængder og 10-100 ng blev anvendt til bibliotek skabelse hjælp af Ion Xpress Plus Fragment Library Kit. Sekventeringstemplates blev dannet ved anvendelse emulsion PCR på Ion OneTouch 2 under anvendelse af Ion PGM Template OT2 200 kit. Op til seks stregkodede prøver blev multiplexet på Ion 316 v2 chips. Sekventering blev udført på en personlig Genome Machine (PGM) sequencer (Ion Torrent) ved anvendelse af Ion PGM 200 v2 sekventeringskit. Torrent Suite softwareversion 4.0.2 blev ansat til at tilpasse læser til hg19. Læser blev visualiseret ved hjælp IGV v 2.2.32 (Broad Institute) og variant allelfrekvenserne blev bestemt for websteder tidligere identificerede via Illumina sekventering.