PLoS ONE: Hæmning af StearoylCoA desaturaseaktivitet Blocks cellecyklusprogression og inducerer programmeret celledød i Lung Cancer Cells

Abstrakte

Lungekræft er den hyppigste form for kræft. Den overlevelsesraten for patienter med metastatisk lungekræft er ~ 5%, dermed alternative terapeutiske strategier til at behandle denne sygdom er kritisk behov for. Nylige undersøgelser tyder på, at lipid biosynteseveje, især fedtsyresyntese og desaturering, er lovende molekylære mål for cancerterapi. Vi har tidligere rapporteret, at inhibering af stearoylCoA desaturase-1 (SCD1), det enzym, der producerer monoumættede fedtsyrer (MUFA), svækker lungecancer celleproliferation, overlevelse og invasionsevne, og dramatisk reducerer tumordannelse i mus. I denne rapport, viser vi, at hæmning af SCD-aktivitet i humane lunge kræftceller med lille molekyle SCD hæmmer CVT-11127 reducerede lipid syntese og nedsat spredning ved at blokere udviklingen af ​​cellecyklus gennem G

1 /S grænsen og ved udløser programmeret celledød. Disse ændringer, der følger af SCD blokade var fuldt tilbageført ved enten oliesyre (18: 1n-9), palmitoleinsyre (16: 1n-7) eller cis-vaccensyre (18: 1n-7) godtgøre, at cis-MUFA er vigtige molekyler til cancercelleproliferation. Derudover co-behandling af celler med CVT-11127 og CP-640.186, en specifik acetylCoA-carboxylase (ACC) inhibitor, forstærkede ikke vækstinhiberende virkning af disse forbindelser, hvilket antyder, at inhibering af ACC eller SCD1 påvirker et tilsvarende mål kritisk for celle proliferation, sandsynligvis MUFA, den fælles fedtsyre produkt i reaktionsvejen. Denne hypotese blev yderligere forstærket af den iagttagelse, at eksogene oliesyre vender anti-vækst effekt af SCD og ACC-hæmmere. Endelig exogen oliesyre genoprettede globalt nedsatte niveauer af celle lipider i celler, der undergår en blokade af SCD-aktivitet, hvilket indikerer, at aktiv lipidsyntese kræves for fedtsyresammensætningen-medieret genopretning af proliferation i SCD1 inhiberet celler. Tilsammen disse observationer tyder på, at SCD1 styrer cellecyklusprogression og apoptose og dermed den samlede sats for proliferation i kræftceller via MUFA-medieret aktivering af lipid syntese

Henvisning:. Hess D, Chisholm JW, Igal RA (2010) Hæmning af StearoylCoA desaturaseaktivitet Blocks cellecyklusprogression og inducerer programmeret celledød i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 5 (6): e11394. doi: 10,1371 /journal.pone.0011394

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget 11. april 2010; Accepteret: Juni 2 2010. I Udgivet: 30 juni 2010

Copyright: © 2010 Hess et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af midler fra School of Environmental og Biologisk Institut og Johanna og Charles Busch Foundation, Rutgers University og en Hatch tilskud fra det amerikanske Department of Agriculture. Gilead Sciences Inc. forudsat CVT-11127 til støtte for undersøgelser og JWC bidrog videnskabeligt til fortolkningen af ​​data og skrivning af manuskriptet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. JWC er en medarbejder og aktionær i Gilead Sciences Inc. (Palo Alto) og en opfinder på SCD relateret patent og flere SCD patentansøgninger.

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft er den hyppigste dødsårsag ved kræft i den udviklede verden. Det 5-års overlevelse er -15% for patienter med lungekræft, og falder til ~ 5% hos personer med metastatisk kræft [1], er der behov derfor nye terapeutiske metoder baseret på nye molekylære mål. I de senere år har undersøgelser vist, at konstitutiv aktivering af lipid biosyntese, især syntesen af ​​mættet (SFA) og monoumættede fedtsyrer (MUFA), er en kritisk begivenhed i carcinogenese [2], [3], hvilket antyder, at lipogene veje kan være værdifulde mål for kræft intervention. SCD er en familie af Δ9-fedtsyredesaturase-isoformer, der konverterer SFA i MUFA [4]. To isoformer er til stede i mennesker; SCD1, som er udtrykt i de fleste voksne væv, og SCD5, som er overudtrykt i embryo væv og voksne hjerne [5], [6]. Det er blevet vist, at malign transformation i lungecancerceller positivt korreleret med SCD1 aktivitet og ekspression [7]. Endvidere når flere cancercellelinier blev screenet med et siRNA-bibliotek mod 3.700 gener til at identificere egnede mål til induktion cytotoksicitet og celledød, SCD1 var et af de vigtigste mål identificeret [8]. I lungekræft celler, ophævelse af SCD1 genekspression fører til forringet de novo lipid syntese, en nedsat celleproliferation, et tab af forankringsuafhængig vækst og højere ceramid-uafhængig apoptose [9]. Disse resultater kraftigt implicerer SCD1 i reguleringen af ​​spredning, invasionsevne og overlevelse af kræftceller.

SCD1 spiller også en central rolle i tumor dannelse og vækst. Hos mus, baggrundsniveauet for SCD1 udtryk korrelerer med disposition for leveren carcinogenese; gnavere med højere niveauer af SCD1 er mere modtagelige for induktion af cancer [10]. Under anvendelse athymiske “nøgne” mus, demonstrerede vi for første gang at lungekræft celler med reducerede niveauer af SCD1 udviser en kraftig nedsat kapacitet for tumordannelse og progression af tumorvækst, hvilket tyder på, at SCD1 er en kritisk faktor i tumorigenese [11] .

Vi har tidligere rapporteret [9], [11], [12], at SCD1, ved at konvertere SFA i MUFA, regulerer kræftcelle lipogenese ved: i) at opretholde ACC i sin aktivere tilstand selvom omdannelsen af ​​mættede acylCoAs som er allosteriske inhibitorer af ACC til MUFA; ii) fremme dephosphoryleringen og inaktivering af AMPK, den vigtigste kræftcellen brændstof sensor, der er rettet mod ACC til phosphorylering /inaktivering; og iii) induktion aktiveringen af ​​Akt pathway, som aktiverer ekspressionen af ​​vigtige lipogene enzymer [3]. Mens disse resultater klart understøtter SCD1 som en central regulator af lipogenese i kræftceller, de ikke fuldt ud forklare hvordan SCD1 og lipogenese interagere i reguleringen af ​​kræft celle mitogenesen og transformation.

Målet med dette studie var at undersøge rolle SCD1 i modulering cellecyklusprogression. Ved hjælp af en ny lille molekyle hæmmer af SCD-aktivitet, vi fastslået, at akutte farmakologiske hæmning af SCD1 i lungeceller blokerer passagen af ​​cykling celler fra G

1 til S-fasen og inducerer indgangen til celler i programmeret celledød. Endvidere i celler inkuberet med et lille molekyle inhibitor for ACC, en hastighedsbegrænsende lipogenisk enzym, der er moduleret af SCD1 aktivitetsniveauer, lignende ændringer i celleproliferation blev observeret. I overensstemmelse med fedtsyresyntese er det fælles mål pathway, var der ingen synergistisk cytostatisk virkning, når celler blev inkuberet med både en ACC og SCD-inhibitor.

Materialer og metoder

Materialer

AG01518 normale humane hudfibroblaster blev opnået fra Coriell (Camden, NJ). H460 humane lungeadenocarcinoma celler var fra ATCC (Manassas, VA). Celledyrkningsmedier og andre kultur reagenser var fra Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). [6-

3H] thymidin var fra American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO). Ultrafiltreret føtalt bovint serum (FBS), fedtsyre-fri bovint serumalbumin (BSA), muse-anti-β-actin monoklonalt antistof, blev anti-muse-IgG-peroxidasekonjugat, phosphatase og protease inhibitor cocktail købt fra Sigma (St. Louis, MO ). Cyclin D1 og cdk6 antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Cellekultur forsyninger, silicagel 60 kromatografiplader og analytisk kvalitet opløsningsmidler var fra Fisher Scientific, (Morris Plains, NJ). CP-640.186 blev venligst doneret af Donnie Owens, Pfizer.

Cellekultur

Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (10 ug /ml), 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% MEM vitamin opløsning (vækstmedium), ved 37 ° C, 5% CO

2, og 100% fugtighed.

Celleproliferationsassay

Cell spredning blev bestemt i normale humane fibroblaster og H460 cancerceller ved Crystal violet assay [12]. Kort fortalt blev cellerne fikseret med methanol, farvet med 0,1% krystalviolet i destilleret vand og skylles tre gange med vand. Farvestoffet i de farvede celler blev solubiliseret i 10% methanol, 5% eddikesyre-opløsning og kvantificeres ved spektrofotometri ved 580 nm. Værdien af ​​en tom brønd blev trukket i hvert tilfælde. Resultaterne blev udtrykt som procentvis ændring i celleproliferation med hensyn til OD-værdier af vehikel-behandlet kontrol (100%). I disse celler blev SCD1 aktivitet ophævet ved inkubation med lille molekyle SCD-inhibitor CVT-11127 [13]. Ved de anvendte koncentrationer i forsøg, CVT-11127 hæmmede SCD1 aktivitet mere end 95% [12]. Celler blev også behandlet med 20 pM CP-640.186, en potent inhibitor af ACC-aktivitet [14]. Celler blev inkuberet med inhibitorerne i 48 timer eller mere for at give mulighed for mindst én population fordobling. Til nogle eksperimenter blev eksogene fedtsyrer kompleksbundet med BSA (forhold 02:01) sættes til inkubationsmediet.

Bestemmelse af cellecyklusfordeling

For at bestemme fordelingen af ​​cellepopulationer i forskellige faser af cellecyklus blev H460-celler behandlet med enten 1 uM CVT-11127, 20 uM CP-640.186, eller DMSO-vehikel i 48 timer. Grupper af celler blev inkuberet i parallel med 100 pM fedtsyrer kompleksbundet med BSA. Ved udgangen af ​​inkubationer blev celler opsamlet og behandlet med 50 pi RNase I (1 mg /ml) og farvet med 5 ul propidiumiodid (1 mg /ml). Procentdelen af ​​celler i cellecyklusfaser blev analyseret ved fluorocytometry

Bestemmelse af apoptose ved DNA-fragmentering assay

Bestemmelsen af ​​DNA fragmentation sats blev udført som beskrevet af Scaglia Igal [11]. Kort fortalt blev DNA i prækonfluerende celler mærket med 0,4 uCi [

3H] thymidin i regelmæssig vækstmedium i 24 timer. Medium blev derefter fjernet, cellemonolagene blev vasket to gange med PBS ved 37 ° C, og cellerne fik lov at vokse i 24 timer i nærvær af 1 uM CVT-11127 eller vehikel. Grupper af celler blev suppleret med oliesyre. Efter behandling blev jagten medium indeholdende løsrevne apoptotiske celler opsamles og [

3H] radioaktivitet blev bestemt i en scintillationstæller. Cellemonolag blev lyseret i PBS med 1% Triton-X100 og 0,2 pM EDTA og sedimenteret ved centrifugering. Radioaktivitet blev kvantificeret i supernatanten indeholdende fragmenterede [

3H] DNA, og i pelleten indeholdende intakt cellulært DNA. Pelleten blev vasket og resuspenderet i 1% Triton-X100 og 0,2 pM EDTA. Procentdelen af ​​fragmenteret [

3H] DNA blev anslået efter følgende beregning:. (Chase medium DPM + supernatant DPM) /total DPM

Cell lipid udvinding og analyse

Cell lipider blev ekstraheret følge fremgangsmåden ifølge Bligh Dyer [15]. Total phospholipider og individuelle neutrale lipider blev separeret ved tyndtlagskromatografi (TLC) som beskrevet i Scaglia og Igal [7]. Lipid pletter på TLC-pladen blev farvet med jod dampe, fotograferet og deres relative indhold blev kvantificeret ved optisk densitometri i Bio-Rad Chemidoc digitalt billede system ved hjælp QuantityOne software.

Resultater

SCD1 styrer passage af H460-celler via G

1 /S grænsen af ​​cellecyklussen

Tidligere undersøgelser fra vores laboratorium fastslået, akut og kronisk udtømning af SCD1 i cancerceller resulterede i nedsat celleproliferation [9], [ ,,,0],11], [12]. For bedre at forstå den mekanisme, hvormed SCD1 inhibering forringer cellevækst, blev H460 lungeadenocarcinom celler inkuberet med 1 uM CVT-11127, en hidtil ukendt lille molekyle inhibitor for SCD1, i serum-holdige medier i 48 timer og cellecyklusprogression blev analyseret ved flow- cytometri (fig. 1A). Det blev observeret, at populationen af ​​celler i S-fase blev reduceret med -75% med CVT-11127 behandling, når sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller, hvilket indikerer, at SCD1 inhibering specifikt mål progressionen af ​​cellecyklussen på niveauet for den syntetiske fase . En samtidig stigning i populationen af ​​SCD1-mangelfulde celler i G

1 fase blev også påvist, mens der ikke var nogen ændringer i procentdelen af ​​celler i G

2 /M-fasen. Men i celler inkuberet med SCD inhibitor i serum-deficiente medier, et fald -50% i celler i G

2 /M-fasen blev også observeret (data ikke vist), hvilket antyder, at identificerede komponenter i serum, eventuelt MUFA holdige lipider, var i stand til at opretholde passage af SCD1-defekte celler gennem mitose. Samlet set indikerer disse resultater, at cykling celler med en blokade i SCD1 aktivitet ikke var i stand til fremskridt gennem de tidlige faser af cellecyklus. Eksogene oliesyre markant vendt cellecyklus ændringer produceret af SCD1 hæmning viser den afgørende betydning af MUFA til cellecyklusprogression.

I H460 lungekræft celler behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT) eller DMSO i 48 timer, i nærvær eller fravær af 100 uM oliesyre (Ole), blev fordelingen af ​​celler i cellecyklusfaser bestemt ved fluorocytometry (A), blev niveauer af cyclin D1, CDK6 og β-actin vurderes ved Western blot (B), og hastigheden af ​​apoptose blev bestemt ved niveauet af fragmenteret [

3H] thymidin-mærkede DNA (C). *, P 0,05 eller mindre vs. vehikelbehandlede celler; **, P. 0,05 eller mindre vs EVU-behandlede celler, ved Students t-test

Niveauerne af pattedyr cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK’er) især svinger i løbet cellecyklusprogression. Cycliner D og CDKer er vigtige determinanter i passagen af ​​cellecyklus gennem G

1 fase, forbi begrænsningen punkt og ind i S-fasen. Efter at have observeret, at den farmakologiske ablation af SCD1 fremmet en ændring i progressionen G

1 → S, bestemte vi niveauet af cyclin D1 og CDK6 sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller. Vi observerede, at efter behandling celler i 48 timer med SCD1 inhibitor, cancerceller udviste et markant fald i indholdet af både cyclin D1 og CDK6 (fig. 1B). Inkubation af SCD1-udtømte celler med oliesyre normaliseret niveauerne af begge proteiner bekræfter, at MUFA er afgørende molekyler i reguleringen af ​​cellecyklussen.

Siden kapaciteten af ​​kræftceller at unddrage programmeret celledød bidrager også til hastigheden af ​​cancercelleproliferation, kan virkningerne af oliesyre på genoprettelse af celleproliferation i nærvær af en SCD1 inhibitor skyldes til dels, at undertrykkelse af apoptose. Vi bestemte derfor hastigheden af ​​DNA-fragmentering, en typisk markør af apoptose i celler behandlet med CVT-11127 eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær af 100 uM oleinsyre. Som vist i fig. 1C, fragmentering af DNA blev forøget med 2,2 gange i SCD1-ablateret celler sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer, at SCD1 er en vigtig overlevelsesfaktor i cancerceller. Vi observerede også, at exogent oliesyre reducerede niveauet af fragmenteret DNA i SCD1-deficiente celler til kontrolværdier, antyder, at denne fedtsyre eller en fedtsyre produkt af SCD1 er afgørende for forebyggelse af apoptose i cancerceller. Salg

Cis -MUFA redning celleproliferation hæmmes af SCD1 inhibering

Vi har tidligere vist, at de anti-proliferative virkninger af CVT-11127 (1 uM) kunne vendes ved oliesyre [12]. Imidlertid er virkningen af ​​andre SCD produkt fedtsyrer ikke blevet undersøgt. I H460 lungecancerceller, fandt vi, at palmitolein (16: 1 n-7) og cis-vaccensyre syrer (18: 1N 7), som oliesyre fuldstændigt vendt anti-proliferative effekt af CVT-11127 (. Fig 2A) . Men når H460 celler blev inkuberet med eller uden 1 pM CVT eller DMSO i 48 timer i nærvær af enten 100 uM myristinsyre (14: 0), palmitinsyre (16: 0), heptadecansyre (17: 0), eller stearinsyre (18 :. 0) (fig 2B), observerede vi, at alle SFA, med undtagelse af heptadecansyre, en ikke-naturlig fedtsyre, augmented anti-proliferative effekt af SCD-inhibitoren, hvorimod SFA havde nogen antiproliferativ virkning i celler behandlet med vehikel. Desuden kunne den anti-proliferative virkning af både SCD1 hæmning og stearinsyre overvindes ved co-inkubering med oliesyre. Tilsammen disse observationer viser klart, at både endogen og exogen SFA er cytotoksiske i fravær af enten SCD at producere MUFA eller exogent tilsat MUFA.

A blev H460 lungecancerceller behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT ) eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær af 100 uM cis-MUFA palmitoleinsyre (Pol), oliesyre (Ole) eller cis-vaccensyre; og celleproliferation blev bestemt ved Crystal violet farvning. Proliferation blev ligeledes vurderet i H460-celler, som blev behandlet med 1 uM CVT-11127 (CVT) eller DMSO i 48 timer i nærvær eller fravær af 100 uM SFA myristinsyre (Myr), palmitinsyre (Pal), heptadecansyre (Hep) eller stearinsyre ( Ste) syrer (B) eller 250 pM Pal, plus eller minus 250 uM Ole eller elaidinsyre (Ela) (C). Grupper af DMSO og CVT-behandlede celler blev inkuberet med 2 ug /ml tunicamycin i nærvær eller fravær af 100 uM oliesyre i 48 timer og cellevækst blev bestemt (D). *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; **, P. 0,05 eller mindre vs fedtsyre-behandlet kontrol ved Students t-test

Som vist i fig. 2C, når CVT-behandlede celler eller deres kontroller blev inkuberet med 250 pM palmitinsyre celleproliferation faldt endnu længere end i celler med en blokade i SCD1 og inkuberet med 100 pM palmitinsyre. Imidlertid var den cytotoksiske virkning af meget høj palmitinsyre fuldt forebygges med oliesyre men kun delvist med 250 pM af den trans-MUFA elaidinsyre, hvilket antyder, at kun cis-MUFA er funktionelt egnet til at modvirke den cytotoksiske virkning af høje niveauer af SFA.

for at bestemme om MUFA giver bred beskyttelse mod cytotoksicitet, vi bestemt evne oliesyre at overvinde den anti-vækst effekt af tunicamycin, en forbindelse, der fremmer celle stress og apoptose ved at hæmme proteinglycosylering. Tunicamycin faldt celleproliferation med 80% i både CVT og vehikelbehandlede cancerceller, hvorimod tilsætning af oliesyre kunne ikke gendanne proliferationen af ​​SCD1-inhiberede celler (fig. 2D). Denne observation understreger, at den beskyttende virkning af SCD1 mod SFA-cytotoksicitet i kræftceller resultater fra dens specifikke aktivitet i fedtsyren biosyntesevejen og ikke generel cytobeskyttende aktivitet.

Blokade af SCD1 aktivitet med CVT-11127 svækker spredning af H460 cancerceller, men ikke normale humane fibroblaster

i tidligere undersøgelser, vi rapporteret, at spredning af normale humane hudfibroblaster ikke var svækket af SCD hæmning [12]. Imidlertid er det muligt disse celler er resistente over for virkningerne af SCD-inhibering og skal inkuberes i en længere periode med inhibitoren eller med en højere koncentration af inhibitor. At se på effekten af ​​inkubationstiden og inhibitor koncentration, blev normale humane fibroblaster inkuberet i 96 timer, tid nok til at sikre mindst en befolkning fordobling, med en og to uM CVT-11127 i medium indeholdende 10% FBS. Som vist i fig. 3A, inkubering med SCD inhibitoren påvirkede ikke proliferationen af ​​disse celler. Men tilsvarende betingelser fuldstændig blokeret (98%) væksten af ​​H460 celler (fig. 3B). Både normale og cancerceller blev behandlet med SCD inhibitor i serum-deficiente medier og virkningen af ​​SCD-inhibitoren på cellevækst var uafhængig af tilstedeværelsen af ​​serum (data ikke vist). Det faktum, at fibroblaster var helt manglende respons på den cytostatiske virkning af SCD-inhibitor antyder, at ikke-cancerceller har en mindre krav til endogent produceret MUFA end cancerceller.

Cellevækst blev bestemt i AG01518 normale humane fibroblaster (A ) i nærvær af 1 og 2 uM CVT-11127 i 10% FBS DMEM eller vehikel i 96 timer. H460-celler (B) blev behandlet med 1 pM CVT-11127 eller vehikel i 96 timer. Celleproliferation rate blev vurderet ved Crystal violet farvning. *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; af Students t-test.

Aktiv de novo lipid syntese er nødvendig for fedtsyre-medieret vending af anti-proliferative effekt af SCD1 hæmning

Vi har rapporteret, at hæmning af SCD1 reducerer lipogenese, i det mindste delvist ved at inaktivere det hastighedsbegrænsende lipogenisk enzym ACC-α og at nedsat lipogenese kan bidrage til lav proliferation med SCD1-poleres celler [12]. At undersøge forholdet mellem SCD1, ACC og lipogenese i cancercelleproliferation behandlede vi H460 celler med CP-640.186, en specifik inhibitor af ACC, ved en koncentration på 20 uM, som inhiberer mere end 95% af enzymaktiviteten [14]. Som vist i fig. 4A, inkubering af celler med ACC inhibitoren i 48 timer førte til et fald -30% i celletal sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterede undersøgelser [16], [17]. Den cytostatiske virkning af ACC blokade var reversibel ved både 100 uM palmitinsyre og 100 uM oliesyre (fig. 4A) antyder, at ACC-aktivitet regulerer celleproliferation ved at levere fedtsyrer til lipidbiosyntese. Den væksthæmmende virkning af ACC inhibering blev forårsaget af en blokeret cellecyklusprogression da der var en signifikant reduktion i populationen af ​​celler i S- og G

2 /M faser og en samtidig stigning i celler i G

0 /G

1 med hensyn til kontroller (fig. 4B). Eksogene oliesyre havde en markant effekt på at genoprette cellecyklus profil ACC-udtømte celler, der ligner effekten på SCD1 hæmmede celler forstærkende konceptet, at det endelige metaboliske formål med den samordnede aktivering af ACC, FAS og SCD1 observeret i cancerceller er produktionen af ​​MUFA.

H460 lungecancerceller blev behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT), 10 uM CP-640.186 eller begge i nærvær eller fravær af 100 uM palmitinsyre (Pal) eller oliesyre ( ole) (A), og celleproliferation blev vurderet efter 48 timer. Fordeling af celler i cellecyklus faser blev bestemt ved fluorocytometry i celler inkuberet med CP-640.186 plus eller minus 100 uM oleinsyre og (B). Cancercelleproliferation blev også bestemt ved behandling med 1 uM CVT-11127 (CVT), 20 uM CP-640.186, eller begge i nærvær eller fravær af 100 uM palmitinsyre (Pal) eller oliesyre (Ole) (C), og i celler behandlet i 48 timer med 1 pM CVT-11127, 25-hydroxycholesterol eller begge, plus eller minus 100 uM oliesyre (D). I alle eksperimenter kontrolceller modtog ækvivalente volumener af DMSO-vehikel. *, P 0,05 eller mindre i forhold til DMSO; **, P 0,05 eller mindre i forhold til CVT-behandlet kontrol ved Students t-test

Interessant, co-behandling med CVT-11127 og CP-640.186 forstærkede ikke vækstinhiberende virkning. hver af disse forbindelser, hvilket antyder, at hæmning af enten ACC eller SCD1 påvirker et fælles produkt af vejen. Da SCD1 er senere i fedtsyren biosyntesevejen, MUFA er fedtsyren kritisk for celleproliferation. Faktisk, i celler inkuberet med både ACC og SCD1 inhibitorer, oliesyre var i stand til fuldt genoprette den lave celleproliferation på H460 celler til kontrolværdier. Disse data understøtter kraftigt den konklusion, at MUFA er den funktionelle slutprodukt (er) af fedtsyrebiosyntese, der kræves til cancercellevækst.

lipidbiosyntese i pattedyrceller styres af transkriptionelle faktorer SREBP-1a og SREBP -1c, som er centrale regulatorer af fedtsyre og phospholipid syntese i pattedyrceller [18], [19]. Induktion af lipogenese i humane ikke-transformerede og cancerceller kræver SREBP-1-aktivering [20] – [22], derfor har vi bestemt effekten af ​​nedregulering af lipogenese ved SREBP-1 inaktivering på celle-spredning. H460-celler blev inkuberet med SCD1 inhibitoren i 48 timer i nærvær eller fravær af 25-hydroxycholesterol, en potent inhibitor af SREBP-1-aktivering og spaltning med SCAP [19]. Inkubering med 25-hydroxycholesterol alene påvirkede ikke cancercelleproliferation imidlertid co-behandling af celler med hydroxysterol og CVT-11127 fremmet en mere dybtgående vækstinhiberende virkning end med SCD1 inhibitor alene, en virkning sandsynligvis på grund af en potensering af anti -lipogenic aktivitet af begge inhibitorer (fig. 4D). I overensstemmelse med vores tidligere observationer, 100 uM oliesyre var tilstrækkelig til at overvinde de cytostatiske effekter af både SCD1 inhibering og kombineret SCD1 inhibering og nedregulering af lipidsyntese, hvilket yderligere bekræfter vigtigheden af ​​både lipid syntese og fedtsyredesaturering af SCD1 i leveringen af ​​substrater for kræft cellevækst.

Endelig yderligere bevis på, at aktiv lipid dannelse er et vigtigt skridt i reguleringen af ​​celledeling ved SCD1 blev opnået ved at undersøge det relative indhold af større lipider i celler undergår hæmning af SCD1 og behandles med eksogene fedtsyrer. Som vist i fig. 5A, blokade af SCD1 med CVT-11127 ført til en betydelig reduktion af de vigtigste neutrale lipider, CE og TAG, mens de samlede fosfolipider lidt blev reduceret. Inkubation af SCD1-udtømte celler med 100 pM oliesyre dramatisk forøget niveauerne af TAG med 4,4 gange over kontrolværdier (fig. 5B). Tilsætning af oliesyre fuldt restaureret den formindskede indhold af CE i SCD1-deficiente celler (fig. 5C), hvorimod det returnerede phospholipid niveauer (fig. 5D) til kontrolværdier. Tilsammen disse observationer styrker forestillingen om, at SCD1 bestemmer hastigheden af ​​cellecyklusprogression og programmeret celledød, og i sidste ende, spredning af kræftceller ved at opretholde aktiv lipid syntese og cis-MUFA produktion.

H460 lungekræft celler blev behandlet med 1 pM CVT-11127 (CVT) i 48 timer i nærvær eller fravær af 100 uM oleinsyre (Ole). Total celle-lipider blev ekstraheret, separeret ved TLC og farvet med ioddampe (A). Relative niveauer af, triacylglyceroler (B), cholesterolesters (C) og phospholipider (D), blev bestemt ved densitometrisk scanning. *, P 0,05 eller mindre, vs DMSO; **, P. 0,05 eller mindre vs CVT-behandlede kontrol ved Students t-test

Diskussion

I tidligere undersøgelser, vi rapporterede, at genetiske og farmakologiske ablation af SCD1 alvorligt svækker evne cancerceller at formere [12]. I det foreliggende arbejde, giver vi nye beviser på, at SCD1 styrer hastigheden af ​​kræftcellen mitogenese ved at modulere cellecyklusprogression. Vores observation, at cancerceller behandlet med en farmakologisk inhibitor af SCD1 arresteres i G

1 fase, og at denne virkning genoprettes ved oliesyre antyder, at MUFA syntese er påkrævet i tidlige faser af cellecyklussen. Endvidere inhibering af ACC og FAS, to nøgleenzymer af syntesen af ​​fedtsyrer, fremkaldte en lignende blokade i progressionen af ​​cellecyklussen via G

1 /S grænsen [16], [23], [24] . Disse observationer tyder på, at en samordnet aktivering af SFA-syntese og efterfølgende konvertering af SFA i MUFA er forpligtet til at give den phospholipid biosyntetiske maskineri med MUFA substrater til ny membran syntese før eller under den syntetiske fase af cellecyklus. Faktisk elegante undersøgelser af Jackowski [25], [26], viste, at akkumuleringen af ​​nye phospholipider til delende celler er produktet af forhøjet syntese og omsætning, som optræder under G

1 og tidlige S faser.

Vores data tyder også på, at SCD1 kan styre cellecyklusprogression ved at ændre niveauet af cyclin D1 og CDK6, to proteiner, hvis udtryk og interaktion er afgørende for passage af cykling celler gennem G

1 /S overgang [27]. SCD1 aktivitet kan indirekte regulere indholdet af disse cellecyklusproteiner ved modulering GSK3p, en nedstrøms mål af Akt pathway, der øger nedbrydningen af ​​cyclin D1 [28]. Vi har tidligere rapporteret, at inhibering af SCD1 ekspression inaktiverer Akt og øger dephosphorylering og aktivering af GSK3p. Ændringer i den biokemiske sammensætning og dermed De biofysiske egenskaber af cellulære membran domæner kan aktivere signaltransduktion og transskription veje, der modulerer mitogenese [3]. Kontrol med SFA og MUFA balance ved SCD1 synes at være en kritisk modulator af vækstsignaler i humane celler [11], [12], men de mekanismer, hvorigennem dette enzym koordinater modifikationer i membranen lipidsammensætning, membran-afledte signaler og deres nedstrømsvirkningerne stadig ikke fuldt forstået.

Mens kræftceller formerer gennem vedvarende celledeling, at antallet af prolifererende celler påvirkes også af hastigheden af ​​celledød. Udover at begunstige en større sats på celle mitogenesen, giver vi dokumentation for, at SCD1 er en vigtig overlevelsesfaktor for kræftceller ved at hjælpe cellen undgå programmeret celledød gennem produktion af cis-MUFA. SCD1 aktivitet kan forebygge kræft celle apoptose af mindst to mekanismer: beskyttelse mod SFA-medieret toksicitet eller lipoapoptosis [11], [29], og stimulering af cis-MUFA-biosyntese for celleproliferation. Høj konstitutive fedtsyre syntese er typisk findes i kræftceller [3], dermed en tonisk aktiv SCD1 kan forhindre de potentielt skadelige virkninger af endogen SFA akkumulation. Siden elaidinsyre, en trans-MUFA, kun svagt forhindrede den cytotoksiske virkning af både SCD1-mangel og SFA mens cis-MUFA fuldt restaureret proliferation, synes der at være en vis fedtsyre artsspecificitet for den beskyttende virkning. Dette muligvis sker ved MUFA fortrænge SFA fra centrale cytotoksiske metaboliske reaktioner.

Aktiv lipogenese, især membran lipid syntese, er en kritisk forudsætning for den fortsatte spredning af kræftceller og en mekanisme til at undgå optagelse i programmet af apoptose [ ,,,0],30]. Vi har tidligere fastslået, at SCD1 styrer den generelle forekomst af lipid syntese i lungekræft celler [9], [11], [12]. Resultater fra nuværende arbejde styrke koncept, SCD1 kan styre celledeling ved at påvirke fedtsyren biosyntetiske sats [12]. Vi observerede et signifikant fald i proliferation af H460-celler i nærværelse af en ACC-inhibitoren og antiproliferativ virkning, som kan tilskrives defekt fedtsyresyntese kunne reddes af både oliesyre (MUFA) og palmitinsyre (SFA). Disse resultater enig med tidligere rapporter, som dokumenterer, at cellevækst anholdelse i ACC udtømte celler kunne vendes ved eksogen palmitinsyre [16], [17].