PLoS ONE: TAp73-medieret aktivering af C-Jun N-terminal kinase Forbedrer Cellular kemosensitivitet til cisplatin i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

P73, et medlem af tumor suppressor p53 familie, aksjer meget strukturelle og funktionelle lighed til p53. Ligesom p53, kan det transkriptionelt aktive TAp73 mediere cellulær reaktion på kemoterapeutiske midler i humane cancerceller ved opregulering udtrykkene for sine pro-apoptotiske target gener, såsom PUMA, Bax, NOXA. Her, demonstrerede vi en hidtil ukendt molekylær mekanisme for TAp73-medieret apoptose som respons på cisplatin i ovariecancerceller, og det var uanset p53-status. Vi fandt, at TAp73 fungerede som en aktivator af c-Jun N-terminal kinase (JNK) signalvejen ved opregulering af ekspressionen af ​​sit mål vækst anholdelse og DNA-skader-inducerbart protein GADD45 alfa (GADD45α) og efterfølgende aktivering mitogen- aktiveret protein kinase kinase-4 (MKK4). Inhibering af JNK-aktivitet med en specifik inhibitor eller lille interfererende RNA (siRNA) signifikant ophævet TAp73-medieret apoptose induceret af cisplatin. Endvidere inhibering af GADD45α af siRNA inaktiveret MKK4 /JNK aktiviteter og også blokeret TAp73-medieret apoptose induktion af cisplatin. Vores undersøgelse har vist, at TAp73 aktiveret JNK apoptotiske signalvejen som reaktion på cisplatin i æggestokkene cancerceller

Henvisning:. Zhang P, Liu SS, Ngan HYS (2012) TAp73-medieret aktivering af C-Jun N terminal kinase Forbedrer Cellular kemosensitivitet til cisplatin i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10,1371 /journal.pone.0042985

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 24. februar, 2012; Accepteret: 16. juli 2012; Udgivet: 10 august, 2012 |

Copyright: © Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev i fællesskab finansieret af Wong Check Hun Charitable Foundation og forskningsfonden fra Institut for Obstetrik og Gynækologi, University of Hong Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

P73, et hidtil ukendt medlem af tumor suppressor p53 familien, ligner p53 både strukturelt og funktionelt [1], [2]. Den P73 genet koder mere end 20 proteinisoformer følge af brugen af ​​forskellige promotorer og alternativt posttranskriptionel splejsning. De transkriptionelt aktive TAp73 isoformer, der indeholder fuld N-terminale transaktiveringsdomæne, kan binde specifikt til p53 responsive elementer og transaktiverer nogle af p53-målgener, og efterfølgende inducere cellecyklus og apoptose, mens DNp73 isoformer, med trunkeret N-terminalt transaktivering domæne, virker som en dominant negativ inhibitor af både TAp73 og p53 [1], [3], [4]. Interessant, TAp73 er ​​også en mediator af cellulær følsomhed over for kemoterapeutiske midler i humane cancerceller [1], [4] – [7]. Mange pro-apoptotiske gener, såsom PUMA, Bax og NOXA, fungere som aktivatorer af den mitokondriske apoptotiske vej, og har P73 responsive elementer i deres promotor og kan opreguleres ved p73 til at fremkalde apoptose som reaktion på kemoterapeutiske lægemidler. Desuden p73-medieret opregulering af dødsreceptor CD95, en mediator af den ydre apoptotiske vej, bidrager også til p73-medieret apoptose i cancerceller under stress stimuli [8]. Men i modsætning til p53, de molekylære mekanismer, der implicerer i p73-medieret cellulær apoptose stadig ikke klart forstået. Forstå de præcise underliggende molekylære mekanismer vil være nyttige til målretning P73 som en god kandidat-gen til cancerterapi.

JNK tilhører en superfamilie af mitogenaktiveret protein (MAP) kinaser. JNK proteinkinaser indeholder Jnk1, JNK2 og JNK3. JNK1 og JNK2 er ubikvitært detekterbar. The JNK3 er hovedsageligt begrænset til hjerne, hjerte og testis [9]. JNK-signalvejen reaktioner på forskellige stress stimuli, gennem transduktion af den opstrøms MAPKKK herunder MEKKs, og efterfølgende aktivering af JNK ved phosphoryleret i Thr og Tyr websteder ved JNK direkte opstrøms kinaser MKK4 /MKK7. Aktivering af JNK phosphorylerer og aktiverer nedstrøms transkriptionsfaktor c-Jun og andre transkriptionsfaktorer [9], [10]. JNK-signalvejen som nøgle positiv modulator af celle apoptotisk reaktion på stress stimuli [9] – [11]. Desuden JNK-signalvejen bidrager kritisk til cisplatin-afhængig apoptose i cancerceller [12] – [15]

I denne undersøgelse var det et mål at undersøge virkningen af ​​TAp73 (TAp73α) på cellulære respons på. cisplatin i ovariecancerceller og de underliggende molekylære mekanismer. Vi var interesseret i, om TAp73 ville have nogen regulerende rolle i andre apoptotiske veje, såsom JNK signalvejen efter cisplatin behandling.

Resultater

TAp73α øger cellulære følsomhed over for cisplatin i æggestokkene cancerceller

for at undersøge rollen af ​​TAp73 i ovariecancerceller som respons på cisplatin, humane cisplatin-resistente ovariecancer cellelinier SKOV3 (null-p53) og OVCA433 (vildtype p53) blev stabilt transficeret med plasmidet pEGFP -TAp73α (figur 1A). Virkningen af ​​TAp73α på cellulære respons på cisplatin blev vurderet ved både XTT celleviabilitetstest og klongenicitetsassayet. Som vist i figur 1B og 1C, TAp73α signifikant forøget cellulær følsomhed over for cisplatin i både null-p53 SKOV3 og vildtype p53 OVCA433 celler, sammenlignet med vektoren kontroller. En sådan effekt blev observeret i både kort sigt (ved XTT assay) og lang sigt (ved klonogene assay) kultur assays. Endvidere blev celle apoptose induceret af cisplatin også steget med over-ekspression af TAp73α, som det fremgår af TUNEL-assay og spaltes PARP ekspressionsanalyse (figur 2A og 2B). Disse resultater viste, at TAp73 fremmet cellulær følsomhed for cisplatin via induktion af celleapoptose, og sådan TAp73 funktion var p53-uafhængig, da virkningerne var ens i begge vildtype p53 og null-p53-celler.

( A) Den GFP-TAp73α overudtrykker stabile kloner i SKOV3 (C8, C24 og C28) og OVCA433 (C1, C7 og C12) celler blev verificeret ved Western blot-analyse. (B og C) Både XTT levedygtighedsassay og klonogenisk assay viste signifikant reduceret celleproliferation i TAp73α-overudtrykte celler af SKOV3 og OVCA433 sammenlignet med tom vektor kontrol (V) som reaktion på cisplatin-behandling. Procentdelen af ​​celler /kolonier overlevende i cisplatin i forhold til celler /kolonier i stoffri medium kontrol blev målt. Dataene blev vist som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg (*: p 0,05; **: p 0,01)

(A) TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og. OVCA433 C1, C7 og C12) og tom vektor kontrol (v) i SKOV3 og OVCA433 blev behandlet med 4 ug /ml cisplatin i 48 timer. Apoptotiske celler blev vurderet ved TUNEL-assay. Mere end 500 celler blev talt for hver gruppe, resultaterne præsenteret var den relative af de apoptotiske celler til totale celler og blev udført mindst tre uafhængige forsøg (**: p 0,01). (B) TAp73α-overudtrykte celler og tom vektor kontroller blev behandlet med forskellige doser (anført) af cisplatin i 24 timer, og spaltningen af ​​PARP blev påvist ved western blot-analyse.

TAp73α medierer aktiveringen JNK-signalvejen

Tidligere rapporter har vist, at aktivering af JNK bidrager kritisk for cisplatin-induceret celle apoptose [12] – [15]. Vi således antaget, at TAp73α-medieret celle apoptose som respons på cisplatin kan virke gennem aktivering af JNK-signalvejen. Virkningen af ​​TAp73α på aktiveringen af ​​JNK-signaler blev først analyseret ved at måle phosphorylering niveauet af JNK (p-JNK) og dets substrat c-Jun (p-c-Jun) i TAp73α-overudtrykte celler. Som vist i figur 3A, blev både p-JNK og p-c-Jun naturligvis forhøjet i TAp73α-overudtrykte celler, sammenlignet med kontrolceller. Stigningen af ​​p-JNK og p-c-Jun blev yderligere forøget i disse celler som respons på cisplatin, kun en svag stigning af p-JNK og p-c-Jun blev observeret i kontrolcellerne. De tidsmæssige og dosisafhængige forsøg viste, at cisplatin-induceret JNK-aktivering forekom ved så tidligt som 6 timer og op til 48 timer efter at cellerne behandlet med 4 ug /ml cisplatin, og den effektive cisplatin dosering til JNK-aktivering var på et så lavt som 2 ug /ml for 12 h behandling i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8; OVCA433 C1 figur 3B). Desuden aktiveringen af ​​JNK var afhængig af den transaktiveringsaktivitet af TAp73α som p-JNK niveau ikke blev ændret i cellerne stabilt overudtrykker DNp73α (figur 3C og 3D), en trunkeret isoform af P73 uden transaktiveringsaktivitet. For at kontrollere, om effekten af ​​TAp73α overekspression i at fremme den cellulære følsomhed var specifik for cisplatin, vi også udført lignende forsøg med behandling af Taxol, som også er en første-line anticancer lægemiddel til ovariecancer behandling. Vi fandt, at Taxol ikke var i stand til at aktivere JNK i TAp73 overudtrykt ovariecancerceller, selvom TAp73α kunne forbedret cellen følsomhed som respons på Taxol (fig S1).

(A) Forøgelse af p-JNK og pc -Jun blev detekteret i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12) og yderligere forbedret ved cisplatin behandling (4 pg /ml i 24 timer), når sammenlignet med kontrollerne (P: parentale celler V: tom vektor kontrol). (B) TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) blev udsat for 4 pg /ml cisplatin for forskellige perioder, eller til forskellige doser af cisplatin i 12 timer. P-JNK-niveauet blev målt ved Western blot-analyse. (C) DNp73α (GFP-DNp73α) var over-udtrykt i SKOV3 (D2) og OVCA433 (D18) celler. (D) nr JNK aktivering blev observeret i DNp73α-overudtrykte celler (SKOV3 D2 og OVCA433 D18).

Hæmning af JNK aktivitet dæmper TAp73α-medieret apoptose i respons på cisplatin

Til yderligere at undersøge, om TAp73α-medieret aktivering af JNK bidrog til apoptose induktion som respons på cisplatin, en specifik inhibitor af JNK-kinase-aktivitet, SP600125, blev anvendt. Efter behandling af 20 uM SP600125 i 8 timer blev p-JNK niveau reduceres med op til 60% i de TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1, figur 4A). Desuden inhibering af JNK-aktivering af SP600125 signifikant reduceret celle apoptose induceret af cisplatin i TAp73α-overudtrykte celler, som påvist ved TUNEL-assay og spaltes PARP ekspressionsanalyse (figur 4B og 4C).

(A) TAp73α- overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) blev behandlet med 20 pM SP600125 for forskellige tidsperioder (angivet). Phosphoryleringsniveauerne af JNK og c-Jun blev målt. (B og C) TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) og de tomme vektor kontrol (V) blev behandlet med 20 pM SP600125 eller DMSO og derefter med cisplatin. Celleapoptosen blev vurderet af TUNEL-assay (fejlmargener angivet middelværdi ± SD fra tre uafhængige forsøg; *: p 0,05) og spaltningen af ​​PARP analyse. Inhibering af JNK svækket TAp73α-medieret apoptose som respons på cisplatin. (D) TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) blev behandlet med JNK siRNAs (Si-JNK) eller scrambled kontrol siRNA (Control). De aktiveringer af JNK og c-Jun var fraværende efter cisplatin behandling, og associeret med markant reduceret celle apoptose (E og F).

Aktivering af JNK-vejen ved TAp73α impliceret i cisplatin-induceret apoptose var også fremgår af den observation, at tavshed JNK1 og -2 i TAp73α-overudtrykte celler signifikant blokeret cisplatin-induceret celledød. Som vist i figur 4D, behandling af siRNA’er mod JNK1 og -2 i cancerceller (SKOV3 C8; OVCA433 C1) naturligvis nedreguleret JNK1 /2-ekspression i forhold til de krypterede siRNA kontroller og behandling derefter undertrykt phosphoryleringsniveauerne af JNK og dets substrat c-jun. Som det fremgår af TUNEL-assay og spaltes PARP ekspressionsanalyse, cisplatin-induceret apoptose i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8; OVCA433 C1) var signifikant svækket af JNK silencing behandling (figur 4E og 4F). Disse resultater bekræftede endvidere, at aktivering af JNK-vejen ved TAp73α bidraget til TAp73α-medieret apoptose i ovariecancerceller som respons på cisplatin.

TAp73α-medieret opregulering af GADD45α er ansvarlig for aktiveringen af ​​JNK-signalvejen

GADD45α er blevet identificeret som en bindende partner og aktivator af JNK opstrømskinase MEKK4 /MTK1, og dets binding til MEKK4 /MTK1 kan aktivere nedstrøms gen MKK4 og JNK [17], [18]. På den anden side, GADD45α er en veldefineret målgen af ​​p73 [19], [20]. Således har vi den hypotese, at GADD45α kunne spille en rolle i aktiveringen af ​​JNK signalvej medieret af TAp73. Virkningen af ​​TAp73 på GADD45α ekspression blev først vurderet. Som vist i figur 5A og 5B, ekspressionen af ​​GADD45α var opreguleret i både mRNA og protein niveauer i TAp73α-overudtrykte celler. Som reaktion på cisplatin, TAp73α-medieret opregulering af GADD45α protein blev yderligere forøget (figur 5B). Som GADD45α direkte kan interagere med MEKK4 /MTK1 at aktivere dets substrat MKK4 kinase [17], [18], vi så målte phosphorylering niveau MKK4 i TAp73α-overudtrykte celler. Som vist i figur 5B, blev forøgelse af phosphoryleret MKK4 observeret i TAp73α-overudtrykte celler og yderligere forbedret som respons på cisplatin-behandling. Disse resultater antydede, at TAp73α medierede aktiveringen af ​​JNK-signalvejen eventuelt gennem opregulering af sin målgen GADD45α og efterfølgende aktivering af MKK4, et opstrøms element af JNK-signalvejen.

(A) Forhøjelse af GADD45α mRNA-ekspression i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12). (B) Forhøjelse af GADD45α protein-ekspression og MKK4 fosforylering niveauet i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12). (C) GADD45α blev slået ned i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) ved siRNA’er (Si1-GADD45α og Si2-GADD45α) behandling. Aktiveringen af ​​MKK4, JNK og c-Jun blev mindsket, selv under cisplatin behandling.

For yderligere at verificere disse resultater, et par siRNA’er mod GADD45α (Si1-GADD45α og Si2-GADD45α) var anvendes til transient knockdown den GADD45α ekspression. Phosphoryleringsniveauerne af MKK4, JNK og c-Jun blev derfor reduceret ved nedreguleringen af ​​GADD45α, selv som reaktion på cisplatin-behandling (figur 5C). Vi bekræftede derfor, at TAp73α-medieret opregulering af GADD45α var ansvarlig for aktivering af JNK signalvejen i æggestokkene cancerceller.

GADD45α er ansvarlig for TAp73α-medieret apoptose

For at bestemme hvorvidt tavshed GADD45α har en virkning på cisplatin-induceret apoptose i TAp73α-overudtrykte celler blev celler behandlet med GADD45α siRNAs og celle apoptose blev målt. Som vist i figur 6, blev cisplatin-induceret apoptose faldt dramatisk i GADD45α-tavshed TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8; OVCA433 C1). Disse resultater antydede, at TAp73α-medieret den opregulering af GADD45α var ansvarlig for aktivering af JNK signalvejen og celle apoptose i æggestokkene cancerceller.

Cell apoptose blev formindsket i TAp73α-overudtrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) som reaktion på cisplatin efter GADD45α siRNAs behandling. Celleapoptosen blev målt ved (A) TUNEL assay (fejlmargener indikerer gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg; *: p 0,05; **: p 0,01) og (B) spaltningen af ​​PARP-assayet

diskussion

i denne undersøgelse har vi vist, at der for første gang, så vidt vi ved, TAp73 delvist medieret cellulær apoptose som respons på cisplatin gennem aktiveringen af ​​JNK-signalvejen i ovariecancerceller. Vi fandt, at som svar på cisplatin, TAp73α aktiveret JNK signalvejen via opregulering af sin nedstrøms gen GADD45α, og svaret var TAp73-afhængige og p53-uafhængig.

Etableret beviser har vist, at transkriptionelt aktiv TAp73 forbedret cellulære følsomhed over for kemoterapeutisk lægemiddel cisplatin i humane cancerceller [5] – [7], [21]. Derudover har en nylig rapport vist, at TAp73 ekspression i ovariecancere var meget højere i reagerende kræftformer sammenlignet med ikke-reagerende cancere [22]. Vores undersøgelse bekræftede, at TAp73 gjorde forbedre cellulære følsomhed over for cisplatin i æggestokkene cancerceller. Selvom TAp73 er ​​funktionelt ligner p53, har funktionelt p53-ekspression blevet vist at være nødvendig for TAp73-medieret celle apoptose under DNA-skader stimulation [23]. På den anden side er nogle undersøgelser antydet, at p73-medieret kemosensitivitet er uafhængig af p53-ekspression i nogle cancerceller [5], [24]. I vores nuværende undersøgelse blev TAp73α-medieret apoptose observeret i p53-nul SKOV3-celler, hvilket indikerer, at TAp73-medieret apoptose var p53-uafhængig, i det mindste i vores celle model, yderligere at understrege den uafhængige rolle P73 blandt sine familiemedlemmer i DNA beskadigelse respons.

De JNK celledød pathway fungerer som en vigtig regulator af celle apoptose som reaktion på forskellige stress stimuli og faktisk spiller en central rolle i apoptotiske veje, herunder extrinsic (død receptorer) [11] og iboende (mitokondrie ) veje [11], [25]. Tidligere undersøgelser har vist, at cisplatin-medieret aktivering af JNK-signalvejen i cancerceller bidrog kritisk for cisplatin-afhængig apoptose [12] – [15]. Opregulering af Fas L-ekspression resulterede fra aktivering af JNK og dets substrat c-Jun spillet en central rolle i cisplatin-induceret apoptose i ovariecancerceller [15]. Vores resultater viste, at JNK og dets substrat c-Jun blev aktiveret i TAp73α overudtrykkes celler, og forøges yderligere som respons på cisplatin-behandling. Undertrykkelse af JNK-aktivering ved JNK inhibitor eller JNK siRNAs i disse celler ophævet TAp73α-medieret apoptose. Disse resultater antydede, at opregulering af JNK aktivitet bidrog til TAp73-medieret apoptose induktion i ovariecancerceller som respons på cisplatin. Dette var første gang, at vise, at TAp73 fungerede som en opstrøms aktivator af JNK-vejen for at aktivere JNK signaler at fremkalde celle apoptose.

For yderligere at udforske de underliggende mekanismer, som TAp73 opreguleret den JNK fosforylering niveau, en P73 målgen GADD45α var klar. GADD45α er en veldefineret nedstrøms gen af ​​TAp73 og p53 [19], [20], og det kan induceres af DNA-skader agenter, og spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​apoptose [26]. Interessant nok har tidligere undersøgelser vist, at aktiveringen af ​​JNK apoptosecyklus af GADD45α var nært impliceret i GADD45α-medieret apoptose induktion [27], [28]. GADD45α direkte interageret med MEKK4 /MTK1 at aktivere underlaget MKK4 kinase, og dermed opregulerer JNK-aktivering, en begivenhed, der er involveret i apoptose induktion [17], [18]. Vores undersøgelse har vist, at udtrykkene for både GADD45α og aktiv MKK4 var opreguleret i TAp73α-overudtrykte celler, og denne effekt blev yderligere forstærket efter cisplatin eksponering. På den anden side, når GADD45α blev stille, de aktiveringer af MKK4, JNK og c-Jun blev afskaffet, selv under behandling af cisplatin, og TAp73α-medierede cisplatin-induceret apoptose blev også signifikant blokeret. Disse resultater viste, at TAp73 var i stand til at aktivere JNK apoptosecyklus ved opregulering GADD45α udtryk i kræft i æggestokkene celler som reaktion på cisplatin.

Interessant, tidligere rapport har foreslået en krydstale mellem JNK-vejen og P73, og foreslog, at JNK var en vigtig regulator i p73-medieret apoptose som respons på cisplatin [13]. De viste, at p73 var et substrat af JNK-kinase. JNK phosphoryleret P73 på bestemte sider for at forbedre p73 transkription aktivitet og p73-medieret apoptose i cancerceller i nærvær af cisplatin. I den foreliggende undersøgelse påviste vi, at overekspression af TAp73 aktiveret JNK-aktivitet i ovariecancerceller, som respons på cisplatin. TAp73 fungerede som en opstrøms aktivator af JNK apoptotiske vej via opregulering af GADD45α, og den efterfølgende aktivering af MKK4 (figur 7). Således er vores resultater tilvejebragt en ny vinkel til krydstale mellem p73 og JNK i celle apoptose respons.

DNA beskadigelse middel, cisplatin inducerer TAp73 ophobning og den efterfølgende opregulering af dets pro-apoptotiske målgener at inducere celle apoptose. Samtidig opregulering af TAp73 målgen, GADD45α aktiverer JNK apoptotiske vej via dens interaktion med MEKK4 /MTK1 at inducere apoptose.

Kollektivt, vores resultater støtter klart en hidtil ukendt vej for TAp73-medieret cellulær følsomhed over for cisplatin i æggestokkene cancerceller. Vi viste, at TAp73α inducerede den apoptotiske respons gennem aktivering af GADD45α-MKK4-JNK celledød kaskade og forudsat en roman scenario for krydstale mellem p73 og JNK apoptosecyklus under spændinger. Denne TAp73-afhængige og p53-uafhængig cellulært respons ville spille en vigtig rolle i DNA beskadigelse respons i ovariecancerceller, som p53 funktion var mangelfuld i de fleste cancerceller. En bedre forståelse af de underliggende mekanismer i TAp73-medieret apoptotiske respons er værdifuldt i at målrette P73 som en terapeutisk kandidat gen.

Materialer og Metoder

Cell kultur og medicinsk behandling

Humane æggestokkræft cellelinjer SKOV3 (null p53) og OVCA433 (vildtype p53) var gaven fra Prof. Tsao, Anatomisk Institut, University of Hong Kong, hvor SKOV3 blev opnået fra ATCC, Manassas, VA [29], og OVCA433 blev etableret og tidligere [30] beskrevet. De blev holdt i Minimum Essential Medium (MEM) (Invitrogen Corporation, Grand Island, YN), med 10% kalvefosterserum (Invitrogen) og inkuberet i et 37 ° C befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2.

Cis-Diamineplatinum (II) dichlorid (Cisplatin, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), og JNK-specifikke inhibitor SP600215 (Calbiochem, San Diego, CA) blev opløst i milli- Q-vand og dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma), henholdsvis og derefter opbevaret ved -20 ° C. Disse opløsninger blev yderligere fortyndet i dyrkningsmedium før celle behandling. DMSO blev fortyndet i medium alene som kontrol.

Plasmider, siRNA og transfektion

pEGFP-TAp73α og pEGFP-DNp73α plasmider blev konstrueret ved PCR-amplifikation af den fulde længde kodende region af TAp73α og DNp73α på cDNA af æggestokkene kræftceller. Og PCR-produkterne blev fordøjet og derefter klonet i ramme ind i pEGFP ekspressionsvektoren (Clontech laboratorier, Mountain View, Californien). For stabile kloner blev pEGFP-TAp73α og pEGFP-DNp73α transfektanter udvalgt af G418 (Invitrogen) i 14 dage, og derefter de enkelte kolonier blev samlet op og kontrolleret af western blot analyse. De siRNA’er mod JNK og GADD45α og krypterede siRNA (negativ kontrol) (Applied Biosystems af Life Technologies, Foster City, CA) blev transficeret til celler ved 20 nM slutkoncentration. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev anvendt til celletransfektion ifølge producentens anvisninger.

RT-PCR

Totalt RNA af celler blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen), og cDNA blev syntetiseret med høj kapacitet RNA-til-cDNA Master Mix kit (Applied Biosystems). De specifikke primere (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG og TCCCGGCAAAAACA AATAAG) blev anvendt til at amplificere human GADD45α cDNA.

Western blot-analyse

Celler blev høstet med 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen) og proteiner blev ekstraheret under anvendelse af konventionel RIPA lysebuffer [16]. Antistofferne mod GFP, JNK og GADD45α blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Antistofferne mod MKK4, PARP og c-Jun og de aktive former af JNK, c-Jun (ser63) og MKK4 blev opnået fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA).

Cellelevedygtighed analyse

Cellelevedygtighed blev vurderet ved XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H -tetrazolium-5-carboxanilid indre salt) kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) ifølge til fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne podet tredobbelt i 96-brønds plade og behandlet med cisplatin (4 ug /ml) ved den følgende dag. Cellelevedygtigheden blev målt efter en dags behandling i fire konsekutive dage.

klongenicitetsassayet

kolonidannende evne af celler blev målt ved klonogene assay. Celler blev udpladet i tredobbeltbestemmelse i medium indeholdende cisplatin (0,15 ug /ml) eller medikamentfrit medium i en koncentration på 500 celler per brønd i 6-brønds plade. Efter 48 timers inkubation blev alle disse celler lodes vokse i medikamentfrit medium i 10-12 dage. Overlevende kolonier blev fikseret i 75% ethanol og derefter farvet i 1% Giemsa (Merck, Damstadt, Tyskland). Kolonier bestående af mere end 50 celler blev talt.

Apoptose assay

apoptotiske celler blev undersøgt ved TUNEL-assay (in situ Celledød Detection Kit, Roche) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler podet på dækglas én dag før 4 ug /ml cisplatin behandling i 48 timer. Efter fiksering og permeabilisering blev celler farvet med TUNEL reaktionsblandingen, og modfarvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) (Sigma).

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg. SPSS 16.0 software (SPSS) blev anvendt til dataanalyse. T-test blev anvendt til at vurdere forskellen mellem grupperne. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte Information

Figur S1..

TAp73α øget cellulær følsomhed over for Taxol, men ikke via JNK-vejen. (A) XTT levedygtighed assay viste TAp73α-overudtrykte celler af SKOV3 og OVCA433 var mere følsomme over for Taxol behandling, sammenlignet med de tomme vektor kontrol (V). (B) Efter cisplatin eller Taxol behandling i 24 timer blev phosphorylering niveau af JNK ikke steget i SKOV3 og OVCA433 celler behandlet med Taxol, selv med TAp73α overekspression celler (C: kontrol; D: cisplatin: T50 og T500: 50 ng /ml og 500 ng /ml Taxol)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0042985.s001

(TIF)

tak

Vi takker Prof. SW Tsao , Anatomisk Institut, University of Hong Kong for at give kræft i æggestokkene cellelinjer OVCA433 og SKOV3.