PLoS ONE: lokalanæstetika inducere apoptose i Human Thyroid Cancer Cells via mitogen-aktiveret protein kinase Pathway

Abstrakt

Lokale bedøvelsesmidler anvendes hyppigt i fin-nål aspiration af skjoldbruskkirtlen læsioner og locoregional styring af vedvarende eller tilbagevendende thyroid cancer. Nylig dokumentation tyder på, at lokalanæstetika har et bredt spektrum af virkninger, herunder inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose i neuronale og andre typer af celler. I denne undersøgelse har vi vist, at behandling med lidocain og bupivacain resulterede i nedsat cellelevedygtighed og kolonidannelse af såvel 8505C og K1-celler på en dosis-afhængig måde. Lidocain og bupivacain induceret apoptose og nekrose i høje koncentrationer, som bestemt ved flowcytometri. Lidocain og bupivacain forårsagede forstyrrelse af mitokondrisk membranpotentiale og frigivelse af cytochrom c, ledsaget af aktivering af caspase 3 og 7, PARP-spaltning, og induktion af et højere forhold mellem Bax /Bcl-2. Baseret på microarray og pathway analyse, apoptose er den fremtrædende transkriptionelle forandringer fælles for lidocain og bupivacain-behandling. Endvidere lidocain og bupivacain svækkede ekstracellulært signal-reguleret kinase 1/2 (ERK1 /2-aktivitet) og induceret aktivering af p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og c-jun N-terminal kinase. Farmakologiske inhibitorer af MAPK /ERK-kinase og p38 MAPK undertrykt caspase 3-aktivering og PARP-spaltning. Tilsammen vores resultater for første gang demonstrere de cytotoksiske virkninger af lokalanalgetika på skjoldbruskkirtlen kræftceller og implicere de MAPK veje som en vigtig mekanisme. Vores resultater har potentiel klinisk relevans i, at brugen af ​​lokalanæstetika kan give tidligere indregnede fordele i behandlingen af ​​patienter med kræft i skjoldbruskkirtlen

Henvisning:. Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Hu MC, Cheng SP (2014) lokalanæstetika inducere apoptose i human Thyroid Cancer Cells via mitogen-aktiveret protein kinase Pathway. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10,1371 /journal.pone.0089563

Redaktør: Yong Jiang, Southern Medical University, Kina

Modtaget: September 25, 2013; Accepteret 22. januar 2014 Udgivet: 21 februar 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Science Rådet for Taiwan (NSC 100-2314-B-195-001-MY3), og fra Mackay Memorial Hospital (MMH-10206 og MMH-E-101-10). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige af alle endokrine cancersygdomme, og forekomsten af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen er stigende på verdensplan [1], [2]. De fleste af skjoldbruskkirtelkræft er godt differentieret med papillær og follikulært thyreoideakarcinom er de mest almindelige typer. Selvom veldifferentieret thyreoideacancer har en generelt positiv prognose, kunne de overordnede gentagelse satser være så høj som 35% [3]. Vedvarende eller tilbagevendende sygdom forekommer i vid udstrækning i nakken. Desuden er udviklingen af ​​tilbagefald i forbindelse med en højere dødelighed. Tredive-årige kræft dødelighed blev rapporteret til at være omkring 12% hos patienter med lokalt recidiv og 43% i dem med fjernmetastaser [3].

De behandlingsmuligheder for vedvarende eller tilbagevendende sygdom omfatter yderligere kirurgi og radioaktivt jod terapi. Kompartmental hals dissektion for locoregional gentagelse anbefales American Thyroid Association retningslinjerne for [4]. Et andet alternativ behandling med lovende resultater er ultralydsvejledt injektion og radiofrekvens perkutan ethanol ablation [5] – [7]. Under proceduren, lidocain infiltration til punkturstedet og bløde væv omkring den tilbagevendende tumor er en enkel og effektiv metode til smertekontrol [8]. Ingen bivirkninger blev rapporteret med undtagelse af den ultralyd billedkvaliteten kan kompromitteres med en stor mængde af lidocain [7].

Ud over den veletablerede virkning af analgesi og antiarrhythmia, undersøgelser har vist, at de lokale bedøvelsesmidler har en bredt spektrum af virkninger, herunder antiinflammatoriske og antimikrobielle egenskaber [9]. Nylige observationer af deres chondrotoxicity opfordring til forsigtighed i den kliniske anvendelse af intra-artikulær injektioner [10]. Endvidere er der voksende tegn på, at de lokale bedøvelsesmidler kan udøve gavnlige tiltag i behandlingen af ​​cancer ved hæmning af celleproliferation, invasion, og migration [11] – [13]. Disse virkninger synes relateret til deres modulation af natriumkanaler [14]. I denne forbindelse har vi vist, at apoptose spiller en vigtig rolle i lokalbedøvelse-induceret celletoksicitet af brystcancerceller [15]. Tidligere undersøgelser tyder på, at neuronal apoptose induceret af lokalanæstetika medieres, i det mindste delvis af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway [16], [17]. Imidlertid vides, lidt, om tilsvarende mekanismer gælder for lokalbedøvelse-induceret cytotoksicitet i kræftceller.

Da lokalanæstetika ofte anvendes i fin-nål aspiration af skjoldbruskkirtlen læsioner og locoregional kontrol med vedvarende eller tilbagevendende thyreoideacancer, det ville være interessant at finde ud af, om lokale bedøvelsesmidler har en antiproliferativ virkning på skjoldbruskkirtlen kræftceller. Vi rapporteret her, at almindeligt anvendte lokalbedøvelsesmidler, lidocain og bupivacain, inhiberede cellevækst og induceret apoptose af humane skjoldbruskkirtel cancerceller i klinisk relevante koncentrationer. Desuden efter aftale med tidligere undersøgelser og vores microarray og sti analyse, vi observeret, at MAPK signalveje var involveret.

Resultater

Hæmning af cellevækst og kolonidannelse af lokalanæstetika

Cell levedygtighed 8505C og K1 thyreoideacancer celler blev bestemt ved at inkubere med lidocain og bupivacain ved serielt fortyndede koncentrationer i 24 og 48 timer. Lidocain og bupivacain hæmmede væksten af ​​både thyreoidea cancerceller på en dosis-afhængig måde (Fig. 1A). Efter 24 timer var den mediane effektive dosis (ED50) af lidocain var 7,3 mM for 8505C celler og 6,8 mM for K1-celler, hhv. Disse var lavere end den almindeligt anvendte koncentration på 1% (vægt /volumen) lidocain (42,67 mM). Tilsvarende ED50 ved 24 timers bupivacain 3,1 mM for 8505C celler og 1,3 mM for K1-celler. Begge var meget lavere end den kliniske koncentration på 0,5% (w /v) bupivacain (17.34 mM).

(A) 8505C og K1-celler blev behandlet med serielle fortyndinger af lidocain og bupivacain, individuelt eller i kombinationer, i 24 og 48 timer. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. (B) et konservativt isobologram viser, at lidocain og bupivacain virker antagonistisk at inhibere cellevækst af skjoldbruskkirtlen cancerceller. ED indikerer effektive dosis. ED50 (rødt X), ED75 (grønne kors), og ED90 (blå cirkler) tegnes. (C) Behandling med lidocain og bupivacain resulterede i reduktion af kolonidannelse af 8505C og K1-cellelinier. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. *, P 0,01

versus

kontrol

For at undersøge, om den cytotoksiske effekt er begrænset til amid-typen lokalanalgetika blev skjoldbruskkirtlen kræftceller også behandlet med en ester-typen lokalt. anæstetika, procain. ED50 var 39,6 mM og 30,9 mM, hvilket antyder, at virkningen korreleret med styrken, men ikke klassen, af lokalanæstetika. Endvidere at udelukke muligheden for, at ændringer i pH eller osmolalitet vil tegne sig for den cytotoksiske effekter, pH og osmolalitet af dyrkningsmedier til blev bestemt eksperimenter. Der var ingen signifikante forskelle i pH eller osmolalitet (fig. S1), hvilket indikerer, at de observerede virkninger var farmakologiske i naturen.

Drug synergi blev bestemt ved kombinationen index (CI) og isobologram analyser ifølge medianen effekt metoder (fig. 1B). CI var 1,17 ± 0,03 for 8505C celler og 1,14 ± 0,06 for K1 celler. Disse resultater antyder, at kombinationen af ​​lidocain og bupivacain viste svag antagonisme.

Endvidere virkningerne af lokalanæstetika på tumorcellevækst blev bestemt ved klonogene assay. Resultaterne er vist i fig. 1C. En væsentlig dosisafhængig reduktion i kolonier blev observeret i 8505C og K1-celler. Thyroid kræftceller ikke danne kolonier efter behandling med lidocain 4 mM eller bupivacain . 0,8 mM

Induktion af apoptose ved lokale bedøvelsesmidler

For at bestemme grundlaget for reduceret cellelevedygtighed, celle cyklus analyse blev udført. Der var ingen standsning af cellecyklus i skjoldbruskkirtlen cancerceller behandlet med lidocain og bupivacain til 6, 24 og 48 timer (data ikke vist). Imidlertid observerede vi en dosisafhængig stigning i sub-G1 (hypodiploid) fraktion efter behandling med lidocain og bupivacain (fig. 2A). Vi brugte også annexin V /propidiumiodid (PI) dobbelt farvning for yderligere bekræftelse af lokal anæstetika-induceret apoptose i skjoldbruskkirtlen cancerceller. Som vist i fig. 2B, behandling med lidocain og bupivacain resulterede i apoptose på en dosis-afhængig måde. Nekrose blev også observeret i høje koncentrationer af lidocain og bupivacain. Taget sammen antyder disse resultater, at væksten undertrykkelse af lokalanæstetika i skjoldbruskkirtlen cancerceller involverer induktion af apoptose.

(A) 8505C og K1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af lidocain og bupivacain i 24 timer. Derefter blev cellerne vasket, fikseret og farvet med propidiumiodid (PI) og blev analyseret for DNA-indhold i forskellige faser af cellecyklus ved flowcytometri. (B) thyroidcancer celler blev behandlet med lidocain og bupivacain i 48 timer, og cellerne blev efterfølgende farvet med fluorescein-konjugeret annexin V og PI og analyseret ved flowcytometri. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. *, P 0,05

versus

kontrol

Vurdering af mitokondriel dysfunktion

Et fald i mitochondriemembranpotential er en af ​​de tidligste begivenheder i apoptose.. Mitokondrielle membran integritet blev evalueret ved brug af kationiske farvestof JC-1, en yderst specifik probe til påvisning af ændringer i mitokondrie ΔΨ

m. JC-1 danner røde aggregater i intakte mitochondrier, mens grøn fluorescens skyldes dannelsen af ​​JC-1-monomerer ved lav mitochondriemembranpotential. Som vist i fig. 3A, lidocain og bupivacain steg markant dannelsen af ​​JC-1 monomerer i 8505C og K1-celler på en dosis-afhængig måde. Procentdelen af ​​celler med lavt ΔΨ

m var lidt lavere end procentdelen af ​​apoptotiske celler behandlet med lokalanæstetika ved de samme koncentrationer.

(A) 8505C og K1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af lidocain og bupivacain i 16 timer. ΔΨ

m ændring blev overvåget ved lastning med JC-1 og blev analyseret ved flowcytometri. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. *, P 0,05

versus

kontrol. (B) thyroidcancer celler blev behandlet med lidocain (6 mM) og bupivacain (2 mM) for de angivne tidsperioder. Cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier til cytosolen bestemtes ved Western blotting. Blottene blev strippet og testet igen med et antistof mod actin for lige belastning.

Vi næste forsøgt at afgøre, om cytochrom c blev løsladt fra mitokondrier til cytosolen. Som forventet blev en højere grad af cytochrom c målt i cytosol i begge cellelinier efter behandling med lidocain og bupivacain (fig. 3B). Kollektivt antyder disse data, at behandling af kræft i skjoldbruskkirtlen celler med lokalanæstetika fører til aktivering af den mitokondriske apoptotiske vej.

Aktivering af caspaser efter lokalanæstetika

Frigivelse af cytochrom c er blevet vist at aktivere downstream caspaser, der i sidste ende kræves for at inducere apoptose. Vi undersøgte derfor, om caspaseaktivering var involveret i induktion af apoptose af lokale bedøvelsesmidler. Behandling med lidocain og bupivacain resulterede i aktivering af caspase 3 og caspase 7, og spaltning af PARP i 8505C og K1 celler dosisafhængigt (fig. 4A). Desuden viste caspase kolorimetrisk substratassay, at caspase 3-aktivitet steg på en tidsafhængig måde i 8505C celler efter behandling med lidocain og bupivacain (fig. 4B). Disse resultater viser tydeligt, at caspase-aktivering spiller en vigtig rolle i skjoldbruskkirtlen cancercelle apoptose induceret af lokalanæstetika

(A) 8505C og K1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af lidocain (L6, 6 mm. L12, 12 mM) og bupivacain (B2, 2 mM; B4, 4 mM) i 16 timer. Celler blev høstet og prøver blev fremstillet til Western blot-analyse. C, kontrol. PARP, poly (ADP-ribose) polymerase. (B) Virkning af caspase 3 i cellelysater fra 8505C celler behandlet med lidocain (12 mM) og bupivacain (4 mM) i forskellige tidsrum bestemtes ved anvendelse af et kolorimetrisk protease assay. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien.

Proteinerne fra Bcl-2-familien deltage i den apoptotiske proces ved at fungere som promotorer (

f.eks

, Bax) eller inhibitorer (

f.eks

, Bcl-2). For at aktivere mitokondrie apoptotiske vej, aktiveret Bax danner et oligomert pore og resulterer i permeabilisering af mitokondrie ydre membran. Vi fandt, at behandling med lidocain og bupivacain føre til en reduktion i Bcl-2-niveauer med en samtidig stigning i Bax niveauer (fig. 4A). Derfor lokalanæstetika ændre proteinniveauer af vigtige medlemmer af Bcl-2-familien på en måde, der favoriserer en stigning i forholdet Bax /Bcl-2, som kan bidrage til følsomheden af ​​skjoldbruskkirtlen cancerceller til apoptose.

analyse af genekspression signaturer berørt af lokalanæstetika

for at identificere genekspression signaturer, der er forbundet med biologiske funktioner af lokale anæstetika, microarray og sti berigelse analyse blev udført for at sammenligne ekspressionsmønstre i 8505C celler behandlet med lidocain og bupivacain. Top ti veje identificeret af pathway berigelse analyse er listet i tabel 1 og 2. Det er bemærkelsesværdigt, at den mest fremtrædende transkriptionelle ændring i skjoldbruskkirtlen cancerceller behandlet med lokalanæstetika er apoptose. Andre veje fælles for lidocain og bupivacain behandling omfatter cytoskelet remodeling og myeloid differentiering. Desuden brugte vi

i silico

værktøjer fra Opfindsomhed for at identificere veje sigende involverer molekylære mekanisme for kræft. Integration microarray data fra celler behandlet med lidocain og bupivacain, pathway analyse foreslog, at ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) 1/2 og p38 MAPK er signifikant op- eller nedreguleret i respons på behandling med lokalanæstetika (Fig. S2).

Modulation af mitogenaktiveret proteinkinase signalering

Vores microarray og sti berigelse analyse viser, at MAPK veje sandsynligvis er involveret i de mekanismer, der medierer virkningen af ​​lokalanalgetika på kræft i skjoldbruskkirtlen celler. For at undersøge denne mulige forhold, blev de samlede cellulære proteiner ekstraheret fra 8505C og K1-celler behandlet med lidocain (12 mM) og bupivacain (4 mM) i forskellige tidsperioder, og lysater blev immunblottet med specifikke antistoffer mod phosphoryleret og total ERK1 /2, p38 og c-Jun N-terminal kinase (JNK), hhv. Som vist i fig. 5, blev der observeret en formindsket phosphorylering af ERK1 /2. Lidocain og bupivacain signifikant øget phosphorylering af p38 og JNK. Lidocain og bupivacain havde nogen bemærkelsesværdig virkning på total p38 og JNK proteinniveauet.

8505C (A) og K1 (B) celler blev behandlet med lidocain (12 mM) og bupivacain (4 mM) for forskellige tidsperioder og aktiviteter ERK, p38, og JNK blev undersøgt ved Western blot-analyse under anvendelse af phospho-specifikke antistoffer. De samlede protein niveauer af ERK, p38, og JNK blev også målt.

Virkninger af hæmning af mitogenaktiverede proteinkinaser

Herefter vil vi gerne vide, om modulationer af ERK1 /2, p38 MAPK, og JNK signalveje udgør apoptose induceret af lokalanæstetika. Til dette formål har vi undersøgt virkningerne af specifikke inhibitorer på caspase aktivering og PARP spaltning. PD98059 er en inhibitor af MAPK /ERK-kinase (MEK), hvorved inhibering af phosphorylering og aktivering af MAPK. SB203580 er en selektiv, reversibel, og ATP-kompetitiv inhibitor af p38 MAPK, hvorimod SP600125 er en anthrapyrazolone JNK-inhibitor, der konkurrerer med ATP til at inhibere phosphoryleringen af ​​c-Jun. Som vist i fig. 6A og 6B, PD98059 og SB203580, men ikke SP600125, reduceret aktivering af caspase 3 og spaltning af PARP. Disse resultater blev bekræftet ved caspase 3-aktivitet-assay (fig. 6C). Samtidig behandling med PD98059 eller SB203580 undertrykt caspase 3-aktivitet, hvorimod SP600125 paradoksalt nok øget caspase 3-aktivitet efter behandling med lokalbedøvelse. Disse data er accordant med resultaterne af pathway berigelse analyse (fig. S2), der ERK1 /2 og p38 MAPK signalveje er involveret i apoptose induceret af lokalanæstetika. Salg

8505C (A) og K1 (B) celler blev cotreated med 30 pM PD98059 (PD), 30 uM SB203580 (SB), eller 30 uM SP600125 (SP) ud over 12 mM lidocain (L) eller 4 mM bupivacain (B) i 16 timer. Celler blev høstet og prøver blev fremstillet til Western blot-analyse. C, kontrol. C3, caspase 3. PARP, poly (ADP-ribose) polymerase. (C) Aktivitet af caspase 3 i cellelysater fra 8505C celler behandlet med lidocain (12 mM) og bupivacain (4 mM) med eller uden specifikke inhibitorer i 24 timer blev bestemt ved anvendelse af et kolorimetrisk protease assay. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. *, P 0,01

versus

kontrol

Diskussion

Det har været mere end et århundrede siden den første syntetiske lokalbedøvelse blev indført i begyndelsen af ​​1900’erne.. Lokalanæstetika binder reversibelt til en specifik receptor sted inden i natriumkanaler og blokere ion bevægelse. Man troede, at virkningerne er reversible med genvinding af nerve funktion og uden skader på nerveceller. Imidlertid har rapporter om permanent neurologisk skade genereret bekymring over neurotoksicitet af lokalanæstetika [18]. Akkumulere tyder på, at lokalanæstetika kan forårsage hurtig neuronal død gennem udløsning apoptose og nekrose [19], [20]. Desuden har en række undersøgelser rapporteret lokalbedøvende toksicitet på andre celletyper [21] – [23]. I den foreliggende undersøgelse, vi først viste den direkte virkning af lidokain og bupivacain hæmme cellevækst og kolonidannelse af skjoldbruskkirtlen kræftceller.

Mekanismerne i celle toksicitet fra lokalanæstetika er ikke blevet fuldt belyst. I U937 histiocytisk lymfomceller, lidocain apoptose ved koncentrationer under 12 mM og induceret nekrose ved koncentrationer over 15 mM [24]. Der er rapporteret om lignende observationer af andre [19], [20], [25]. I denne undersøgelse både apoptose og nekrose deltage i celledød induceret af lokalanæstetika. Interessant nok blev en svag antagonisme identificeret med kombinationen af ​​lidocain og bupivacain. Det virker sandsynligt, at lidocain og bupivacain inducere celledød ved en lignende mekanisme. Når en celle er ikke i stand til at dø ved apoptose, kan den undergå nekrotisk celledød. Det er velkendt, at ATP niveauer er en afgørende faktor for manifestation af celledød [26], [27]. Lidocain og bupivacain blev vist at nedsætte ATP-niveauer og levedygtighed melanomceller [28]. Tilstanden af ​​celledød sandsynligvis afhænger af varigheden af ​​eksponering og koncentrationer af lokalanalgetika.

Mitochondriale energetik berørt af lokalanalgetika kan forklare faldet i ATP-niveauer. Lokalanæstetika kan nå mitokondrier og denne virkning er stærkt afhængig af lipid-opløselighed af lokalbedøvelse [29]. Klinisk og eksperimentel myopati induceret af bupivacain er blevet rapporteret at resultere fra mitokondriel dysfunktion og nedsat oxidativ energistofskifte [30], [31]. Specifikt bupivacain undertrykt celle respiration gennem hæmning af komplekser I og III, ledsaget med produktion af reaktive oxygenarter [32]. Irwin

et al.

Har vist, at bupivacain muskeltoksicitet påberåbt aktiv oxidativ metabolisme, fordi meget glykolytisk extensor digitorum longus var resistente over for bupivacain-induceret toksicitet [30]. Ikke desto mindre tumorceller overvejende producerer energi gennem glycolyse (Warburg virkning) [33]. Vores resultater er i overensstemmelse med de af et par rapporter, der viser, at mitokondriel dysfunktion også kan fremkaldes ved lokalbedøvelse i maligne tumorceller [24], [25], [34].

Mitokondrier er væsentlige modulatorer af apoptose , nekrose og autophagy [27]. Den iboende (mitochondrial) pathway af apoptose medieres af frigivelsen af ​​pro- og anti-apoptotiske proteiner, herunder cytochrom c. I vores eksperimenter, lokalanæstetika forøget pro-apoptotisk Bax ekspression og nedreguleret Bcl-2-ekspression, hvilket fører til et højere forhold mellem pro-apoptotiske og anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner. Det øgede Bax /Bcl-2-forhold letter frigivelsen af ​​mitokondrie cytochrom c, som efterfølgende inducerer aktiveringer af caspasekaskaden som spalter PARP til inaktive fragmenter. Imidlertid lidocain og bupivacain fremmes mitokondrie skade i et omfang der er mindre end apoptose induceret af de samme koncentrationer af lokalbedøvelse. Dette antyder, at en mitokondrier-uafhængig proces også kan spille en rolle. Denne hypotese understøttes af resultaterne af sti berigelse analyse (fig. S2), hvor transkriptionelle ændringer i døden receptor pathway komponenter var involveret.

Cellular mikroarrays er stærke eksperimentelle værktøjer til identifikation af nye lægemiddelkandidater og farmakogenomforskning . UNAMI og kolleger først rapporteret, at apoptose-relaterede gener transkriptionelt blev reguleret af bupivacain ifølge microarray analyse [34]. For nylig Lucchinetti

et al.

Viste, at flere transkriptionelle programmer vedrørende celledifferentiering, tumorgenese, og metastase negativt påvirket af ropivacain [35]. Forfatterne postulerer, at dette betyder hidtil ukendte rationaler for perioperative anvendelse af lokalanæstetika i patienter med cancer. Vores data er samstemmende med disse resultater og viste en stærk forbindelse mellem lokale bedøvelsesmidler-inducerede ændringer i genekspression og apoptose. Endvidere har vi fundet, at MAPK-vejen er involveret i de molekylære mekanismer i apoptose induceret af lokalanæstetika.

I primære neuron kulturer, bupivacain og ropivacain fandtes at aktivere p38 MAPK og JNK men ikke ERK1 /2 [16] . Desuden farmakologisk hæmning af disse kinaser dæmper neurotoksicitet

in vitro

. Forfatterne bemærkede, at axonal degeneration induceret af lidocain forhindres af p38 MAPK inhibitor, men ikke af caspase hæmning [36]. Harato

et al.

Også vist, at p38 MAPK hæmmer behandling svækket caspase 3-aktivitet og celledød induceret af bupivacain [37]. I en anden undersøgelse er p38 MAPK-vejen impliceret i bupivacain-induceret apoptose i humane neuroblastom SH-SY5Y-celler [17]. I overensstemmelse med resultaterne i neuronal apoptose, fandt vi, at p38 MAPK aktivering spiller en afgørende rolle i den lokale bedøvelsesmidler-induceret apoptose i skjoldbruskkirtlen cancerceller. Negativ regulering af spredning er et stærkt bevaret og vigtig funktion af p38a i forskellige celletyper [38]. Interessant, har opreguleret p38a aktivitet blevet rapporteret i papillær og follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen [39]. Begrebet er støttet af den basale ekspression af phospho-p38-proteiner i denne undersøgelse (Fig. 5). Den dobbelte rolle for p38 MAPK i kræft i skjoldbruskkirtlen biologi stadig en næsten uudnyttet område på trods af Ras-Raf-ERK-vejen er blevet omfattende undersøgt i kræft i skjoldbruskkirtlen.

I den foreliggende undersøgelse, ERK1 /2-aktivitet blev undertrykt af lidocain og bupivacain. Joo

et al.

Viste, at lidocain undertrykte signifikant den forøgede ERK1 /2 respons i en rotte model for neuropatisk smerte [40]. For nylig lithium viste sig at beskytte mod bupivacain-induceret neuronal beskadigelse gennem ændring undertrykkelsen af ​​ERK1 /2 signalering [41]. Der er stigende evidens for en krydstale mellem MAPK veje. For eksempel kan p38 og JNK-aktivering i induktionen af ​​apoptose negativt regulere ERK pathway [42]. Det er også værd at bemærke, at der er en paradoksal fald i caspaseaktivering efter PD98059 behandling. Mange genetiske ændringer har været impliceret i cancer i skjoldbruskkirtlen, og det uregelmæssige aktivering af Ras-Raf-ERK-vejen er hyppigst [43]. Inhibering af MAPK pathway anholdelser skjoldbruskkirtlen kræftceller i G1-fasen [44]. Derfor er en plausibel forklaring på vores resultater er, at ERK1 /2 hæmning øget følsomhed af thyreoidea kræftceller til andre mekanismer for væksthæmning som cellecyklusstop og nekrose, som ikke involverer caspaseaktivering.

Konklusioner

sammenfattende vores undersøgelse tydet de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for cytotoksicitet induceret af lokalbedøvelse i skjoldbruskkirtlen kræftceller, præsentere inddragelsen af ​​MPAK signalveje og foreslå potentielle fordele ved brugen af ​​lokalanæstetika i klinisk praksis.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

den menneskelige thyreoideakarcinom cellelinjer 8505C og K1 blev købt fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og Europæiske Indsamling af cellekulturer (ECACC, Salisbury, Storbritannien), hhv. 8505C-celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i RPMI 1640 medium (Invitrogen /Gibco, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). K1-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco) blandet med Hams F12 (Gibco) og MCDB 105 (Sigma, St. Louis, MO) medium i 2:1:1 proportioner, suppleret med 10% FBS og 2 mM L- glutamin. Både 8505C og K1 er blevet godkendt til at være unikke kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer [45]. Lidocain, bupivacain, procain, PD98059, SB203580, og SP600125 blev opnået fra Sigma. Osmolalitet af dyrkningsmedier til eksperimenter blev analyseret ved frysepunktet depression metode ved hjælp af en avanceret 3320 Micro Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA).

Cell levedygtighed assay og narkotika kombination analyse

Cell levedygtighed assay blev udført tre gange for hvert forsøg som tidligere beskrevet [46]. Kort fortalt 8505C og K1-celler blev podet i 96-brønds plader en dag før lidocain og bupivacain (enkeltvis eller i kombinationer) blev tilsat i de angivne koncentrationer. For thiazolyl blå tetrazolium (MTT) kolorimetrisk assay, 100 pi MTT-reagens (5 mg /ml; Sigma) blev tilsat til cellekulturen, og celler blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Formazankrystallerne konverteret fra tetrazoliumsalte ved levedygtige celler blev solubiliseret med syrnet isopropanol. Absorbansen blev målt med Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ved en bølgelængde på 570 nm. Absorbansen af ​​kontrolcellerne (inkuberet uden stoffer) blev defineret som 100%.

Drug synergi blev bestemt ved CI og isobologram analyser ifølge de Median effekt metoder beskrevet af Chou og Talalay [47]. På grundlag af dosis-respons-kurver fra MTT-assays blev Cl-værdier beregnes. Synergi, additivitet og antagonisme defineres som CI 1, CI = 1 og CI 1 hhv. I isobologram graf, kombination datapunkter, der falder på, over og under den skrå linie repræsenterer et additiv, antagonistisk, og synergistisk effekt, henholdsvis.

Colony dannelse assay

For kolonidannelse assay , 400 celler /brønd blev podet i seks-brønds plader, fik lov til at klæbe i 24 timer og behandlet med de angivne koncentrationer af lidocain og bupivacain fra dag 2. efter 8 til 15 dage blev kolonier farvet med 3% krystalviolet og kolonier indeholder . 50 celler blev talt

Cell cyklus analyse

effekten af ​​lidokain og bupivacain på cellen cyklus blev analyseret af PI farvning og flowcytometri [48]. Efter behandling med lidocain og bupivacain til 6, 24 og 48 timer blev thyreoideacancerceller høstet, forsigtigt vasket og fikseret i 70% kold ethanol ved 4 ° C natten over. De fikserede celler (1 x 10

6) blev inkuberet med RNase A i 30 min ved stuetemperatur, og farvet med PI opløsning under anvendelse af BD Cycletest Plus DNA reagenskittet (BD Biosciences, San Jose, CA) i mørke. Efterfølgende blev cellerne analyseret på en FASCalibur flowcytometer (BD Biosciences) udstyret med CellQuest Pro software. Fordelingen af ​​celler i G0 /G1, S og G2 /M faser af cellecyklus blev estimeret ved hjælp af ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME). Som et skøn over andelen af ​​apoptotiske celler, blev procentdelen af ​​hypodiploid celler beregnet i DNA histogrammet.

Analyse af celleapoptose

Cell apoptose blev analyseret ved anvendelse af annexin V-fluoresceinisothiocyanat ( FITC) apoptose afsløring kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Thyroid cancer celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af lidocain og bupivacain i 24 til 72 timer. Både flydende og vedhæftede celler blev høstet og vasket, efterfulgt af inkubation med 5 pi annexin V-FITC og 5 pi PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter inkubationen blev 400 pi bindingsbuffer tilsat, og flowcytometri blev udført analyse.

Bestemmelse af mitochondriemembranpotential (ΔΨ

m)

mitochondriemembranpotential blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af ΔΨ

m-afhængige fluorescerende farvestof JC-1 (CS0390, Sigma). JC-1 er en lipofil, kationisk farvestof, som selektivt kan træde i mitokondrier, og undergår en reversibel ændring i fluorescensemission ifølge ΔΨ

m. Sunde celler med høj ΔΨ

m vil danne JC-1 aggregater og fluorescerer rødt, disse apoptotiske celler med lav ΔΨ

vil m indeholde monomere JC-1 og fluorescerer grønt. Efter behandling med lidocain og bupivacain i den angivne tid blev thyroidcancer celler høstet og inkuberet med JC-1 i 20 minutter ved 37 ° C ifølge producentens anvisninger. Prøverne blev derefter underkastet flowcytometri.

Western blot-analyse

Totalt cellulært proteiner blev ekstraheret, kvantificeret, og underkastet gelelektroforese ifølge standardprocedurer, som vi beskrev tidligere [49].