PLoS ONE: kombineret behandling med exendin-4 og Metformin Dæmper Prostata Cancer Growth

Abstrakt

Introduktion

For nylig er der rapporteret de pleiotrope fordele inkretin-baseret behandling. Vi har tidligere rapporteret, at exendin-4, et glucagonlignende peptid-1 (GLP-1) receptor agonist, dæmper prostatakræft vækst. Metformin er kendt for sin anti-cancer virkning. Her undersøgte vi anti-cancer effekt af exendin-4 og metformin ved hjælp af en prostatakræft model.

Metoder

Prostatakræft celler blev behandlet med exendin-4 og /eller metformin. Celleproliferation blev kvantificeret ved vækstkurver og 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) assay. TUNEL assay og AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) fosforylering blev undersøgt i LNCaP celler. For

in vivo

eksperimenter, LNCaP-celler blev transplanteret subkutant i flanken region athymiske mus, som derefter blev behandlet med Exendin-4 og /eller metformin. TUNEL-assay og immunohistokemi blev udført på tumorer.

Resultater

Exendin-4 og metformin additivt faldt vækstkurven, men ikke migrationen, af prostatacancerceller. BrdU-assay viste, at både Exendin-4 og metformin faldt betydeligt prostatakræft celleproliferation. Endvidere metformin, men ikke Exendin-4, aktiveret AMPK og induceret apoptose i LNCaP-celler. Den anti-proliferative effekt af metformin blev afskaffet ved hæmning eller vælte af AMPK.

In vivo

, Exendin-4 og metformin faldt betydeligt tumorstørrelse, og yderligere signifikant reduktion tumorstørrelse blev observeret efter kombineret behandling. Immunhistokemi på tumorer afslørede, at P504S og Ki67-ekspression faldt med Exendin-4 og /eller metformin, og at metformin øget phospho-AMPK ekspression og den apoptotiske celletal.

Konklusion

Disse data tyder at Exendin-4 og metformin svækket prostatakræft vækst ved at hæmme proliferation, og at metformin inhiberede proliferation ved induktion af apoptose. Kombineret behandling med Exendin-4 og metformin svækket prostatakræft vækst mere end særskilte behandling

Henvisning:. Tsutsumi Y, Nomiyama T, Kawanami T, Hamaguchi Y, Terawaki Y, Tanaka T, et al. (2015) kombineret behandling med exendin-4 og Metformin Dæmper Prostata Cancer Growth. PLoS ONE 10 (10): e0139709. doi: 10,1371 /journal.pone.0139709

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Juni 28, 2015; Accepteret: September 16, 2015; Udgivet: 6 oktober 2015

Copyright: © 2015 Tsutsumi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. MSD begavet en stol i vores afdeling og ydet støtte i form af løn til forfatteren, Tomoko Tanaka, PhD. Men Dr. Tanaka er ikke en medarbejder i MSD. MSD donerer en begavet stol til vores afdeling, og vores afdeling ansætte hende ved hjælp af en del af tilskud fra MSD. Eli Lilly ydet økonomisk støtte som fælles forskning. Men disse virksomheder ikke har nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Eli Lilly ydet finansiel støtte som fælles forskning. MSD donerer en begavet stol til vores afdeling, og vores afdeling beskæftiger forfatteren Tomoko Tanaka, PhD ved hjælp af en del af støtten fra MSD. TN har modtaget forelæsning gebyrer fra Astrazeneca, Astellas, Boehringer Ingelheim, Eli Lilly, MSD, Novartis Pharma, Ono Pharmaceutical Co. Ltd., Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co. Ltd., Mitsubishi Tanabe Pharma og Sumitomo Dainippon Pharma, og forskningsmidler fra Astellas og MSD. TY blev støttet økonomisk for sin forskning af MSD, Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Daiichi Sankyo Company Ltd., Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd., Sanwa Chemistry Co., Ltd., Eli Lilly, Novo Nordisk Pharma Ltd ., Novartis Pharma, Kowa Company Ltd., og Fujifilm Pharma Co, Ltd Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Forkortelser:. AMPK, AMP-aktiveret protein kinase; AR, androgen receptor; DPP-4, dipeptidylpeptidase-4; Ex-4, exendin-4; ERK-MAPK, ekstracellulært signal-kinase-mitogenaktiveret proteinkinase; GAPDH, glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase; GLP-1, glucagon-lignende peptid-1; GLP-1R, GLP-1 receptor; IGF-1, insulin-lignende vækstfaktor-1; mTOR, pattedyr mål for rapamycin; NFkB, nuklear faktor kappa-let kæde-enhanceren af ​​aktiverede B-celler; PSA, prostata serum antigen

Introduktion

inkretinbaserede behandling, herunder dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) inhibitorer og glucagon-lignende peptid-1 receptor (GLP-1R) agonister, har blevet en populær behandling for type 2-diabetes. For nylig er meget opmærksomhed været rettet mod inkretin, på grund af dets væv-beskyttende virkninger ud over sænkning glucoseniveauer [1]. Vi har påvist de vaskulære beskyttende virkninger af Exendin-4 (Ex-4), en GLP-1 R-agonist, som det svækkede aterom dannelse i apoE

– /- mus via hæmning af NFkB-aktivering i makrofager [2], og det reducerede intimal fortykkelse efter vaskulær beskadigelse via AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) aktivering i vaskulære glatte muskelceller [3]. Derudover har vi for nylig vist, at DPP-4-hæmmer, linagliptin, nedsat neointima-dannelse efter vaskulær læsion [4]. Således kan inkretinbaserede terapi forbedre livskvalitet og dødelighed af patienter med diabetes gennem sine vaskulære-beskyttende virkninger. Men kræft er en anden væsentlig dødsårsag hos patienter med diabetes [5], især i Japan, hvor det er den hyppigste dødsårsag hos patienter med type 2-diabetes [6]. Følgelig Japan Diabetes Society og Japan Cancer Association har udsendt en advarsel om øget risiko for kræft hos diabetespatienter [7]. Men antallet af undersøgelser, der har undersøgt, anti-cancer effekt af inkretin er begrænset.

For nylig har vi undersøgt anti-prostatakræft effekt af Ex-4 både

in vivo

in vitro

[8]. Vi har detekteret GLP-1R ekspression i humane prostatakræft væv og prostatakræft-cellelinier, og Ex-4 svækket prostatakræft vækst både

in vitro

in vivo

via hæmning af ekstracellulært signal-regulerede kinase-mitogenaktiveret proteinkinase (ERK-MAPK) aktivering, hvilket fører til hæmning af celleproliferation [8]. Som meta-analyse har foreslået, at forholdet mellem prostatakræft og diabetes eller metabolisk syndrom er stadig under drøftelse [9-13]. En nylig undersøgelse har imidlertid antydet, at eksisterende diabetes også er forbundet med højere mortalitet hos patienter med prostatacancer, på samme måde som andre cancerformer [14]. Desuden er en opfølgning undersøgelse af 2.546 patienter med prostatakræft afsløret, at både høj body mass index og plasma C-peptid koncentration øget risiko for dødelighed [15]. Desuden har vi tidligere rapporteret, at insulin og insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) accelererer prostatacancer celleproliferation gennem androgen receptor (AR) aktivering ved at forstyrre dets direkte interaktion med Foxo1 [16]. Disse data favorisere den hypotese, at insulinresistens og hyperinsulinisme i præ- eller tidlige diabetiske tilstande og metabolisk syndrom er forbundet med dårlig prognose for patienter med prostatacancer. Imidlertid har metformin været kendt som et anti-diabetisk middel, der også har en anti-cancer virkning [17, 18]. Metformin dæmper kræft vækst indirekte gennem reduktion i serum-insulin og IGF-1-koncentration skyldes forbedring i insulinfølsomheden, og direkte gennem cellecyklus arrest og hæmning af pattedyr mål for rapamycin (mTOR) efter AMPK aktivering [19]. Endvidere har en detaljeret undersøgelse påvist en direkte anti-prostatakræft effekt af metformin

in vivo

in vitro

[20].

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte de anti-cancer effekter af Ex-4 og /eller metformin behandling

in vivo

og

in vitro

, ved hjælp af en prostatakræft model.

Materialer og metoder

Dyr

athymiske CAnN.Cg-

Foxn1nu

/CrlCrlj ikke-diabetiske hanmus blev købt fra Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan) og har til huse i specifikke pathogen- gratis barriere faciliteter på Fukuoka Universitet. Musene blev behandlet med enten saltvand (n = 10) eller Ex-4 (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) ved 300 pmol kg legemsvægt

-1 dag

-1 (n = 10), leveret af en mini osmotisk pumpe (ALZEST, model 1004, Durect, Cupertino, CA, USA), eller med metformin (Wako rent kemiske industrier, Ltd, Osaka, Japan) på 750 mg kg

-1 dag

-1 ved blanding det med foderet (n = 10), eller med kombineret Ex-4 og metformin (n = 10). I en alder af 6 uger, 1 x 10

6 (passage 4-8) LNCaP-celler blev blandet med 250 pi Matrigel (Becton Dickinson laboratorieudstyr, Bedford, MA, USA) og transplanteres subkutant i flanken region, og osmotisk pumpe blev transplanteret under huden på bagsiden af ​​hver mus under anæstesi med 2% isofluran inhalering. I en alder af 12 uger blev blodprøver indsamlet, og musene blev aflivet. En mus behandlet med Ex-4 døde i en alder af 10 uger, 4 dage efter transplantation af en ny infusionspumpe af Ex-4, på grund af konflikter. Tumor volumen blev beregnet med en modificeret ellipsoiden formel: længde × bredde

2 × 0,52. Paraffinindlejrede formalinfikserede tumorer blev skåret i 5-um snit og forberedt til immunfluorescensfarvning, som tidligere beskrevet [8]. Prostata serum antigen (PSA) proteinkoncentrationer i museserum måltes ved anvendelse af et EIA på SRL Inc. (Tokyo, Japan). Serumkoncentrationer insulin blev målt ved hjælp af en VVM-kit købt fra Morinaga Institute of Biological Science Inc. (Yokohama, Japan). Alle procedurerne i dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care underudvalget ved Fukuoka Universitetshospital.

Cell Kultur og celleproliferationsassays

De humane prostatakræft-cellelinier, LNCaP, PC3 og DU145-celler, blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). LNCaP-celler og DU145 celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, PC3-celler blev dyrket i Hams F-12. Alle medier blev suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Celleproliferationsassays blev udført som tidligere beskrevet [8] med mindre modifikationer. Kort beskrevet blev celler (3 x 10

4 celler /plade) blev udpladet på 3,8 cm

2 plader og vedligeholdes med medier indeholdende 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin med eller uden 0,1-10 mM metformin, 10 nM Ex-4, en kombination af 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin, eller 0,1 uM forbindelse C, en AMPK inhibitor (Sigma-Aldrich). Celleproliferation blev analyseret efter 0-4 dage ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. For alle eksperimenter, ligeledes passeret (passage 4-8) celler blev anvendt. Forsøg blev udført in triplo under anvendelse af tre forskellige præparater af celler.

siRNA Knock ned af AMPK Ekspression og celleproliferationsassay

siRNA vælte og celleproliferationsassay blev udført som tidligere beskrevet [8] . At knockdown AMPK, en målværdi på metformin, brugte vi AMPKɑ1 /2 siRNA (h) (sc-45.312, Santa Cruz, Santa Cruz, USA) og kontrol siRNA (sc-36869, Santa Cruz). For transfektion blev LNCaP-celler udpladet ved en densitet på 1 x 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og transficeret med 10 nM AMPKɑ1 /2 siRNA (h) eller Kontrol siRNA hjælp MISSION

® siRNA transfektionsreagens (Sigma-Aldrich). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne udsat for celleproliferationsassay. Kort fortalt blev cellerne løsrevet og re-udpladet i 12-brønds vævskulturplader i komplette medier med eller uden 0,1 mM metformin. Tre dage efter behandlingen blev celler opsamlet og talt ved anvendelse af et hæmocytometer.

BrdU-assays

At evaluere LNCaP-spredning, bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering assay blev udført under anvendelse af celleproliferation ELISA-kits ( 1647229, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) som beskrevet tidligere [8]. Kort fortalt blev LNCaP-celler med eller uden siRNA transfektion udplades ved 5000 celler /brønd i 96-brønds dyrkningsplader i komplette medier. Efter opnåelse 60-70% konfluens blev LNCaP-celler behandlet med eller uden 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, en kombination af 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin, eller Forbindelse C i medier med 10% FBS i 24 timer . BrdU-opløsning (10 uM) blev tilsat i de sidste 2 timer af stimulering. Derefter blev cellerne tørret og fikseret, og det cellulære DNA blev denatureret med FixDenat-opløsning (Roche Applied Science) i 30 minutter ved stuetemperatur (RT). En peroxidase-konjugeret muse-anti-BrdU monoklonalt antistof (Roche Applied Science) blev sat til dyrkningspladerne og inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Endelig tetramethylbenzidin-substrat blev tilsat i 5 minutter ved stuetemperatur og absorbansen af ​​prøverne blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japan) ved 450-620 nm. Mean data er udtrykt som et forhold mellem kontrolgruppen (ubehandlet) celleproliferation.

Apoptose analyser

For mærkning kerner af apoptotiske celler, 1,5 × 10

5 LNCaP celler udpladet på glas dækglas i Lab-Tek Chamber Slides (177.380, Nunc, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og fikseret i 4% paraformaldehyd i 25 min. At forbehandle paraffinindlejret væv blev snit deparaffineret, vasket med xylen og ethanol og fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Hver sektion blev inkuberet med 20 pg /ml proteinase K opløsningen i 10 minutter, vasket og re-fikseret i 4% paraformaldehyd i 5 min. TUNEL-farvning blev udført under anvendelse af deadend fluorometriske TUNEL-system (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens protokol. Under den afsluttende 24 timer blev LNCaP-celler inkuberet med 0,1 eller 10 mM metformin. LNCaP-celler behandlet med 1 enhed /100 pi RQ1 RNase-fri DNase (M6101; Promega) i 10 minutter blev anvendt som en positiv kontrol. blev udført tre uafhængige forsøg.

Immunhistokemi

En paraffin afsnit blev foretaget fra midten af ​​en tumor. Paraffinsnit blev inkuberet med anti-GLP-1 R-antistof (NBP1-97308; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), anti-P504S antistof (sc-81.710; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-Ki67-antistof (ab66144; Abcam , Cambridge, UK), anti-AR-antistof (sc-816; Santa Cruz Biotechnology Inc.) eller anti-phospho-AMPKα antistof (Thr172) (# 2535; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Sektioner analyseret for GLP-1Rand phospho-AMPKα (Thr172) blev efterfølgende inkuberet med Alexa Fluor 488 ged anti-kanin IgG (A-11008; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og sektioner analyseret for P504S, AR og Ki67 var efterfølgende inkuberet med Alexa Fluor 546 ged anti-kanin IgG (A-11010; Life Technologies). Sektioner blev modfarvet med DAPI og visualiseres ved en LSM710-ZEN 2008 konfokalmikroskop (Carl Zeiss Japan MicroImaging Co., Ltd., Tokyo, Japan). blev observeret fire felter af en sektion, og positive celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Dataene er gennemsnittet af fire uafhængige tæller i et afsnit.

Western blot-analyse

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [8]. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-mTOR (# 2983; Cell Signaling), anti-phospho-mTOR (Ser2448) (# 2971; Cell Signaling), anti-phospho-AMPKɑ (Thr172) (# 2535; Cell Signaling), anti-AMPKɑ (# 2532; Cell Signaling) og anti-GAPDH (sc-20375; Santa Cruz). Ekspressionen af ​​disse proteiner blev undersøgt i LNCaP-celler, som blev inkuberet i medier med 10% FBS, og efterfølgende stimuleret med eller uden 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, eller en kombination af 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin til 24t

cellemigrationsassay

Cell migration assay blev udført under anvendelse af CytoSelect 24 brønde cellemigration Kolorimetrisk Format assay (CBA-100-C; Cell Biolabs). efter producentens produkt manual. Hver brønd indeholdt en Boyden kammer med en 8-um pore polycarbonatmembran og medier indeholdende 10% FBS med eller uden 10 nM Ex-4, 0,1 mM metformin, eller en kombination af 10 nM Ex-4 og 0,1 mM metformin. Kamre blev formet til ark med 1,5 × 10

5 LNCaP-celler eller PC3-celler i serumfrit medium og inkuberet ved 37 ° C natten over. Celler i brønde blev skyllet væk, og migrerende celler blev farves og tælles ved hjælp af en mikropladelæser ved OD 570 nm.

Statistisk analyse

-parret

t-

tests og en- envejs variansanalyse (ANOVA) blev udført til statistisk analyse efter behov.

P

værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM.

Resultater

exendin-4 og Metformin Mindsk Prostata Cancer Growth additivt

In Vivo

Vi behandlede atymiske mus, der blev transplanteret med LNCaP-celler, med subkutant indgivet Ex-4, oralt fodret metformin eller kombineret behandling. Efter 6 ugers behandling, tumor mounding var fraværende i en mus af Ex-4-behandlede gruppe, to mus af metformin-behandlede gruppe og tre mus i den kombinerede gruppe behandling. Beregning af tumorstørrelse under anvendelse af den modificerede ellipsoide formel afslørede, at tumorvolumen faldt betydeligt efter behandling med både Ex-4 og metformin sammenlignet med kontrolgruppen, men blev observeret yderligere reduktion i tumorstørrelse i den kombinerede behandling mus (Fig 1A og 1B). Måling af vægten af ​​de dannede tumorer viste, at den kombinerede behandling med Ex-4 og metformin signifikant reduceret tumor vægt sammenlignet med den for kontrollen og separat behandling med Ex-4 eller metformin (Fig 1C). Disse data tyder på, at Ex-4 og metformin svækket prostatakræft vækst

in vivo

, og den kombinerede behandling med dem begge faldet yderligere tumorvækst additivt.

(A) athymiske CAnN.Cg-

Foxn1nu

/CrlCrlj mus (i alderen 6 uger) blev transplanteret med 1 × 10

6 LNCaP celler (passage 4-8) og behandlet med vehikel (n = 10), Ex-4 (300 pmol kg kropsvægt

-1 dag

-1, n = 9), metformin (opfyldt 750 mg kg

-1 dag

-1, n = 10), eller en kombineret behandling af Ex- 4 og metformin (n = 10). Tumorer blev afbildet ved 12 ugers alderen. (B) Tumorvolumen blev beregnet med den modificerede ellipsoide formel. Uparret

t-

tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (**

P

0,01 versus kontrol). I mus uden mounding tumor, blev tumorvolumen beregnet som “nul”. (C) Tumorvægt blev målt på skalaer. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (**

P

0,01 vs. kontrol

#

P

0,05 vs. Ex -4). I musene uden mounding tumor, blev tumorvægt beregnet som “nul”.

i disse mus, den endelige kropsvægt og plasmaglucoseniveau var signifikant lavere i metformin-behandlede gruppe sammenlignet med den kontrol og Ex-4-behandlede grupper (tabel 1). Plasma PSA niveauet faldt lidt efter Ex-4 eller metformin behandling alene sammenlignet med kontrollen, og en yderligere og blev observeret signifikant reduktion efter den kombinerede behandling sammenlignet med kontrollen (Tabel 1). Ex-4 forøgede signifikant seruminsulin niveau; Men den kombinerede Ex-4 og metformin behandling faldt det til kontrol niveau (tabel 1).

exendin-4 og Metformin Formindsk Cell Proliferation og øge GLP-1R Expression

immunohistokemisk analyse af paraffinindlejrede afsnit af subkutane prostatakræft tumorer viste, at Ki67-ekspression, som klart var lokaliseret i kernen, blev signifikant undertrykt af Ex-4, metformin og den kombinerede behandling (fig 2A og 2B). Dog blev en ekstra fald i Ki67-positive celler ikke observeret i den kombinerede behandling sammenlignet med den særskilte behandling. Ekspressionen af ​​P504S, en prostata cancer markering, dramatisk reduceret med Ex-4, metformin og den kombinerede behandling (fig 2C). Kvantificering af P504S ekspression baseret på det gennemsnitlige antal P504S-positive celler divideret med det samlede antal kerner bekræftede, at der var en signifikant reduktion i cancerceller efter Ex-4, metformin og den kombinerede behandling (Fig 2D). Interessant, at antallet af prostatacancerceller, der udtrykker GLP-1R steg efter Ex-4 og /eller metformin behandling (fig 2C). Kvantificering af den del GLP-1R-positive celler afslørede, at kombineret behandling markant stigning i antallet af GLP-1R-positive celler i sammenligning med kontrolgruppen (fig 2E). Endvidere har vi påvist AR-positive celler i prostata cancer tumor (fig 2F). Ingen ændring blev observeret i AR udtryk efter Ex-4 og metformin behandling i prostata cancer tumor (Fig 2G).

Paraffin-indlejrede tumor sektioner (5 um) blev udsat for immunhistokemi for (A) Ki67, ( C) P504S og GLP-1R, og (F) AR, og modfarvet med DAPI. Forstørrelse, × 400. (B) Ki67, (D) P504S, (E) GLP-1R, og (G) AR-positive celler blev kvantificeret ved at analysere den del af farvede celler i tumoren i forhold til det samlede antal kerner. Værdierne er udtrykt som en procentdel af positive celler. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrol).

exendin-4 og metformin dæmpe prostatakræft Cell Proliferation, men ikke cellemigration

Vi næste undersøgte effekten af ​​Ex-4 og metformin på prostatakræft celler

in vitro

. I vores tidligere undersøgelse [8], observerede vi, at Ex-4 signifikant reducerede celleantal af de humane androgenafhængige celler, LNCaP-celler, og af de menneskelige androgen-uafhængige celler, PC3-celler og DU145 celler, i vækstkurverne i en dosisafhængig måde. Svarende til Ex-4 behandling, metformin reducerede celleantal af LNCaP-celler (Fig 3A), PC3-celler (Fig 3b) og DU 145-celler (fig 3C) på en dosis-afhængig måde. Endvidere den kombinerede behandling af 0,1 mM metformin og 10 nM Ex-4 additivt svækkede vækstkurven progression af LNCaP-celler (Fig 3D) og PC3-celler (fig 3E), men ikke af DU145-celler (fig 3f). Vi undersøgte dernæst den mekanisme, hvormed Ex-4 og metformin inhiberer prostatakræft cellevækst. Først udførte vi en BrdU inkorporering assay for at vurdere DNA-syntese. Ex-4 og metformin behandling alene i 24 timer signifikant nedsat DNA-syntese i LNCaP-celler (figur 3G). Selvom behandling med metformin alene ikke forårsagede en statistisk signifikant reduktion i BrdU inkorporering i PC3-celler (Fig 3H), Ex-4 og metformin faldt BrdU inkorporering i både PC3 celler og DU145 celler (Fig 3I), på samme måde som LNCaP celler. Den kombinerede behandling af metformin og Ex-4 faldet yderligere BrdU inkorporering, tyder på, at metformin og Ex-4 additivt faldt DNA-syntese i prostata cancer celler (Fig 3G-3i). Endvidere udførte vi en migration assay på LNCaP-celler og PC3-celler. Desværre fik Ex-4, metformin og den kombinerede behandling ikke dæmpe cellemigrering i LNCaP-celler (figur 3J). I PC3-celler, blev en lille reduktion af behandlinger observeret, men det var ikke statistisk signifikant (Fig 3K). Disse data antyder, at Ex-4 og metformin dæmper prostatacancer celleproliferation, men ikke cellemigration.

(A) LNCaP-celler, (B) PC 3 celler og (C) DU145 celler blev opretholdt i medier suppleret med 10% FBS med eller uden metformin (0.1-10mM). Efter 0, 24, 48, 72 og 96 timer blev cellerne høstet, og celleproliferation blev analyseret ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (*

P

0,05, **

P

0,01 versus kontrol). (D) LNCaP-celler, (E) PC3-celler og (F) DU145 celler blev opretholdt som beskrevet i A-C, men med de angivne behandlinger. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (*

P

0,05, **

P

0,01 versus kontrol). (G) LNCaP-celler, (H) PC3-celler og (I) DU145-celler blev udpladet ved en densitet på 5000 celler /brønd i plader med 96 brønde i medium suppleret med 10% FBS og inkuberet med saltvand (kontrol), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM), eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM) i 24 timer. BrdU opløsning blev tilsat i de sidste 2 timer, og cellerne blev høstet til måling af DNA-syntese under anvendelse af en mikropladelæser ved 450-620 nm. Mean data er udtrykt som et forhold mellem kontrollen celleproliferation. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrol,

#

P

0,05 vs. Ex-4,

††

P

0,01 vs. metformin). (J) LNCaP-celler og (K) PC3-celler blev podet som 1,5 × 10

5 i hver kamre til migration assay. Efter kemo attraktion med 10% FBS med eller med saltvand (kontrol), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM) eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM) blev celler farvet og undersøgt ved OD 570 nm. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans.

Metformin inducerer apoptose og dæmper celledeling i prostata kræftceller via AMPK aktivering

Vi næste undersøgt apoptose ved anvendelse af TUNEL-assayet. Selvom apoptotiske celler ikke blev observeret i Ex-4-behandlede LNCaP celler i vores tidligere undersøgelse [8], blev opdaget en lille, men signifikant antal apoptotiske celler i 0,1 eller 10 mM metformin-behandlede LNCaP-celler (Fig 4A). Fordi AMPK aktivering er en af ​​de vigtigste molekylære mekanismer, hvormed metformin virker som en metabolisk og antiproliferativt middel [21], vi undersøgte AMPK phosphorylering i LNCaP-celler behandlet med metformin. Som vist i fig 4B, blev AMPK phosphoryleret efter metformin behandling. Kvantificering af den detekterede bånd densitometri afslørede en signifikant induktion af AMPK fosforylering i metformin-behandlede LNCaP celler, når normaliseret mod total AMPK (Fig 4C) og huset-holder gen, GAPDH (figur 4D). For at afklare, om AMPK er det vigtigste mål for metformin til dæmpning af LNCaP celledeling, brugte vi den AMPK-inhibitor, forbindelse C, eller slået ned AMPK af siRNA. Som vist i fig 4E og 4F, både Forbindelse C og siAMPK klart annulleret anti-proliferative effekt af metformin på LNCaP-celler. Derudover behandlinger med Forbindelse C eller siAMPK forøgede signifikant celletallet for metformin behandlede LNCaP-celler. Endvidere blev reduktionen i BrdU inkorporering induceret af metformin tydeligt ophævet ved både Forbindelse C og siAMPK (Fig 4G og 4H), og disse behandlinger øget BrdU inkorporering i metformin-behandlede LNCaP celler i overensstemmelse med vækstkurven analyse. Fordi det vigtigste mål for den anti-proliferative effekt af AMPK er inaktivering af mTOR, vi næste undersøgt mTOR aktivering ved hjælp western blotting. Som vist i fig 4I blev mTOR phosphorylering undertrykt af metformin behandling. viste imidlertid densitometrianalyse, at resultatet ikke var statistisk signifikant. Disse data antyder, at metformin inducerer apoptose og dæmper LNCaP celleproliferation via AMPK aktivering.

(A) LNCaP-celler blev udpladet på dækglas i Lab-Tek 2 boringen Chamber Slides. Efter inkubation med 0,1 eller 10 mM metformin i 24 timer, eller 1 enhed /100 pi RQ1 DNase (positiv kontrol) i 10 minutter, blev apoptotiske celler detekteret med TUNEL-farvning. Billeder viste er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) LNCaP celler opretholdt i medier med 10% FBS blev stimuleret med saltvand (kontrol), Ex-4 (10 nM), metformin (0,1 mM) eller begge Ex-4 (10 nM) og metformin (0,1 mM) i 24 h. Cellelysater blev høstet og underkastet western blotting for at vurdere phosphoryleret AMPK og AMPK ekspression. Phosphoryleret AMPK /AMPK proteinniveauer (C) og phosphorylerede AMPK /GAPDH proteinniveauer (D) blev kvantificeret ved densitometri. Data blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg, og er vist som et forhold mellem kontrol (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrol,

#

P

0,05,

##

P

0,05 vs. Ex-4). (E) LNCaP-celler blev holdt i medium suppleret med 10% FBS med forbindelse C (0,1 uM; CC) eller vehikelkontrol (NT), og med eller uden Met (0,1 mM). Efter 0, 24, 48 og 72 timer blev cellerne høstet, og celleproliferation blev analyseret ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. NT-kontrol,

#

P

0,05 vs. NT-Met 0,1 mM). (F) LNCaP-celler blev holdt i medium suppleret med 10% FBS efter transfektion af 10 nM kontrol siRNA (SICT) eller siRNA for AMPKa1 /2 (siAMPK) med eller uden Met (0,1 mM). Efter 0, 24, 48 og 72 timer blev cellerne høstet, og celleproliferation blev analyseret ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (**

P

0,01 vs. SICT-kontrol,

##

P

0,01 vs. SICT-Met 0,1 mM). (G) LNCaP-celler blev udpladet ved en densitet på 5000 celler /brønd i 96-brønds plader i medium suppleret med 10% FBS og inkuberet med forbindelse C (0,1 uM) (CC) eller vehikelkontrol (NT), og med eller uden Met (0,1 mM) i 24 timer. BrdU opløsning blev tilsat i de sidste 2 timer, og cellerne blev høstet til måling af DNA-syntese under anvendelse af en mikropladelæser ved 450-620 nm. Mean data er udtrykt som et forhold mellem kontrollen celleproliferation. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (**

P

0,01 vs. Met (-) og Compound C (-),

#

P

0,05 over Met (+) og forbindelse C (-)). (H) LNCaP-celler blev udpladet ved en densitet på 5000 celler /brønd i 96-brønds plader i medium suppleret med 10% FBS efter transfektion af 10 nM kontrol siRNA (SICT) eller siRNA for AMPKɑ1 /2 (siAMPK) med eller uden Met ( 0,1 mM) i 24 timer. BrdU opløsning blev tilsat i de sidste 2 timer, og cellerne blev høstet til måling af DNA-syntese under anvendelse af en mikropladelæser ved 450-620 nm. Mean data er udtrykt som et forhold mellem kontrollen celleproliferation. Uparret

t

-tests blev udført for at beregne statistisk signifikans (**

P

0,01 vs. Met (-) og siControl,

##

P

0,01 vs. Met (+) og siControl)

Metformin inducerer AMPK aktivering og apoptose i Prostata Cancer

In Vivo

Endelig, for at bekræfte.