PLoS ONE: Længere telomerlængde i perifere hvide blodlegemer er forbundet med risiko for lungekræft og rs2736100 (CLPTM1L-TERT) Polymorfi i en prospektiv kohorteundersøgelse blandt kvinder i China

Abstrakt

En nylig genom- sammenslutning undersøgelse af lungekræft blandt aldrig-ryger hunner i Asien viste, at rs2736100 polymorfi i

TERT-CLPTM1L

locus på kromosom 5p15.33 var stærkt og markant forbundet med risiko for adenocarcinom i lungerne. Telomerase-genet

TERT

er en revers transkriptase, der er kritisk for telomer replikation og stabilisering ved at styre telomer længde. Vi har tidligere fundet, at længere telomer længde målt i perifere hvide blodlegemer DNA var forbundet med øget risiko for lungekræft i et prospektivt kohorte studie af rygning mænd i Finland. For at følge op på dette resultat, har vi gennemført en nested case-control undersøgelse af 215 kvindelige sager lungekræft og 215 kvindelige kontroller, 94% af dem blev aldrig-rygere, i den kommende Shanghai Kvinders Health Study kohorte. Der var en dosis-respons sammenhæng mellem tertiles af telomer længde og risikoen for lungekræft (odds ratio (OR), 95% konfidensinterval [CI]: 1,0, 1,4 [0,8-2,5], og 2,2 [1,2-4,0], henholdsvis ; P trend = 0,003). Endvidere foreningen var uændret ved den tid fra blodprøvetagning til sag diagnose. Hertil kommer, at den rs2736100 G allelen, som vi tidligere har vist være forbundet med risiko for lungekræft i denne kohorte, var signifikant associeret med længere telomerer længde i de samme forsøgspersoner (P trend = 0,030). Vores resultater tyder på, at personer med længere telomer længde i perifere hvide blodlegemer kan have en øget risiko for lungekræft, men kræver replikation i yderligere potentielle kohorter og befolkninger

Henvisning:. Lan Q, Cawthon R, Gao Y, hu W, Hosgood HD III, Barone-Adesi F, et al. (2013) Længere telomerlængde i perifere hvide blodlegemer er forbundet med risiko for lungekræft og rs2736100 (

CLPTM1L-TERT

) Polymorfi i en prospektiv kohorteundersøgelse blandt kvinder i Kina. PLoS ONE 8 (3): e59230. doi: 10,1371 /journal.pone.0059230

Redaktør: Olga Y. Gorlova, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: September 19, 2012; Accepteret: 12. februar 2013; Udgivet 26. marts, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af murene midler fra National Cancer Institute (Bethesda, MD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Telomerase gen

TERT

er en omvendt transkriptase, der er afgørende for telomer replikation og stabilisering ved at kontrollere telomer længde. Telomerer er DNA-protein-komplekser, der cap enderne af kromosomer og fremme kromosomal stabilitet. Til dato, sammenhængen mellem telomer længde og kræftrisiko er ikke fyldestgørende. De fleste indledende undersøgelser anvendt en case-kontrol design og rapporterede, at kortere telomer længde målt i perifere hvide blodlegemer var forbundet med øget risiko for kræft [1]. I modsætning hertil har nogle nylige publikationer gennem en prospektiv kohorte design foreslået, at længere telomerlængde kan være forbundet med øget risiko for visse tumorer, herunder lunge, lymfom, hepatocellulært carcinom og melanom [2] – [5]. For nylig rapporterede to case-kontrol undersøgelser, der længere telomer længde var forbundet med colorectal, brystkræft, og brystkræft overlevelse [6] – [9]. Kortere telomer længde er blevet forbundet med aldring og både kortere og længere telomer længde har været forbundet med risiko for en række kroniske sygdomme [10], [11], selv om dette heterogenitet kan forklares delvist af case-kontrol vs. prospektive kohorte undersøgelsesdesign. Desuden er telomerlængde stærkt medieret af genetiske faktorer med en anslået arvelighed i området fra 44% til 80% [12], [13]. Flere undersøgelser har identificeret en række polymorfier, der var forbundet med telomer længde [8], [14] – [17]., Men en omfattende forståelse af den genetiske bidrag til telomer længde er endnu ikke dukket

Vi har for nylig gennemført en genom-dækkende forening undersøgelse (GWAS) af lungekræft blandt aldrig-ryger hunner i Asien og viste, at rs2736100 polymorfi i

TERT-CLPTM1L

locus på kromosom 5p15.33 var stærkt og signifikant associeret med risiko af adenokarcinom i lungen (P tendens = 10

-20) og replikeres af andre GWAS undersøgelser [18] – [20]. Der er endvidere yderligere beviser for, at denne locus er associeret med andre kræftformer, herunder cancer i blæren, prostata, cervix uteri, pancreas, bryst, ovarie, testikler, hjerne og hud [21] – [26]. Disse resultater tyder på, at

TERT-CLPTM1L

5p15.33 region kunne spille en rolle i udviklingen af ​​et bredt spektrum af cancerformer med forskellige ætiologier.

Vi har tidligere rapporteret, at længere telomerlængde var forbundet med risiko for lungekræft i Alpha-Tocopherol, beta-caroten cancer Prevention (ATBC) prospektive kohorte [4], som består af rygning mænd i Finland. For at følge op på denne rapport i en markant anderledes befolkning og til yderligere at udforske vores genetiske fund, vi gennemført en nested case-control studie af lungekræft tilfælde og kontrol i den kommende Shanghai Women Health Study kohorte (SWHS).

Materialer og metoder

Undersøgelse emner

de detaljerede metoder til SWHS er blevet beskrevet tidligere [27]. Kort fortalt blev 74,942 kinesiske kvinder i alderen 40 og 70 år og bosiddende i syv bysamfund i Shanghai rekrutteres til kohortestudie 1997-2000 med en deltagelse på 92,7%. Af undersøgelsens deltagere, 56.831 (75,8%), forudsat en blodprøve, som blev indsamlet under tilmeldingen i kohorten. Undersøgelsen blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser alle samarbejdende institutioner. Hver undersøgelse emne forudsat en samtykkeerklæring på tidspunktet for indskrivning og gennemført en standardiseret spørgeskema med oplysninger om demografiske karakteristika, sygehistorie, familie historie af kræft, rygning, beboelse historie, herunder brug af madolie og brændstof, og udsættelse for tobaksrøg fra deres mand eller fra kolleger på arbejdspladsen. Opfølgning for kræft forekomst og dødelighed blev gennemført ved besøg i hjemmet samt kobling til befolkningen-baserede Shanghai Cancer Registry. For kvinder, der blev diagnosticeret med kræft, blev medicinske diagrammer revideret og karakteristika tumoren blev registreret. For opfølgende undersøgelser, de opfølgende priser til tre forskellige interviews var 99,8% (2000-2002), 98,7% (2002-2004), og 96,7% (2004-2007) af kohorte medlemmer eller deres pårørende.

Vi brugte en nested case-control design til dette projekt. Sagerne består af hændelse lungekræft tilfælde. Kontroller blev udvalgt fra SWHS undersøgelsens deltagere, der var i live og fri for kræft på det tidspunkt af sagen diagnose, og blev individuelt tilpasset sager om fødselsdato (± 2 år) og dato for blodprøvetagning (± 3 måned). I alt blev 215 lungekræfttilfælde og 215 matchede kontroller inkluderet i den aktuelle undersøgelse.

telomer Assay

DNA blev ekstraheret fra buffy coats ved hjælp af phenol-chloroform metode. En monokrom multipleks kvantitativ PCR assay blev anvendt til bestemmelse af telomer målinger [28]. Alle assays blev udført på laboratoriet af Dr. Richard Cawthon anvendelse af Bio-Rad CFX384 Real-Time PCR Detection System. Maskerede udtages blev afbrudt i og på tværs assay partier til at vurdere analysen reproducerbarhed. Cases og deres matchede kontroller blev analyseret efter hinanden inden partier. Den samlede variationskoefficient (CV) udtages med 11% og intraclass korrelationskoefficient (ICC) var 87%. Kort fortalt reagenserne i 10 pi PCR var 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 50 mmol /L KCI, 3 mmol /l MgCI2, 0,2 mmol /l af hver dNTP, 1 mmol /l DTT, 1 mol /L betain, 0,75 × SYBR Green i, og AmpliTaq Gold DNA-polymerase, 0,625 U. De fire primere var (5 ’til 3′): telg (ved 100 nmol /l), ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT; Telc (900 nmol /l), TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA; albugcr2 (ved 700 nmol /l), CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCCATGCTTTTCAGCTCTGCAAGTC; og albdgcr2 (ved 500 nmol /l), GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGAGCATTAAGCTCTTTGGCAACGTAGGTTTC.

Fra 5 til 10 ng humant genomisk DNA blev tilsat pr reaktionsbrønd. Tre-fold seriefortyndinger af en reference genomisk DNA-prøve blev anvendt til at generere to standardkurver for hver PCR-plade (fem koncentrationer med en høj på 40 ng /reaktion og et lavpunkt på 0,49 ng /reaktion). Termisk cykling bestod af 1 cyklus af 15 minutter ved 95 ° C; 2 cykler af 2 s ved 98 ° C, 30 sekunder ved 49 ° C; 36 cykler af 2 s ved 98 ° C, 30 sekunder ved 59 ° C, 15 s ved 74 ° C med signal erhvervelse, 30 sekunder ved 84 ° C, og 15 sekunder ved 85 ° C med erhvervelse signal. Den 74 ° C læser forudsat cyklus tærskler (CTS) til telomerer; den 85 ° C læser forudsat CTS for enkelt kopi genet (albumin). Efter kørslen var tilendebragt, blev Bio-Rad CFX Manager-software anvendes til at bestemme T (telomer) og S (enkelt kopi-gen) værdier for hver eksperimentel prøve ved standardkurven metoden.

Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer. Forholdet mellem telomer PCR signaler til enkeltkopi-gen (i vores tilfælde, β-globin) PCR-signal (det vil sige T /S-forhold) er proportional med den gennemsnitlige telomer længde af de celler i en prøve. T /S-værdier er relative gennemsnitlige telomer længder, udtrykt i forhold til T /S værdi af referencestandard DNA-prøve, som per definition er 1,00. Standarden DNA-prøve, der anvendes til vore studier har et virkeligt gennemsnitlig telomer længde på ca. 3300 basepar [28]. For en given eksperimentel prøve, t-værdien er antallet af nanogram af henvisningen DNA, der matcher den eksperimentelle prøve til kopiantallet af telomer skabelon, og S-værdi er antallet af nanogram af henvisningen DNA, der matcher den eksperimentelle prøve til kopiantallet af enkelt kopi-gen skabelon. T /S, derfor er en relativ og dimensionsløs. Prøver med en T /S 1.0 har en gennemsnitlig telomerlængde større end den for standard-DNA; prøver med en T /S 1.0 har en gennemsnitlig telomerlængde kortere end standard DNA. Multiplex kvantitativ PCR eliminerer en væsentlig kilde til variation er til stede i monoplex kvantitativ PCR. I monoplex kvantitativ PCR, variation i mængden af ​​DNA pipetteret i T- og S-reaktionsbrønde resulterer i variation i T /S henviser multipleks kvantitativ PCR både T og S måles i hver reaktion godt, så pipettering variation mellem brønde ikke påvirke T /S.

Genotypning

Genotypebestemmelse blev udført under anvendelse af en optimeret TaqMan assay (ABI, Foster City, CA), på National Cancer Institute Cancer Genomics Research (CGR) som tidligere beskrevet [ ,,,0],19].

Statistisk analyse

Fordi T /s nøgletal stammer fra data for telomer længde ikke var normalt fordelt, dataene var log forvandlet. The Wilcoxon-test blev anvendt til at teste forskellen i telomerlængde blandt sager versus kontroller. De afskårne points for tertiles af telomer længde blev afledt fra fordelingen i kontrollerne. Odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (95% CIS) blev anslået ved hjælp af betingede logistiske regressionsmodeller. Telomerlængde blev modelleret som både en kontinuerlig og kategorisk variabel. Tests for tendenser blev beregnet ved hjælp af log transformeret telomer længde som en kontinuerlig variabel. Alder blev brugt i alle betingede modeller og redegøre for mulige resterende confounding, og rygning status blev inkluderet i alle modeller, der omfattede nogensinde-rygere. Variabler, som resulterede i en 10% eller større ændring i β-koefficient på telomer længde variabel den i basismodellen blev anset konfoundere og medtages i den endelige, multivariable modeller. Alle P-værdier er to-sidet. Vi gennemførte også en sekundær analyse ved hjælp fraktioneret polynomier for at undersøge en mulig ikke-lineær sammenhæng mellem telomer længde og risiko for lungekræft. Den optimale grad af udjævning blev valgt ved hjælp af et udvalg model procedure foreslået af Royston og Sauerbrei [29]. At afgøre, om foreningen kan være drevet delvis af forhøjet telomer længde blandt sager med udiagnosticeret lungekræft på tidspunktet for blodprøvetagning og til at afgøre, om foreningen varet mere end 5 år, vi stratificeret analyserne efter tid fra blod samling til sag diagnose (0- = 2, 2-5, og 5 år) eller referencedato, at kontrollen blev valgt. Vi analyserede indflydelse rs2736100 genotypen på log-transformerede telomer længde ved lineær regression, tildele ordenstal værdier 1, 2, og 3 for TT, GT, og GG genotyper, henholdsvis og justering for alder.

Resultater

de grundlæggende karakteristika for forsøgspersonerne er vist i tabel 1. Den alder af sager og kontroller var sammenlignelige og 93% af tilfældene og 95% af kontrollerne var aldrig-rygere. Telomer længde blev omvendt korreleret med alder i begge tilfælde (Spearman korrelation r = -0,39 P 0,0001) og kontroller (Spearman korrelation r = -0,41 P 0,0001). Ingen signifikant korrelation blev fundet mellem betyde telomerlængde og demografiske parametre er vist i tabel 1. Desuden er fordelingen af ​​telomer længde var statistisk signifikant længere blandt tilfælde end kontroller [P = 0,032].

risiko for lungekræft med tertiles af telomer længde er vist i tabel 2. Forsøgspersoner i midten og højeste tertiles havde højere risiko end gjorde dem i den laveste tertil (OR 1,4, 95% CI 0,8-2,5 for den midterste tertil 2.2, 1.2 -4,0 for den højeste tertil, P trend = 0,003, tabel 2, korrigeret for alder og stadigt ryge). Yderligere justering for passiv rygning og arvelig lungekræft havde en ubetydelig indvirkning på resultaterne (OR 1,4, 95% CI 0,8-2,4 og 2,2, 1,2 til 4,0 for den midterste og højeste tertiles henholdsvis P trend = 0,004). Fjernelse af stadigt ryger sager og kontroller gav lignende resultater (OR 1,7, 95% CI 0,9-2,9 for den midterste tertil 2.5, 1,3-4,7 for den højeste tertil, P trend = 0,003). Modeller herunder fraktioneret polynomier passede ikke de data, bedre end den simplere lineære model (likelihood ratio test p = 0,44). Sidstnævnte blev således tilbageholdt på grund af sparsommelighed. De observerede associationer var ens på tværs af forskellige opfølgende gange (Tabel 2) (dvs. tid fra datoen for tapning til dato diagnose), og en test af heterogenitet for foreninger på tværs af lag af follow-up tid ikke var signifikant (P = 0,15 ). Men på grund af det lille antal patienter i nogle strata, og de upræcise risikoestimater, replikation i studier med større prøver størrelser er nødvendig, for at vurdere potentielle heterogenitet. Desuden var der ingen tegn på, at sammenhængen mellem telomer længde og risiko for lungekræft varierede efter alder af bloddonation (test for heterogenitet: P = 0,96).

Vi har tidligere rapporteret, at rs2736100 på kromosom 5p15.33 blev stærkt forbundet med risiko for adenokarcinom i lungen blandt aldrig-rygere i denne kohorte. Vi studerede derfor forholdet mellem de genetiske data og telomer længde i denne population. Den gennemsnitlige telomerlængde i association med rs2736100 (

CLPTM1L-TERT

) er vist i tabel 3. rs2736100 G-allelen, som vi tidligere vist at være forbundet med risiko for lungekræft i denne kohorte [19], var signifikant associeret med længere telomer længde (P trend = 0,03) (tabel 3).

diskussion

i denne prospektive kohorte studie af det meste aldrig-ryger kvinder i Kina, fandt vi, at længere telomerlængde målt i perifere hvide blodlegemer var signifikant og positivt forbundet med øget risiko for lungekræft, og denne forening var uændret ved den tid fra blodprøvetagning til sag diagnose. Endvidere til rs2736100 G allelen, som vi tidligere har demonstreret være forbundet med risiko for lungekræft i denne kohorte [19], blev også signifikant associeret med længere telomer længde.

Vores konklusion om, at længere telomer længde er forbundet med risikoen for lungekræft er i overensstemmelse med vores tidligere rapport i den kommende ATBC cancer Prevention kohorte [4] i mandlige rygere. Begge de to undersøgelser er prospektive ved design og er de eneste kohortestudier af telomer længde og lungekræft offentliggjort til dato, til vores bedste overbevisning. I modsætning hertil har nogle case-kontrol studier rapporterede associationer mellem kortere telomer længde og risikoen for lungekræft [30] – [32], hvor telomer længde blev målt i hvide blodlegemer, der er indsamlet i forbindelse med eller efter diagnose af kræft. Det er interessant, at en rapport fra samme kohorte fundet en U-formet sammenhæng mellem telomer længde og kolorektal cancer risiko, hvilket tyder på, at forholdet mellem telomer længde målt i perifert blod leukocytter og risiko for forskellige typer af kræft kan udvise forskellige typer af dosis- respons relationer.

uoverensstemmelse mellem resultaterne i case-kontrol- og kohortestudier kan skyldes en række årsager. For det første kunne telomer længde i perifere hvide blodlegemer ændres ved tilstedeværelsen af ​​malign sygdom. Derfor kunne den observerede sammenhæng mellem forkortet telomer længde og sygdom i case-kontrol-studier være et resultat af omvendt årsagssammenhæng skævhed [16], [33]. For det andet kunne kemoterapi eller strålebehandling før blodprøvetagning forårsage DNA-skader og kan påvirke telomer længde [34], [35]. Flere af case-kontrol studier af kræft rapporterede ikke status for behandlingen af ​​sagerne. Pooley et al. sammenlignet resultater af telomer længde fra prøver af både retrospektive case-kontrol-undersøgelser og prospektive kohorteundersøgelser af bryst- og tyktarmskræft patienter og fandt, at kortere telomer længde var forbundet med øget risiko i case-kontrol-studier, men ikke i de prospektive kohortestudier [16 ], [33]. Blodprøver fra personer i vores undersøgelse blev indsamlet én til 10 år forud for diagnosen, og de virkninger, vi rapporterer varet længst opfølgning (dvs. mere end 5 til 10 år). For det tredje, nøjagtighed og præcision i målingen af ​​telomer længde er kritisk ved beregningen risiko for kræft [36] og variation i disse kan bidrage til inkonsekvente resultater. For eksempel, plade og placering af prøven på en plade havde en betydelig indflydelse på målinger telomer længde, selvom de er stærkt korreleret mellem plader inden for en given person [36]. Den monokrome multiplex kvantitativ PCR metode anvendes i denne rapport, som blev udviklet af Dr. Richard Cawthon [28], giver forbedret konsistens i forhold til andre metoder [8]. I vores undersøgelse, dr Cawthon laboratorium udført analyserne med en variationskoefficient (CV) på 11%. Også, forbedrede vi præcision i målingen af ​​telomer længde ved at sætte DNA fra cases og deres matchede kontroller ved siden af ​​hinanden på en given plade.

I princippet kan enten lange eller korte telomerer hæve kræftrisiko, afhængigt af cellens historie somatiske mutationer og cellens mikromiljø. Når cellecyklus checkpoint, cellulær ældning, og apoptosegenet netværk er intakte, korte telomere i delende celler forventes at være beskyttende mod kræft, da yderligere telomer forkortning forårsaget af celledeling snart udløser enten cellulær senescens eller apoptose, hvilket forhindrer cellen i at udvikle til en kræftcelle. Omvendt kan lange telomerer hæve kræftrisiko, fordi de ekstra runder af celledeling ydes af de lange telomerer giver cellen (og dens datterceller) mulighed for at akkumulere genetiske hits (somatiske mutationer), der blokerer veje til ældning og apoptose og fremme tumorigenese. Alternativt blandt celler, hvor veje til cellulær ældning og apoptose allerede er blokeret, dem med kortere telomerer er tilbøjelige til end-to-end-kromosom fusioner og deraf følgende kromosomal ustabilitet, en bidragyder til carcinogenese [37], [38]. En tidligere undersøgelse foreslået, at en balance mellem forlængelse af telomerase og telomer afkortning er vigtigt at producere en stabiliseret “optimale” længde, der er afgørende for celleproliferation, ældning, og kontrol [39].

Konstateringen af ​​en forening mellem

TERT

SNP rs2736100 og telomer længde er spændende. Rafnar et al. fandt, at to SNPs på

TERT

gen, rs401681C og rs2736098A alleler, blev begge signifikant associeret med kortere telomer længde i aldrig-ryger kvinder mellem 85 og 95 år gamle i kaukasiere. Men disse foreninger gik i den modsatte retning, når begrænset til yngre aldrig-ryger kvinder, selvom foreningerne ikke var signifikant [23]. Mirabello et al. fundet nogen sammenhæng mellem rs2736100 og telomer længde i kaukasiere [40]. Vi bemærker, at rs2736100 og lungekræft forening var stærkere blandt aldrig-ryger kvinder i østasiater end hos kaukasiere [19], [41]. Endvidere blev risikoen også højere i forhold til en GWAS for lungekræft på japansk og koreanerne, som var for det meste rygere og male [42]. Som sådan er det muligt, at forholdet mellem rs2736100 og telomer længde i sig selv kan variere fra etnicitet, køn og /eller rygning adfærd. Interessant nok i en foreløbig analyse, der var begrænset af mindre mængder, fandt vi tegn på, at effekten af ​​længere telomer længde og større risiko for lungekræft blev begrænset til de individer, der bærer den i fare (GT /GG) genotype rs2736100 (data ikke vist). Samtidig, vores undersøgelse er relativt lille, og resultaterne skal evalueres i yderligere populationer under anvendelse telomerlængde målt ved samme metode anvendes her. Der skal skabes mere funktionel arbejde for at identificere den variant, der direkte tegner sig for den bagvedliggende forening samt at studere den mekanisme, hvorved denne genetiske variant medierer telomerlængde.

Sammenfattende vores prospektiv kohorte undersøgelse viste, at længere telomer længde målt i perifere hvide blodlegemer DNA blev stærkt forbundet med risiko for lungekræft i kinesiske kvinder, og er den anden kohorte studie til at rapportere en sammenhæng mellem længere telomer længde og højere risiko for lungekræft. Men disse resultater er baseret på relativt beskedne størrelse prøver og kræver replikation i yderligere kohorter og befolkninger.