PLoS ONE: Advanced Computational Biologi Metoder Identificer Molekylær Skifter for malignitet i et EGF Mouse Model of leverkræft

Abstrakt

De molekylære årsager, hvorved den epidermale vækstfaktor receptor tyrosinkinase inducerer malign transformation er stort set ukendte. For bedre at forstå EGF’er ‘transformerende kapacitet hele genomet scanninger blev påført en transgen musemodel for leverkræft og underkastet avancerede metoder til beregningsanalyse at konstruere regulatoriske netværk de novo gen baseret på en kombination af sekvensanalyse og indblandede graf-topologisk algoritmer. Her identificerede vi transkriptionsfaktorer, processer, centrale knudepunkter og molekyler til at forbinde endnu ukendte interagerende parter på det niveau af protein-DNA interaktion. Mange af dem, kunne bekræftes af eltrafik band shift assay ved genkendelsessites af genspecifikke promotorer og ved western blotting af kerneproteiner. En roman cellulære regulerende kredsløb kunne derfor foreslås der forbinder cellecyklus regulerede gener med komponenter af EGF signalvejen. Promotor analyse af differentielt udtrykte gener foreslog størstedelen af ​​regulerede transskriptionsfaktorer at vise specificitet til enten den før-tumor eller tumoren tilstand. Efterfølgende eftersøgning af signaltransduktionsveje centrale knudepunkter opstrøms for de identificerede transkriptionsfaktorer og deres mål foreslog insulinlignende vækstfaktor pathway at gøre tumorcellerne uafhængige af EGF-receptor-aktivitet. Især ekspression af IGF2 foruden mange komponenter i denne vej var stærkt opreguleret i tumorer. Sammen foreslår vi en switch i autokrin signalering at fremme tumorvækst, der oprindeligt blev udløst af EGF og demonstrere viden gevinst formular promotor analyse kombineret med opstrøms nøgle node identifikation

Henvisning:. Stegmaier P, Voss N, Meier T , Kel A, Wingender E, Borlak J (2011) Advanced Computational Biologi Metoder Identificer Molekylær Skifter for malignitet i et EGF Mouse Model for leverkræft. PLoS ONE 6 (3): e17738. doi: 10,1371 /journal.pone.0017738

Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA

Modtaget: Oktober 6, 2010; Accepteret: 9. februar 2011; Udgivet: 28 Mar 2011

Copyright: © 2011 Stegmaier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dele af det arbejde blev finansieret af EU-tilskud “Eurodia” (LSHM-CT-2006 til 518.153) og Net2Drug (LSHB-CT-2007 til 037.590) og ETB give GlobCell og BMBF projekt TcellTalk samt program for intenational samarbejde af den russiske Ministeriet Sciences og Uddannelse samt Ministeriet for Videnskab og Kultur, Niedersachsen, Tyskland; Grant nummer: 25A.5-76251-99-3 /00 til Juergen Borlak. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. PS, NV, AK, EW er medarbejdere i BIOBASE GmbH, Wolfenbuettel, Tyskland. AK er også en ansat i Institut for Systembiologi Ltd., Novosibirsk, Rusland

Konkurrerende interesser:. PS, NV, AK, EW og JB er medarbejdere i BIOBASE GmbH, Wolfenbuettel, Tyskland. AK er også en ansat i Institut for Systembiologi Ltd., Novosibirsk, Rusland. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i din guide til forfattere.

Introduktion

epidermal vækstfaktor er en vigtig mitogen for hepatocytter for dens evne til at modulere protoonkogen samt lever specifik genekspression. For bedre at forstå EGF rolle ved malign transformation en transgen musemodel blev udviklet hvor EGF blev målrettet mod leveren. Især transgene mus udviklede leverkræft omkring 7-8 måneder og en tumor fase-afhængig netværk af EGF-regulerede gener blev identificeret, som tidligere rapporteret [1]. Opmuntret af disse resultater gener knyttet til tumorigenes og sygdomsprogression kunne foreslås. Her har vi ønsket at analysere genekspression profiler af præ-tumorform og stærkt differentierede hepatocellulære karcinomer med en roman beregningsmetode der gjorde det muligt at identificere regulatorer af EGF signaleringskaskade forbundet med malign transformation. En ny metode er udviklet på baggrund promotorsekvens analyse af differentielt udtrykte gener. Specifikt er transkription af et gen bestemmes i vid del ved aktiviteten af ​​transkriptionsfaktorer, som igen genkender specifikke korte DNA-segmenter, dvs. transkriptionsfaktorbindingssites (TFBSs), som ofte ligger i promotorregionen opstrøms transkriptionsstartsitet (TSS). Genekspressionsprofiler kan således anvendes til at identificere TF’er, der potentielt påvirker ekspressionen af ​​gener under visse cellulære betingelser ved anvendelse af forskellige genetiske algoritmer og matricer, der genkender TFBSs. Kompleksiteten af ​​genekspression data kan derefter reduceres ved fastlæggelse af fælles TF’er af co-regulerede gener. Den her beskrevne og nyudviklede metode fokuserer på identifikation af transskriptionsfaktorbindingssteder med co-belægning i initiativtagerne til differentielt udtrykte gener i en statistisk signifikant måde. Dette gjorde det muligt hypoteser generation og en identifikation af transkriptionsfaktorer, der handler på en sådan promotor sæt med det ultimative mål at identificere “molekylære triggere” i gen regulatoriske netværk tvinger hepatocytter i malign transformation. Baseret på en sådan analyse transkriptionsfaktorer blev identificeret som mulige effektorer af malign transformation, som kan fungere i overgangen fra EGF overekspression til den maligne tilstand. For at eksperimentelt validere de beregningsmæssige forudsigelser Western blotting eksperimenter af kerneproteiner og EMSA band ændring-assays blev udført for at bestemme DNA bindingsaktiviteten af ​​adskillige transkriptionsfaktorer. Rekonstruktion af signaleringskaskader opstrøms for disse TF’er tilladt os at foreslå de nedstrøms mål for EGF-signalering i disse to typer af cellulære tilstande, dvs. transgenicitet og leverkræft. Som følge heraf foreslår vi regulatoriske netværk der hjælper til bedre at forstå EGF-induceret maligniteter. I et forsøg på at søge efter nøglemolekyler i signaleringsnetværket opstrøms for identificerede transkriptionsfaktorer insulin-lignende vækstfaktor pathway blev identificeret, faktisk kan repræsentere en molekylær omskifter fra EGF-receptortyrosinkinase rute til tumoren tilstand hvorved malignt transformerede celler uafhængig af EGF-receptor-aktivitet. blev opnået yderligere beviser for denne hypotese, når genekspression af IGF2 og dens downstream partnere blev undersøgt, og fast besluttet på at være meget væsentligt induceret i tumorceller som var mange komponenter i denne vej.

Samlet sigter denne undersøgelse for et bedre forståelse af den transformerende EGF kapacitet og kombinerer forskellige linjer af beviser for en mulig mekanisme af sygdom

Resultater

Differential udtryk i transgene (præ-tumor) og tumorvæv:. sub klassificering af kendte leverkræft biomarkører ved genekspression profiler

Forklar 2.3 kortlagt Affymetrix probe sæt til 10,262 mus gener. Differentiel ekspression analyse med Ebarrays detekteret 303 og 355 op regulerede gener samt 95 og 141 ned regulerede gener i transgene celler og tumorceller hhv. Tabel 1 opsummerer information om opnåede gen lister og Figur 1 viser fordelingen af ​​kendte transskriptionsfaktorbindende websted placeringer i henhold til TRANSFAC database release 12.1 (se Materialer og Metoder, beregning af P-værdier for MATCH scoringer, for yderligere detaljer). Tabel S1 giver alle MGI gen symboler, TransPath molekyle navne, hvis den er tilgængelig, og højeste eller laveste fold ændringer målt for probe sæt op reguleret eller ned regulerede gener, hhv. En mindre manuel ændring blev introduceret til gen sæt 5 (tabel 1), hvor en sonde sæt kortlagt til fire nært beslægtede paraloger Bcl2a1a-d. Vi brugte MAFFT alignment software [2] og jalview [3] til at inspicere de multiple alignments af Bcl2a1 initiativtagere (Figur S1). Da promoter sekvenser af disse gener er meget ens, analyser en bias i promotor udført i dette arbejde kunne forventes, og vi fjernet derfor tre Bcl2a gener (b-D) fra gen sæt 5.

Den røde linje angiver toppen af ​​fordelingen på -115bp forhold til TSS.

Transgene og tumor stater delte 144 op regulerede gener og 25 ned regulerede gener (sæt 3 og 8, tabel 1). I efterfølgende analyser vi også betragtes som en potentielt større overlapning, når en probe sæt var statistisk signifikant i en kontrast og opnået en høj gange ændring i den anden (satte 2, 4, 7 og 9). Således for 77 af de 303 op regulerede gener i transgene celler (sæt 2), en probe sæt detekteret ved statistisk analyse havde også en fold ændring 2 i tumorceller, og disse 77 gener blev tilsat til de 355 gener op reguleret i tumor at opnå en udvidede sæt op regulerede gener i tumorceller. Tilsvarende 103 af de 355 gener op regulerede i tumor blev vedlagt den transgene indstillet til at udlede et udvidet sæt op regulerede gener i transgene celler (sæt 4). På samme måde blev gen-sæt nedreguleringen respons forstørres med en fold ændring under 0,5. Resterende undersæt (sæt 1, 5, 6, og 10) blev anset specifikt reguleret i de respektive progression tilstand.

Ifølge sygdommen modul af BIOBASE Knowledge Library (BKL) [4], EGF-induceret carcinogenese forårsagede differentieret udtryk af 39 kendte biomarkør gener associeret med lever karcinom /neoplasmer (tabel S1). Som vist i figur 2, disse biomarkører featured forskellige mønstre af ekspression antyder en yderligere sub klassifikation med hensyn til deres respons i pre-tumor og tumor tilstand. Tre gener, nemlig Myc, Glul, Havre, var forbigående op- eller nedreguleret under sygdom debut og kan således tjene som tidlige markører for leverkræft, der diskriminerer tumoren tilstand (figur 2A). Statistisk analyse også foreslået Dnmt3a, Itga6, og Shc1 imidlertid høje fold ændringer blev målt for disse gener i tumorceller som beskrevet ovenfor. Angivelse af 14 biomarkør gener ændret påviseligt i begge progression stater (Figur 2B), der angiver et ekstra sæt formodede tidlig leverkræft markører. Endelig CCND1, Gpc3, Mvk, Pparg, Rbl2, og Robo1 udstillet en tumor-specifik respons (Figur 2C), hvor der blev observeret negative udtryk ændringer for Pparg, som optrådte nedreguleret i transgene celler (fold forandring 0,4) og signifikant opreguleret i tumorer. Taget sammen antyder disse resultater en raffineret fortolkning af kendte biomarkører for leverkræft /neoplasmer. Blandt de respektive gener, vi kunne identificere flere informative signaturer, som angiver specifikke pre-tumor og tumormarkører og vise, at udtryk ændringer i nogle kendte biomarkører kan faktisk tjene som tidlige indikatorer for sygdomsdebut.

Graferne viser log-Fold ændringer af kendte biomarkører, der differentielt blev udtrykt i transgene celler (A), begge stater (B), eller tumorer (C). Fold ændringer af nogle gener er angivet forskellen udtryk i begge stater, selv om statistisk analyse tildelt dem til en stat kun (stiplede linjer). Flere kendte biomarkører udstillet progression state-specifikke reaktioner, som kan subserve afledning af præ-tumor og tumor signaturer (fede linjer).

Regulering af cellecyklus og lipid metabolisme ændringer gradvist i EGF-induceret hepatocarcinogenese

med definerede sæt differentielt udtrykte (DE) gener ved hånden, vi satte os for at identificere funktionelle ændringer, der ledsager EGF-induceret hepatocarcinogenese. Til dette formål beregnede vi berigelse P-værdier for alle GO Biologisk Proceskategorier forbundet med mindst et gen i transgene eller tumor gensæt og anvendte dem som et mål for relative betydning af en bestemt biologisk funktion for et givet gen sæt. For at begrænse virkningen af ​​falske negative resultater under differentiel ekspression analyse blev berigelse P-værdier beregnet i længere gensæt sammensat af sæt 1-4 (op reguleret i transgene celler), 2-5 (op reguleret i tumorceller), 6- 9 (nedreguleret i transgene celler), og 7-10 (nedreguleret i tumorceller) (tabel 1). Resultater af P-værdi sammenligning er vist i figur 3. I det følgende vil vi fokusere på de 15 GO grupper med største forskelle mellem log-P-værdier som opnået i analyser af enten opreguleret eller nedreguleret gensæt. Plots af transgene versus tumor P-værdier (Figur 3, A og C) viser, at proceduren beordret kategorier efter deres afstand til diagonal (rød linje). Punkter på diagonalen angiver ingen forskel mellem P-værdier. I de udvalgte top 15 biologiske processer, P-værdier varieres ved ca. 2-6 størrelsesordener mellem transgene og tumor stater. Ifølge denne analyse, opregulering af gener under tumorigenes ændret stærkest cellecyklus funktioner (figur 3B). Bemærk, at legender i figur 3B og 3D bevare bestilling ved log-P-værdi forskel. Alle de fem bedste GO kategorier, “celledeling”, “cellecyklus”, “M-fasen”, “mitose”, og “M fase af mitotisk cellecyklus” hentyde til ændringer i cellecyklus og blev mere markant beriget i tumoren gen sæt, mens opregulering i transgene celler blev stærkere rettet mod mekanismer celle motilitet samt cellulære komponent organisation og biogenese. Udover ændringer i cellecyklus, funktionel sammenligning påpeger ændringer i reguleringen af ​​gener, der deltager i udviklingsprocesser, cellevækst og anatomiske struktur udvikling (figur 3B), der indebærer potentielle dedifferentiering begivenheder. Analyse af nedregulering reaktioner viser, at regulering af lipidmetabolisme var stærkt modificeret under tumorigenese. De næste to højest klassificeret funktioner vedrører protein deubiquitination og galdesyresyntese (figur 3D). Tabel S2 giver yderligere detaljer om gener matcher nogle udvalgte biologiske proces og deres P-værdier i begge progression tilstand. Cellecyklus kategorier stærkt sorteret efter sammenligning af opreguleres gensæt blev signifikant påvirket i både transgene og tumorceller, hvilket viser, at disse funktioner gennemgår progressive forandringer. Især blev gener associeret med anatomiske struktur udvikling stærkt beriget i transgene og tumor sæt (gul prik og linie, figur 3, A og B). Især forskelle udtryk ikke blot i opregulering af yderligere gener i tumorcellen; f.eks. cellecyklus gruppe af transgene celler omfatter Foxc1, Gadd45a, Hic1, hus1, Myc, og Uhmk1, som ikke blev detekteret i tumor (trods forlængelse af genet liste). blev observeret De mest dramatiske ændringer i reguleringen af ​​lipid metaboliske gener. Transgene og tumor gensæt involveret i denne funktion afveg med 21 gener og berigelse P-værdier forøget med omkring seks størrelsesordener. Endvidere protein deubiquitination og galdesyre metabolisme udviser en switch-lignende regulering, hvor differentiel ekspression først blev detekteret i tumoren

(A og B – analyse af opreguleres gener, C og D – analyse af nedreguleret gener). . A og C) Hver prik repræsenterer en GO kategori i løbet af to P-værdier. B og D) Top 15 GO vilkår med størst log-P-værdi forskel mellem transgene og tumor. Dots svarende til kategorierne i B og D er fremhævet i A og C.

Cell-cycle dysregulering er tidligere identificeret som en kausal mekanisme af genotoksisk carcinogenicitet [5]. Det er også kendt, at leverkræft indebærer lipid metaboliske forstyrrelser, herunder cholesterol-metabolisme [6]. Resultaterne præsenteres her viser, at sygdomsdebut blev ledsaget af progressive forandringer i respektive funktioner. Den ubiquitinproteasomvejen er et relativt nyt mål for cancerterapi [7]. Ifølge vores genekspression data, hepatocarcinogenese forårsagede nedregulering af tre deubiquitination gener, Dub1, Dub2, og Dub2a, specifikt i tumoren tilstand (tabel S1). For nylig blev en afubiquitinerende enzym, BAP1, med en rolle i cellecyklusregulering beskrevet som tumorsuppressor [8], støtter relevansen af ​​at finde den tilsvarende GO kategori blandt de 15 ændrede funktioner trods en beskeden berigelse P-værdi i tumoren genet sæt (P 0,0001). Nedregulering af deubiquitination gener overholder tidligere resultater, som Ventii og medforfattere også observeret mangel på afubiquitinerende aktivitet i cancer-associerede mutanter. Sammenfattende blev der observeret progressive ændringer i reguleringen af ​​cellecyklus, udviklingsmæssige og lipid metaboliske funktioner chaperoned EGF-induceret hepatocarcinogenese, mens potentiel switch-lignende regulering for små grupper af gener, der er defineret ved protein deubiquitination og galdesyrebiosyntese, en komponent af hepatisk kolesterol metabolisme . Disse biologiske funktioner kan harbor nye biomarkører for sygdomsdebut og tumorigenese.

Klynger af opreguleret signaltransduktion molekyler i transgene og tumorceller integrerer vækstfaktor, cellecyklus, kemokin og cytokin signaler

Netværk interagere proteiner udøver en stor del af cellulære funktioner. Analyse af differentielt udtrykte molekyler i forbindelse med kendte signalveje muliggør identifikation af molekylære netværk er omfattet af observerede ekspressionssystemer ændringer. Vi anvendte netværk klyngeanalyse til at foreslå funktionel kontekst til signalering komponenter kodet af differentielt udtrykte gener af transgene og tumorceller sammen med understøttende netværkstopologier konstrueret af eksperimentelt bevist signalering reaktioner. Netværk blev konstrueret i længere opregulering og nedregulering gensæt beskrevet ovenfor. Som følge heraf opnåede vi en klynge hver for opreguleres gener af transgene celler og for opreguleres gener af tumorceller. En lille netværk af nedreguleret gener blev fundet i tumorceller, i hvilke EGF og beta-c interagere med Shc og et kompleks omfattende EGF, ErbB1, Shc-1, Grb2, og Sos (ikke vist). De to net af opreguleres gener blev udgjort af 85 og 88 komponenter, herunder 39 og 41 molekyler opreguleret i transgene eller tumorceller hhv. Diagrammer over transgene og tumor netværk klynger er vist i figur 4 og 5. Yderligere information om differentielt udtrykte molekyler og kodende gener er angivet i tabel S3

rød knuder: kun i transgen netværk;. Lys rød: fold ændring var mindst to højere end i tumor; Lys grøn: fold ændring var i hvert fald – 2 lavere end i tumor, Blå: opreguleret molekyle med lignende fold ændring i transgene og tumor. Venligst se tekst for yderligere beskrivelse

Red knuder: kun i tumor nettet. Lys rød: fold ændring var mindst 2 point højere end i transgene celler; Lys grøn: fold ændring var mindst 2 point lavere end i transgene celler, Blå: opreguleret molekyle med lignende fold ændring i transgene og tumor. Venligst se tekst for yderligere beskrivelse.

Begge netværk har et mix af funktionelle kategorier som vækstfaktor signalering, f.eks gennem ErbB receptorer, INSR eller FGFR-1, cellecyklus-regulerende kaskader, f.eks involverer cyclin B1, Cdk1, Aurora-A, eller p53, samt cytokin og chemokin signalering gennem IL-1 RI og CXCR4. Den kombinerede liste over opreguleres komponenter består af 48 proteiner, hvoraf 7 er specifikke for det transgene netværk og 9 kun en del af tumor netværk (tabel S3). For 19 af de 32 delte molekyler en kvantitativ ændring i ekspression under tumorigenese kan hypotese som angivet ved node farve på netværksdiagrammerne (grøn og lyserøde knudepunkter, figur 4 og 5). Især dette gælder for en kompakt modul af cellecyklus regulatorer, nemlig survivin, cyclin B1, Cdk1, PLK1, og Bub1, hvis ekspression øges ca. 2 gange i tumor versus transgene celler ifølge målte fold ændringer. Endvidere netværk analyse tyder en anden, tumorspecifik modul af cellecyklus regulatorer dannet af p107, p130, p15INK4b, og Wee1 (figur 5). Disse resultater understøtter endvidere den hypotese, at EGF-induceret carcinogenese drives delvist af progressive ændringer af cellecyklus regulering, der som de netværk viser, kan også åbenbart gennem kvantitative ændringer udtryksformer.

De præsenterede netværk klynger afslører potentielle virkninger på aktiviteten af ​​opregulerede TF’er ligesom c-Fos, c-jun, c-myc, PPAR-y1, Smad3, Egr-1, og c-Ets-2. C-myc og PPAR-gamma1 var begrænset til det transgene, og tumoren netværket hhv. Hver faktor integrerer signaler fra flere opstrøms molekyler med ændret ekspression. Interessant, kendt cancer-associerede TF’er som c-Fos, c-Jun, Smad3, og c-Ets-2 udstillet temmelig konstante niveauer af opregulering hele tumorigenese. Desuden er en relativt stort antal både aktiverende og inhibitoriske reaktioner target p53, som var ugyldige af påviselig forskellig ekspression i enten progression tilstand.

En kaskade involverer VCAM-1, alpha4-integrin, og IAP blev fundet specifikt i det transgene netværk (figur 4). Alpha4-integrin viser progression state regulering med opregulering i transgene celler og nedregulering i tumorceller (Tabel S3). Integriner er forbundet med vævsinvasion af leverkarcinom celler [9], og spiller en rolle i apoptose [10]. BMP7, en tumor netspecifikke molekyle, kan virke som transkriptionsfaktor og kan som sådan bidrage til opregulering af c-Myb [11] samt af c-Fos, sidstnævnte eventuelt med andre midler [12]. BMP7 er tidligere rapporteret at deltage i reguleringen af ​​apoptose i vaskulære glatte muskelceller [13]. På grund af deres forbindelse med apoptose og deres progression state-specifikke udtryk profiler, alpha4-integrin og BMP7 kan repræsentere bestanddele af switch mekanismer carcinogenese.

Netværket klynger afslører regulatoriske kredsløbssystemer, der kan udforskes for nye terapeutiske interventioner. Faktisk er PPAR-gamma-antagonister, der undersøges som behandling af forskellige maligniteter, herunder levercancere. Regulatory kaskader målrettet PPAR-gamma gennem opstrøms kinaser og fosfataser, såsom M3 /6, JNK1, MEKK2, MKP3, MEK2 eller ERK2, hvoraf M3 /6, MEKK2, og MFP-3 blev fremkaldt under carcinogenese, foreslå yderligere muligheder for lægemiddeludvikling. Endvidere blev liganden af ​​insulin og insulin-lignende receptorer, IGF-2, kraftigt opreguleret i tumorceller, hvorimod der var moderate ændringer i transgene celler (ikke påvises ved differentiel ekspression analyse). Den potentielle rolle af denne ligand i autokrin regulering af cancercellevækst er tidligere diskuteret i litteraturen [14] og analyseres yderligere i vores undersøgelse (se nedenfor).

Promoter analyse og identifikation af regulatoriske sekvenser

Transskription faktorer er vigtige bidragydere til koordinerede genekspression ændringer som dem, der observeres i undersøgelsen data. Det er en standard metode til at teste for overrepræsentation af TF bindingssteder i initiativtagere til coregulated gener versus en baggrund af initiativtagere. Vi kvantificeret bindingssted berigelse ved 0,01-fraktil af forholdet mellem to Beta fordelinger modellering odds ratio af forudsagte bindingssteder og initiativtagere og forgrund og baggrund gen sæt. Den 0,01-fraktil værdi, i det følgende betegnet

q-værdi

, anslår værdien af ​​odds ratio, således at den sande forholdet er højere med 99% sandsynlighed (se metoder). For hver af de 578 TRANSFAC PWM’er, algoritmen i gang med en lav PWM score tærskel (P-værdi 0,05) og iterativt justeret cut-off (ved at inkrementere) for at maksimere q-værdi. Salg

bindingssteder forudsagt af MATCH i promotorområder dækker -1000 til +100 i forhold til TSS. Vi bygget særskilte baggrund sæt til transgene og tumorceller ved tilfældigt prøveudtagning 1000 gener med fold ændringer mellem 0,9 og 1,1 i de respektive progression tilstand. Følgende forgrunden sæt blev analyseret: opregulering (Tabel 1: indstiller 1-3 og 3-5), specifik opregulering (Tabel 1: indstiller 1 og 5), nedregulering (Tabel 1: indstiller 6-8 og 8-10), og specifik nedregulering (tabel 1: sæt 6 og 10). Desuden blev bindingssted berigelse testet i promotorer af opreguleres gener associeret med cellecyklus og nedreguleret gener associeret med lipidmetabolisme.

I figur 6 q-værdier TRANSFAC motiver optimeret til transgene forgrunden sæt er afbildet mod q-værdier for tilsvarende tumor forgrunden sæt. Desuden har vi udvundet toppen PWM’er bestilt af q-værdierne i tabel S4. Identifikatorer for TRANSFAC matricer, hvis prikker er fremhævet i figur 6 er fed-skrevet i tabel S4. Udvinding af matricer fulgte reglen at vise top 15 PWM’er, eller alle med mindst 2 gange berigelse i enten transgene eller tumor sæt, eller alle PWM’er fremhævet i figur 6, alt efter hvilken resulterede i det største antal motiver. Vi ekstraheret også transkriptionsfaktor gener (Tabel S5) ifølge identificerede PWM’er (understreget i tabel S4) og udføres opstrøms netværksanalyse med transskriptionsfaktor sæt (se nedenfor).

Hver prik repræsenterer en TRANSFAC bindingssted (= sekvens motiv) placeret ved fold berigelse i transgen (x-aksen) og tumor (y-aksen) forgrund sæt. Fraktil værdier større end 1 indikerer bindingssted berigelse. Flere motiver er fremhævet som blev flyttet væk fra diagonalen tyder forskellig betydning af tilsvarende TF’er for regulering i enten transgene eller tumor stater. Venligst se tekst for yderligere beskrivelse. A) Analyse af bindingssted berigelse i alle ned regulerede gener B) Analyse af bindingssted berigelser i specifikt ned regulerede gener af enten transgene eller tumor stater C) Analyse af bindingssted berigelse i alle op regulerede gener D) Analyse af bindingssted berigelser i specifikt op regulerede gener af enten transgene eller tumor stater E) Analyse af bindingssted berigelser i op regulerede cellecyklus gener F) Analyse af bindingssted berigelser i nedreguleres lipidmetabolismen gener.

Som et resultat, promotor analyse viste TF motiver specifikt eller mere velforståeligt overrepræsenterede i transgene eller tumor forgrunden sæt samt motiver med fælles berigelse i begge progression stater. I 5 af 6 forgrunden sæt blev POU motiver mere stærkt forbundet med den transgene tilstand end med tumoren tilstand (Figur 6A-E). Denne forskel var mest udtalt i analyser af nedreguleret (figur 6A) og specifikke nedreguleret gensæt (figur 6B), hvor prikker repræsenterer POU matricer (blå diamanter) er placeret langt væk fra massen af ​​point. Især lokaliteter af nogle POU motiver var også mere end 2-fold beriget med promotorer af nedreguleret gener i tumoren. Oct1 matricer var de højest rangerede motiver i nedreguleres og specifikke nedreguleret gener i tumoren (tabel S4). Men initiativtagere til opreguleret gener påviseligt beriget med POU steder i transgene tilstand kun (Figur 6C-E). Disse resultater tyder på, at POU faktorer bidrog til switchen fra transgene til tumor tilstand. Endvidere kan deres aktivitet udgør en væsentlig årsag til observerede nedregulering begivenheder. Blandt de POU transkriptionsfaktorer repræsenteret ved matricer identificeret i analyserne, udtrykket profil Pou5f1 (Oct4) lignede godt den observerede progression-state specifik berigelse af dets bindingssteder (tabel S5). Den Pou5f1 genet udviste en høj fold ændring (2,75) i den transgene tilstand, som var faldet i tumoren tilstand (fold ændring 1,70). Faktisk er Pou5f1 genet specifikt udtrykkes i embryoniske stamceller og i tumorceller, men ikke i celler af differentierede væv [15]. Transkriptionsfaktorer med en Forkhead domæne viste også samarbejde med transgene tilstand. Dette signal blev bedst observeret i opregulering og cellecyklus gen sæt (Figur 6Cand E), endnu subtile berigelse i transgene initiativtagere kunne også påvises i specifik nedregulering (figur 6B) og specifik opregulering, hvor FREAC2 motiv rangeret blandt de top 15 PWM’er ( tabel S4). I opregulering sæt, viste Foxd3 bindingssteder det stærkeste signal efter Oct1 sites (tabel S4). Dette ville støtte en potentiel rolle Oct4, som corepression gennem overlappende bindingssteder Oct4 og Foxd3 blev tidligere rapporteret [16]. Ifølge udtryk målinger blev Foxd3 potentielt nedreguleret i både progression stater (tabel S5), selv om målte udtryk forskelle ikke var statistisk signifikante. I stedet Foxc1 udtryk paralleller stærkere berigelse af Forkhead bindingssteder i transgene promoter sæt, da den er specifikt opreguleret i de tidlige progression tilstand (tabel S1 og S5).

Initiativtagere af opreguleret gener i tumor var forbundet med binding steder af cellecyklus regulatorer såsom AP1-lignende faktorer, STAT, og E2F (Figur 6C-E), hvoraf Atf3, jun, og E2f3 var signifikant opreguleret i både transgene og tumorceller (tabel S1 og S5). Dette fund understøtter den stærkere regulering af cellecyklus processer i tumor opdages af sammenlignende GO analyse. Analysen af ​​cellecyklus genpromotorer tyder E2F faktorer som den mest vigtige regulatorer i begge stater, mens der blev observeret en tendens til højere Q-værdier i tumoren sæt til flere E2F motiver (figur 6E). Navnlig blev Myc-associerede zinkfinger protein påvist i den transgene celle cyklus gensæt (tabel S4 og S5), der indirekte antyder, at Myc påvirket cellecyklusregulering i transgene celler, men ikke eller i mindre grad i tumorceller. Dette vil blive understøttet af ekspressionsprofilen af ​​Myc med betydelig opregulering i tidligt stadium og subtil eller fraværende opregulering i tumor.

Endelig lipidmetabolismen gensæt viser stærk association af HNF6 (Onecut1) og PPAR-gamma med tumoren tilstand (figur 6F). Af disse blev HNF6 signifikant nedreguleret i tumor, mens PPAR-gamma udstillet en progression angiv specifik profil med nedregulering i den transgene tilstand og betydelig opregulering i tumor.

Mens mange af de førnævnte transkriptionsfaktorer er velkendte proto -oncogenes, såsom jun, Myc eller E2f3, og forbindelsen mellem HNF6, PPARy og lipidmetabolisme er forståelig, andre faktorer afsløret af vores analyse er nye i forhold til deres rolle i leveren carcinogenese. Bindende steder i Kaiso (Zbtb33) blev stærkest overrepræsenteret i nedreguleret tumor gener. Kaiso viste sig at lukke munden på tumorsuppressorgener i kolorektal cancer [17], og dens rolle i kræft er tidligere revideret [18]. Desuden blev motiver af HMG box faktorer forbundet med transgene gen sæt i nedregulering (figur 6A, LEF1 PWM’er) og specifik opregulering (figur 6D, Sry).