abstrakt
BPR0L075 [6-methoxy-3- (3 ‘, 4′, 5’-trimethoxy-benzoyl) -1 H-indol] er en hidtil ukendt anti-mikrotubulus lægemiddel med anti-tumor og antiangiogene aktiviteter
i vitro
in vivo
. Securin er påkrævet for genomstabilitet, og udtrykkes rigeligt i de fleste cancerceller, fremme celleproliferation og tumorigenese. I denne undersøgelse fandt vi, at BPR0L075 effektivt induceret celledød af HCT116 humane colorektale cancerceller, der har højere ekspressionsniveauer af Securin. Cytotoksiciteten af BPR0L075 blev svækket i isogene Securin-null HCT116 celler. BPR0L075 inducerede DNA-skader reaktion, G
2 /M anholdelse, og aktivering af spindlen samling checkpoint i HCT116 celler. Interessant BPR0L075 induceret phosphorylering af Securin. BPR0L075 tilbagetrækning resulterede i nedbrydning af Securin, mitotisk exit, og mitotisk katastrofe, som blev svækket i Securin-nul celler. Hæmning af cdc2 faldt Securin fosforylering, G
2 /M anholdelse og celledød induceret af BPR0L075. Desuden BPR0L075 forårsagede celledød via en caspase-uafhængig mekanisme og aktivering af JNK og p38 MAPK pathways. Disse resultater, der er fastsat beviser for første gang, at BPR0L075 behandling er gavnlig til behandling af humane kolorektale tumorer med højere niveauer af Securin. Foreslår vi derfor, at ekspressionsniveauerne af Securin kan være en prædiktiv faktor til anvendelse i anti-cancer behandling med BPR0L075 i humane cancerceller
Henvisning:. Tseng HH, Chuah QY, Yang PM, Chen CT, Chao JC, Lin MD, et al. (2012) Securin Forbedrer anticancervirkninger af 6-methoxy-3- (3 ‘, 4′, 5’-trimethoxy-benzoyl) -1 H-indol (BPR0L075) i Human Colorectal cancerceller. PLoS ONE 7 (4): e36006. doi: 10,1371 /journal.pone.0036006
Redaktør: Regine Schneider-Stock, Patologisk Institut, Tyskland
Modtaget: December 23, 2011; Accepteret: 29 2012; Udgivet: 26 april, 2012 |
Copyright: © 2012 Tseng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Grant numre : National Science Rådet, Taiwan (NSC 99-2314-B-320-004-MY3). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Mikrotubuli er en bestanddel af cytoskelettet og er sammensat af α-tubulin og p-tubulin heterdimers [1]. Mikrotubuli er især vigtigt i mitose og celledeling, og det har betydet, at mikrotubuli er blevet et mål for lægemidler mod cancer [2], [3]. Ifølge forskellige tubulin-bindingssteder, er anti-mikrotubuli lægemidler inddeles i tre klasser: paclitaxel webstedet, vinca alkaloid webstedet, og colchicin domæne. Anti-mikrotubuli lægemidler kunne inducere enten mikrotubulus stabilisering, såsom set med paclitaxel eller destabilisering, som set med vinblastin og colchicin [4]. BPR0L075 [6-methoxy-3- (3 ‘, 4′, 5’-trimethoxy-benzoyl) -1 H- indol], en combretastatin A-4 (CA-4) analog, som er afledt af det sydafrikanske træ
Combretum caffrum
, er et nyt syntetisk anti-mikrotubuli lægemiddel, der hæmmer tubulinpolymerisation ved binding til colchicin domænet [5], og blev godkendt af de amerikanske FDA for fase 1 kliniske forsøg i 2010. de seneste undersøgelser har rapporteret, at BPR0L075 udøver ikke kun anti-mitotiske og anti-tumor aktiviteter, men også anti-angiogenetisk aktivitet
in vitro
in vivo
[6], [7].
Mitotisk katastrofe er en form for celledød, som resulterer fra unormal mitose [8]. Den kan udløses af medikamenter, der påvirker mikrotubulus stabilitet, forskellige anticancerlægemidler, ioniserende stråling og mitotiske svigt fremkaldt af cellecyklus checkpoint defekt [8], [9]. Endvidere kan mitotisk katastrofe være caspase-afhængig eller -uafhængige [10]. Biokemiske træk ved mitotisk katastrofe er forlænget spindel samling kontrolpunkt (SAC) signalering, afvigende niveauer af cyclin B1, og signalering via Cdk1 [11]. Celledød forårsaget af mitotisk katastrofe kan opstå under eller efter mitose [12]. Anti-mikrotubuli lægemidler, såsom docetaxel og Combretastatin-A4 prodrug (CA4P), fremkalde kræft celledød via mitotisk katastrofe [13], [14]. Disse resultater tyder på en potentiel rolle BPR0L075 inducere mitotisk katastrofe i humane cancerceller. Hvorvidt mitotisk katastrofe induceret af BPR0L075 behandling bidrager til cancer celledød er værdig undersøgelse.
Securin, også kendt som hypofysetumor transformerende gen (PTTG1), blev først isoleret fra rotte hypofyse tumorceller [15] . Securin er en multi-funktionel protein, der regulerer søster kromatin segregering i mitose [16], DNA-reparation [17], gentranskription [18], metabolisme og orgel udvikling [19] – [21]. I normalt væv, Securin ekspression er høj i testiklerne og lav i thymus, tyktarm og tyndtarm [22]. I modsætning hertil Securin er blevet identificeret som et onkogen og en markør er invasiv grundet dets overekspression i en række tumorer [23], og har vist sig at regulere tumor celleproliferation og tumorigenese [24], [25]. I vores tidligere undersøgelser blev anticancermidler såsom oxaliplatin og fisetin vist at inducere celledød via nedregulering af Securin ekspression [26] – [28]. BPR0L075 besidder anti-tumor og anti-angiogeneic aktiviteter ved at inhibere funktionen af mikrotubuli, især på metafase til anafase overgang i mitose [6], [7]. Securin er også et protein, der er involveret i kontrol af metafase-anafase overgang og anafase debut. Men effektiviteten af BPR0L075 hos patienter med kræft højt udtrykkende Securin er stadig ukendt.
I denne undersøgelse undersøgte vi rolle Securin i at interferere med følsomhed over for BPR0L075 i humane cancerceller og viste for første gang at phosphorylering og destabilisering af Securin øger følsomheden til mikrotubuli de-stabiliserende forbindelse BPR0L075 i HCT116 humane kolorektale cancerceller. Vi belyst yderligere de molekylære mekanismer i celledød induceret af BPR0L075 i HCT116-celler. Vores resultater viser, at Securin synes at være en passende klinisk mål for BPR0L075 behandling.
Resultater
De anticancer effekter af BPR0L075 blev korreleret med ekspressionsniveauerne af Securin i humane cancerceller
for at undersøge rollen af Securin i anticancer virkninger af BPR0L075, adskillige humane cancerceller med forskellige Securin ekspressionsniveauer, herunder lungekræft celler (A549), humane brystceller (MCF-7 og MDA-MB-231), melanom ( MDA-MB-435) og kolorektal cancer celler (HCT116), blev anvendt (fig. 1A). Efter behandling med BPR0L075 i 24 timer blev deres cellelevedygtighed effektivt inhiberes. Blandt dem, HCT116 celler med det højeste ekspressionsniveau af Securin udviste den største følsomhed for BPR0L075 (fig. 1B). For at konstatere rolle Securin i cytotoksicitet BPR0L075 blev HCT116-celler behandlet med BPR0L075 og cellelevedygtigheden blev derefter undersøgt ved MTT-assay. Som forventet blev cytotoksicitet BPR0L075 reduceret i Securin-null HCT116 celler (Fig. 1C), hvilket indikerer, at Securin udtryk forbedret anticancer effekter af BPR0L075.
(A) Niveauerne af Securin i A549, MCF- 7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 og HCT116-celler blev karakteriseret ved Western-blot-analyse. (B) Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af BPR0L075 i 24 timer. Cellelevedygtigheden blev undersøgt ved MTT-assayet. (C) Cellen levedygtighed Securin-vildtype og -null HCT116 celler blev målt ved MTT-assayet. p 0,01 (**) angiver en signifikant forskel mellem BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) angiver en signifikant forskel mellem Securin-vildtype og -null HCT116 celler
Tab af Securin udtryk svækket cytotoksicitet af BPR0L075 gennem fald i G
2 /. M anholdelse og apoptose i HCT116 kolorektal kræftceller
for yderligere at karakterisere rolle Securin i BPR0L075-induceret cytotoksicitet, cellecyklusprogression og celledød blev analyseret ved flowcytometri. BPR0L075 blev fundet at inducere G
2 /M arrest (fig. 2A) og apoptose (fig. 2B) i HCT116-celler, der var svækket i Securin-nul-celler. Interessant colchicin-induceret G
2 /M arrest blev også reduceret i Securin-null HCT116-celler (fig. 2A), hvorimod Cisplatin inducerede lignende fraktioner af apoptose i Securin-vildtype og -null HCT116 celler (fig. 2B ). Disse resultater antydede, at Securin specielt kræves for anticancer effekter af mikrotubuli målretning narkotika.
Celler blev behandlet med 5 til 80 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Distributionen cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri. Procenterne af G
2 /M celler blev kvantificeret. (B) Cell apoptose blev bestemt ved Annexin-V /PI dobbelt farvning. Apoptotiske celler blev kvantificeret ved begge Annexin-V positive og Annexin-V /PI dobbelt positive celler. p 0,01 (**) angiver en signifikant forskel sammenlignet med ubehandlede prøver. p 0,01 (##) angiver en signifikant forskel mellem Securin-vildtype og -null HCT116 celler
Securin forbedret BPR0L075-induceret DNA skade responset og spindel samling checkpoint i HCT116 celler
.
Anticancer midler kan forårsage DNA-skader af kræftceller og dermed aktivere cellecykluskontrolpunkter, hvilket fører til standsning af cellecyklus, og tillade cellerne at reparere før indtastning mitose. Hvis cellerne ikke reparere, vil celledød via apoptose opstå [29], [30]. γ-H2AX betragtes som et kontrolpunkt vedligeholdelse faktor, og dets dephosphorylering muliggør genoptagelse af cellecyklussen efter DNA beskadigelse repareres [31]. For at undersøge om BPR0L075 inducerede en DNA-skader reaktion i HCT116-celler blev protein-niveauer af γ-H2AX efter BPR0L075 behandling analyseret under anvendelse western blot. BPR0L075 induceret γ-H2AX ekspression i både Securin-vildtype og -null HCT116 celler (fig. 3A). Som svar på DNA-skader, to forskellige kinase signalering kaskader, ATM /Chk2 og ATR /Chk1 veje, aktiveres [32]. Niveauerne af phosphorylering af Chk1 og Chk2 var forhøjet ved BPR0L075 behandling i både Securin-vildtype og -null HCT116 celler. Endvidere aktiveringen af Chk1 og Chk2 var højere i Securin-vildtypeceller end i Securin-null HCT116 celler efter BPR0L075 behandling (fig. 3A).
Celler blev behandlet med 10~80 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Niveauerne af γ-H2AX, phospho-Chk1, phospho-Chk2, blev samlet chk1 og Chk2 analyseret ved Western-blot i BPR0L075-behandlede Securin-vildtype og -null HCT116 celler. (B) Niveauerne af Securin, phospho-H3 (Ser10), cyklin B1, phospho-cdc2 (Thr161) og totale cdc2 blev konstateret ved Western blot-analyse.
Behandling af celler med mikrotubuli hæmmere resulterer i aktivering af den mitotiske spindel samling kontrolpunkt (SAC), hvilket fører til mitosestandsning før anafase [33]. Desuden, aktivering af SAC hæmmer også anafase-fremmende kompleks /cyclosom (APC /C), hvilket fører til en stabilisering af Securin og cyclin B1 [34]. At belyse, om BPR0L075 aktiveret SAC blev HCT116-celler behandlet med BPR0L075 og ekspressionsniveauerne af SAC-relateret mitotiske markører, såsom phospho-Histone H3 (Ser10), cyclin B1, og phospho-cdc2 (Thr161) blev undersøgt. Disse mitotiske markører blev induceret i begge Securin-vildtype og -null HCT116 celler (fig. 3B). Imidlertid er omfanget af SAC-aktivering var lavere i Securin-nul-celler (fig. 3B). Endvidere blev ekspressionen af phospho-Securin induceret af mere end 10 nM BPR0L075 i vildtype HCT116 celler (fig. 3B), som blev korreleret med stigningen i G
2 /M arrest (fig. 2A). Securin er beriget i G2 /M-fase og nedbrydes efter mitotisk exit [35]. Konsekvent blev Securin udtryk reduceret med 10 nM BPR0L075, hvor G2 /M anholdelse blev ikke fundet sted (fig. 2A og 3B). Derfor BPR0L075 inducerede DNA-skader og SAC, der kan forbedres i tilstedeværelse af Securin i HCT116 celler.
BPR0L075 induceret Securin phosphorylering og påvirkede stabiliteten af mitotiske regulatoriske molekyler i HCT116 celler
Det blev bemærket, at Securin havde tendens til at blive væsentligt band-skiftet efter BPR0L075 behandling i HCT116 celler (fig. 3B). Undersøge, hvorvidt band-shift af Securin var et resultat af dets phosphorylering blev BPR0L075-behandlede proteinekstrakter inkuberet med alkalisk phosphatase (AP) og derefter analyseret ved western blot. Bandet-skift af Securin blev reduceret med AP (fig. 4A), hvilket tyder på, at BPR0L075 induceret Securin fosforylering. For yderligere at bekræfte dette fænomen, flere anti-mikrotubulus lægemidler, herunder colchicin, paclitaxel og vinblastin, blev anvendt til at inducere mitosestandsning. Som vist i fig. 4B, behandling med anti-mikrotubuli lægemidler resulterede også i bånd-skift af Securin. Interessant nok blev en mellemliggende vandrende bånd (som angivet ved stjerne) af Securin observeret i BPR0L075-behandlede celler (fig. 4B). Siden seks phosphoryleringssteder på Securin er blevet identificeret [36], kan dette bånd repræsenterer en forbigående hypophosphorylerede form for Securin. Faktisk en
in vitro
Securin fosforylering assay viser to langsommere migration bånd af phosphoryleret Securin [37].
(A) Celler blev behandlet med 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Cellelysater blev udsat for alkalisk phosphatase assay og niveauerne af Securin blev bestemt ved Western blot. (B) Celler blev behandlet med fra 0 til 80 nM BPR0L075, colchicin, paclitaxel og vinblastin i 24 timer. (C og D) Celler blev behandlet med eller uden MG132 /cycloheximid for 2 til 24 timer efter 24 timers BPR0L075 behandling. De Cellelysaterne blev udsat for Western blot-analyse ved hjælp af antistoffer specifikke for cyclin B1, phospho-H3 (Ser10) og Securin.
Stabiliteten af Securin afhænger af dens fosforylering tilstand. Hyperphosphoryleret former bliver hurtigt ødelagt via Skp1 /CUL1 /F-box-protein-kompleks (SCF) E3 ubiquitin ligase [38]. For at undersøge om BPR0L075-induceret Securin phosphorylering påvirket sin proteinstabilitet blev celler behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer og derefter udvindes i medium indeholdende enten proteasominhibitor MG132 eller proteinsynteseinhibitoren cycloheximid (CHX) i 2-24 timer. Det blev konstateret, at efter BPR0L075 tilbagetrækning, den phosphorylerede form af Securin blev hurtigt nedbrudt, og tilsætning af MG132 blokeret dens nedbrydning (fig. 4C). I modsætning hertil blev den hypophosphorylerede form af Securin steg i celleindvinding, som kunne blokeres af CHX behandling (fig. 4D), hvilket antyder, at Securin resyntetiseres efter helbredelse fra BPR0L075. Nedbrydningshastigheden af Securin var sammenlignelig med andre mitotiske regulatoriske molekyler, herunder cyclin B1 og phospho-histon H3 i vildtype HCT116 celler (Fig. 4c og 4d). Interessant, ophobning af phospho-histon H3 var højere i MG132-behandlede Securin-nul-celler (fig. 4C), og de fald i cyclin B1 og phospho-histon H3 var lavere i CHX-behandlede Securin-nul-celler (fig. 4D ). Disse resultater viste, at BPR0L075 behandling induceret ustabilitet af mitotiske regulatoriske molekyler i tilstedeværelse af Securin.
BPR0L075 induceret mitotisk katastrofe i HCT116 celler
Mitotisk katastrofe er en form for celledød under eller efter unormal mitose [8]. Vores resultater foreslog, at BPR0L075 induceret fosforylering af Securin, som kan destabilisere mitotiske regulatoriske molekyler og dermed fremme mitotisk katastrofe i HCT116 celler. For at løse denne mulighed, Securin-vildtype og -null HCT116-celler behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer blev udvundet i dyrkningsmedium til 12-96 timer, og cellecyklusprogression og apoptose blev derefter analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Resultaterne indikerede, at, efter BPR0L075 fjernelse, G
2 /M fraktion blev reduceret og cellecyklusprogression blev genoptaget i Securin-vildtype og -null HCT116 celler (fig. 5A). Men faldene af G
2 /M fraktionen i Securin-vildtypeceller var mere markant end i de Securin-nul celler, som blev afspejlet af stigningerne i G
0 /G
1 og S-fase celler i vildtypeceller (fig. 5A). Hertil kommer, at stigninger i sub-G
1 fraktion var også højere i Securin-vildtype celler (fig. 5A), hvilket tyder på, at Securin udtryk fremmet mitotisk katastrofe i HCT116 celler. Endvidere blev celle apoptose efter BPR0L075 tilbagetrækning analyseret ved annexin V /PI dobbelt farvning. Konsekvent, blev mere celle apoptose i Securin-vildtypeceller induceres efter celleindvinding i 24 timer (fig. 5B og 5C).
(A) Celler blev behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer og BPR0L075 tilbagetrækning i 12 til 96 timer. Fordelingen cellecyklus blev bestemt ved flowcytometri. (B og C) Celler blev behandlet med BPR0L075 i 24 timer og BPR0L075 tilbagetrækning eller ingen tilbagetrækning i 24 timer. Procentdelen af døde celler (Annexin positive og Annexin /PI double positive) blev bestemt ved Annexin-V /PI-farvning. p 0,01 (**) angiver en signifikant forskel mellem BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) angiver en signifikant forskel mellem Securin-vildtype og -null HCT116 celler
BPR0L075 induceret fosforylering af Securin, G
2 /M anholdelse og cytotoksicitet gennem en. cdc2 (CDK1) -afhængig vej
Securin phosphoryleres af cdc2 (CDK1) [39]. For at undersøge om cdc2 signalering er ansvarlig for BPR0L075-induceret phosphorylering af Securin blev virkningerne af Cdc2, CDK og CDC25 specifikke inhibitorer (alsterpaullone, purvalanol eller NSC 663.284, henholdsvis) på BPR0L075-induceret phosphorylering af Securin overvåges. Phosphorylering af Securin blev delvist reduceret med cdc2 /CDK-inhibitorer (fig. 6A). Desuden viste vi også, at hæmning af cdc2 eller CDK reducerede BPR0L075-induceret G
2 /M anholdelse og cytotoksicitet i Securin-vildtype HCT116 celler (Fig. 6B og 6C). Disse resultater tyder på, at som svar på BPR0L075 behandling, cdc2 fosforyleret Securin, hvilket fører til højere G
2 /M anholdelse og dermed lette cytotoksicitet BPR0L075 i HCT116 celler.
Celler blev forbehandlet med NSC663284, alsterpaullone og purvalanol i 2 timer før udsættelse for 20 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Niveauerne af Securin, phospho-cdc2 (Thr161), phospho-H3 (Ser10) og totale cdc2 blev analyseret ved Western blot. (B) Distributionen cellecyklussen blev bestemt ved flowcytometri. (C) Cellelevedygtigheden blev analyseret ved MTT-assayet. p 0,01 (**) angiver en signifikant forskel mellem alsterpaullone (0,5 uM), Purvalanol (0,5 uM) og BPR075 (20 nM) alene i sammenligning med kontrollen. p 0,01 (##) angiver en signifikant forskel mellem BPR0L075 alene og forbehandling med alsterpaullone og purvalanol
BPR0L075 celledød via aktivering af JNK- og p38 MAPK veje og en caspase-. uafhængig mekanisme i HCT116 celler
Som reaktion på ydre påvirkninger eller skader, cellerne normalt aktivere JNK eller p38 MAPK veje, der fører til celledød [40], eller ERK vej for overlevelse [41]. Det er blevet rapporteret, at aktivering af p38 MAPK eller inhibering af ERK er involveret i apoptose induceret af anti-mikrotubulus lægemiddel nocodazol alene eller kombination med paclitaxel [42], [43]. For at løse rolle MAPK pathways i BPR0L075-induceret celledød i Securin-vildtype HCT116-celler, de aktiveringer af p38 MAPK, JNK og ERK blev analyseret ved western blot. P38 MAPK, blev JNK og ERK pathways aktiveret af BPR0L075 (fig. 7A). Specifikke inhibitorer af p38 MAPK, JNK og ERK (SB2021900, SP600125 og U0126, henholdsvis) blokerede BPR0L075-induceret aktivering (fig. 7B og 7C). Men hæmning af p38 MAPK, JNK og ERK pathways påvirkede ikke BPR0L075-induceret phosphorylering af Securin (fig. 7B og 7C). Desuden er det kun SP600125 inhiberede BPR0L075-induceret phospho-Histone H3 (fig. 7B).
(A) Celler blev behandlet med fra 0 til 80 nM BPR0L075 i 24 timer. Niveauerne af phospho-p38, -JNK1 /2, og -ERK1 /2, og total p38, JNK1 /2 og ERK1 /2 blev bestemt ved Western blot. (B og C) Celler blev forbehandlet med SB202190, SP600125 og U0126 i 2 timer før eksponering til 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Niveauerne af phospho-p38, -JNK1 /2, -ERK1 /2, -cdc2 (Thr161), og -H3 (Ser10), og total p38, JNK1 /2, ERK1 /2 og cdc2 blev analyseret ved Western blot. (D) Cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet. (E og F) Celler blev forbehandlet med z-VAD-fmk i 2 timer og derefter udsat for 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Niveauerne af phospho-p38, -ERK1 /2, og -H3 (Ser10), og total p38, ERK1 /2 og Securin blev analyseret ved Western blot. Cellelevedygtigheden blev analyseret ved MTT-assayet. p 0,01 (**) angiver en signifikant forskel mellem BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) angiver en signifikant forskel mellem BPR0L075 alene og forbehandling med SB202190 og SP600125
Vi analyserede yderligere virkningerne af MAPK inhibitorer på BPR0L075-induceret cytotoksicitet ved MTT-analyse.. Behandling med SB202190, SP600125 eller U0126 alene påvirkede ikke celle overlevelse i HCT116 celler (Fig. 7D). Desuden SB202190 og SP600125 kunne redde celler fra BPR0L075-induceret cytotoksicitet (Fig. 7D). Disse resultater viser, at aktivering af p38 MAPK og JNK pathways er nødvendige for BPR0L075-induceret celledød i HCT116-celler. For yderligere at undersøge, om caspaseaktivering er involveret i BPR0L075-induceret celledød, blev cellelevedygtigheden af celler forbehandlet med pan caspaseinhibitor, z-VAD-fmk, kombineret med BPR0L075 behandling analyseret ved MTT-assayet. Vi fandt, at inhibering af caspase ikke påvirkede cellelevedygtigheden efter BPR0L075 behandling (fig. 7E). Desuden BPR0L075-induceret aktivering af p38 MAPK og ERK veje, samt phosphorylering af Securin og histon H3, blev ikke påvirket. Disse resultater indebærer, at BPR0L075 celledød via en caspase-uafhængig vej i HCT116 celler.
Diskussion
Securin, et onkogen, er overudtrykt i forskellige cancerceller og er ansvarlig for at fremme celleproliferation og tumorigenese [24], [25]. Tidligere er det blevet rapporteret, at Securin niveauer er nedreguleret i HCT116 celledød fremkaldt af kemoterapeutiske lægemidler [26], [44], hvilket tyder på, at det kunne være et mål for kræftbehandling. I denne undersøgelse fandt vi, at cytotoksicitet af anti-mikrotubulus lægemiddel BPR0L075 var positivt korreleret med ekspressionsniveauerne af Securin i forskellige cancerceller. Securin blev phosphoryleret ved behandling med BPR0L075 samt andre anti-mikrotubuli lægemidler, herunder colchicin, paclitaxel og vinblastin, i HCT116-celler. Ophobningen af fosforyleret Securin blev ledsaget af højere G2 /M anholdelse og cytotoksicitet. Phosphorylering af Securin yderligere fører til dets destabilisering og derefter fremmer mitotisk exit og mitotisk katastrofe af HCT116 celler. Derfor foreslår vi, at Securin er et vigtigt mål for anticancer effekter af BPR0L075 i humane kolorektal kræftceller.
Mitotisk katastrofe kunne være forårsaget af lægemidler, der er målrettet mikrotubuli eller påvirke udviklingen af mitose [8], [9 ]. Mange forskellige celle skæbner kan være forårsaget af mitotisk katastrofe. For det første kan celler dør uden mitotisk exit. For det andet, efter mitotisk exit og nå G1 fasen, celler undergår celledød eller senescens [12]. Det er blevet rapporteret, at docetaxel, en mikrotubulus-stabiliserende middel, inducerer celledød gennem mitotisk katastrofe i humane brystcancerceller [14]. Desuden en anden mikrotubulus-stabiliserende middel, combretastatin-A4 prodrug (CA4P), inducerer mitotisk katastrofe efter mitosestandsning i kronisk lymfatisk leukæmi celler [13]. Vores resultater viser, at BPR0L075 inducerede mere omfattende celledød efter fjernelse af lægemiddel i Securin-vildtype HCT116 celler end i Securin-nul-celler. Desuden nylig undersøgelse viste, at langvarig mitosestandsning induceret af anti-mikrotubuli lægemidler kunne føre til mere celledød [45]. Endvidere fandt vi, at BPR0L075 behandling i 12 til 24 timer inducerede mere celledød efter tilbagetrækning BPR0L075 sammenlignet med behandling i 4 eller 8 timer (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at BPR0L075 induceret mitotisk katastrofe gennem induktion af langvarig mitosestandsning i humane kolorektale cancerceller.
Nocodazole behandling inducerer mitosestandsning og fosforylering af Securin i HCT116 og U2OS celler [46]. Konsekvent, i denne undersøgelse fandt vi, at BPR0L075 og andre anti-mikrotubuli lægemidler induceret Securin phosphorylering i HCT116-celler. Det er blevet rapporteret, at Securin phosphoryleres af cdc2 (CDK1) [39]. MAPK kinase inducerer også Securin phosphorylering og regulerer sin transaktiveringsfunktion [47]. Som svar på DNA-skade, er Securin phosphoryleres ved DNA-PK (DNA-afhængig proteinkinase), som bidrager til blokering af søster chromatin separation [17], [48]. Som det fremgår af vores resultater, BPR0L075-induceret phosphorylering af Securin blev kun delvis inhiberet af cdc2 /CDK specifik inhibitor. Disse resultater viste, at BPR0L075 inducerede Securin phosphorylering dels gennem cdc2 aktivering. Derfor kan der være andre kinaser, der inducerer phosphorylering af Securin. Imidlertid blev BPR0L075-induceret aktivering af MAPK-kinaser ikke involveret i phosphorylering af Securin. Foreslår vi derfor, at BPR0L075 inducerer celledød gennem p38 MAPK og JNK pathways, som er uafhængig af phosphorylering af Securin.
Securin er blevet rapporteret at interagere med DNA-reparation protein Ku70. Når celler lider DNA beskadigelse, DNA-PK phosphorylerer Securin at udløse cellecyklusstandsning. Derefter er interaktionen af Securin og Ku70 undertrykt, frigiver således Ku70 at fremme DNA-reparation [17], [48]. I modsætning hertil Securin overekspression kan forsinke mitose progression og søsterchromatidadskillelse under DNA skader gennem hæmning af Ku70 [48]. I vores undersøgelse BPR0L075 inducerede højere G
2 /M arrest i Securin-vildtype HCT116 celler end i Securin-nul-celler, hvilket antyder, at en større reparation evne og forhøjet checkpoint aktivering blev fremkaldt i nærværelse af Securin, der kan resultatet fra phosphorylering og destabilisering af Securin af BPR0L075.
Ekspression af Securin er fundet i forskellige kræftformer at være korreleret med en dårlig klinisk resultat [49], [50]. I denne undersøgelse fandt vi, at BPR0L075 induceret DNA-beskadigelse og moduleret mitotiske regulatoriske molekyler at aktivere spindelkonstruktion checkpoint i HCT116-celler. Efter BPR0L075 tilbagetrækning, celler af G
2 /M fraktionen undergik mitose katastrofe, som blev styrket ved phosphorylering og destabilisering af Securin. Desuden BPR0L075 forårsagede celledød via en caspase-uafhængig mekanisme og aktivering af JNK og p38 MAPK pathways (Fig. 8). Disse resultater, der er fastsat beviser for første gang, at BPR0L075 behandling er gavnlig til behandling af humane kolorektale tumorer med højere niveauer af Securin. Som BPR0L075 blev godkendt af den amerikanske FDA for fase 1 klinisk forsøg i 2010, kunne ekspressionsniveauerne af Securin være en prædiktiv faktor for at afgøre prioriteringen af anti-cancer behandling med BPR0L075 i humane cancerceller. Vore resultater indikerer også, at målretning Securin kan være en egnet strategi for at udvide den kliniske anvendelse af BPR0L075 for forskellige cancerformer overudtrykker Securin.
BPR0L075 induceret DNA-skader, der fører til Chk1 /Chk2 aktivering, hæmning af Cdk1 aktivitet og G2-standsning . Det modulerede også Cdk1-afhængig phosphorylering af mitotiske regulatoriske molekyler at aktivere spindelkonstruktion kontrolpunkt, som blev svækket i nærvær af Securin. Efter BPR0L075 tilbagetrækning, celler af G
2 /M fraktionen undergik mitose katastrofe, som blev styrket ved phosphorylering og destabilisering af Securin. Desuden BPR0L075 forårsagede celledød via en caspase-uafhængig mekanisme og aktivering af JNK og p38 MAPK veje.
Materialer og metoder
Materialer
Den sammensatte BPR0L075 var syntetiseret ved afdelingen for bioteknologi og Pharmaceutical Research, National Health Research Institutes, Zhuman, Taiwan, ROC. BPR0L075, et hvidt fast stof, blev opnået i et udbytte 72% ud fra 6-methoxyindol og 3,4,5-trimethoxybenzoylchlorid og blev opløst i dimethylsulfoxid. Propidiumiodid (PI, p4170), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, M5655), colchicin (C9754) og purvalanol (P4484) blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. Antistoffer specifikke til ERK (C14), p38a (C-20) og JNK (C-17) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Anti-phospho-histon H2A.X (Ser139) (# 05-636) og phospho-histon H3 (Ser10) (# 05-806) antistoffer blev indkøbt fra Upstate. Anti-Securin (ab-3305) antistof blev købt fra Abcam. Anti-cdc2 (Ab-1) antistof blev købt fra Oncogene Sciences Products. Anti-actin (MAB1501) antistof blev købt fra Chemicon International. Phospho-cdc2 (Thr161) (# 9114), phospho-Chk1 (Ser345) (# 2341), phospho-Chk2 (Thr68) (# 2661), phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251), phospho- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9106), phospho-p38 MAP-kinase (Thr180 /Tyr182) (# 9211), chk1 (# 2345), og Chk2 (# 2662) antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology. Cyclin B1 (Ab-2) og p21 (Ab-1) antistoffer, NSC663284 (# 217.692), alsterpaullone (# 126.870), MG132 (# 474.790), cycloheximid (CHX; # 2.379.763), SB202190 (# 559.388), SP600125 ( # 420.119) og U0126 (# 662.005) blev købt fra Calbiochem.
Cell kultur
Securin-vildtype og Securin-null humane HCT116 kolorektal cancer cellelinjer [27], MCF-7 og MDA-MB-231 humane brystcancer cellelinjer [51], og MDA-MD-435 humane melanom cellelinjer [52] var gaver fra Dr. Ji-Hshiung Chen (Molekylærbiologisk Institut og human genetik, Tzu Chiu University, Taiwan). Securin-vildtype og Securin-null humane HCT116 kolorektal cancer celler blev rutinemæssigt opretholdt i McCoy’5A medium (Sigma, M4892). MCF-7 og MDA-MB-231 humane brystcancerceller blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; GIBCO, 12.800-058). A549 human lungecancer-cellelinje [53] (gaver fra Dr. Lih-Yuan Lin, Institut for Life Science, Nationale Tsing Hua University, Taiwan) blev opretholdt i RPMI 1640 medium (GIBCO, 23.400-021). Det komplette medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Usynkroniserede celler blev anvendt i denne undersøgelse.
Cellelevedygtighed assay
Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT kolorimetrisk assay. Kort fortalt blev cellerne podet ved en densitet på 5.000-10.000 celler pr brønd i 96-brønds plader i 16-24 timer. Ved udgangen af BPR0L075 behandling blev cellerne vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og blev igen dyrket i dyrkningsmedium i 2-3 dage. Efterfølgende blev mediet udskiftet med nye medium suppleret med 0,5 mg /ml MTT og inkuberet i 4 timer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.