PLoS ONE: Regulering af tumorsuppressor FOXO3 ved Thromboxan-A2 receptorer i urothelial Cancer

Abstrakt

transskription faktor FOXO3 er en veletableret tumor suppressor hvis aktivitet, stabilitet, og lokalisering reguleres af fosforylering og acetylering. Tidligere data fra vores laboratorium demonstreret amplificeret thromboxan-A

2 signalering blev forbundet med dårlige prognoser i blærecancerpatienter og overekspression af thromboxan-A

2 isoform-β receptor (TPβ), men ikke TPα, induceret malign transformation af udødeliggjort blære celler

in vivo

. Her beskriver vi en mekanisme af TP medieret modulering af FOXO3 aktivitet og lokalisering ved phosphorylering og deacetylering i en blærecancer celle model.

In vitro

gevinst og tab af funktion undersøgelser udført i ikke-transformerede cellelinjer, UROsta og SV-HUC, afslørede knockdown af FOXO3 udtryk ved shRNA øget celle migration og invasion, mens eksogent overekspression TPβ hævet basal phosphoryleret (p ) FOXO3-S 294 niveauer. Omvendt overekspression af ERK-resistent, mutant FOXO3 reduceret stigninger i UMUC3 cellemigration og invasion, herunder medieret af TP-agonist (U46619). Derudover stimulering af UMUC3 celler med U46619 forøget pFOXO3-S 294-ekspression, som kunne blive dæmpet ved behandling med en TP-antagonist (PTXA

2) eller ERK inhibitor (U0126). Oprindeligt U46619 forårsagede nukleare akkumulering af pFOXO3-S 294; dog forlænget stimulation øget FOXO3 cytoplasmatisk lokalisering. U46619 stimulation faldt samlet FOXO3 transkriptionel aktivitet, men var forbundet med forøget ekspression af sin pro-overlevelse mål, mangan superoxiddismutase. Dataene viser også, at TP stimulation forøget ekspression af histon deacetylase, SIRT1, og svarede med nedsat acetyleret-FOXO3. Kollektivt, data tyder på en rolle for TP signalering i reguleringen af ​​FOXO3 aktivitet medieret dels gennem phosphorylering og deacetylering

Henvisning:. Sobolesky PM, Halushka PV, Garrett-Mayer E, Smith MT, Moussa O ( 2014) Regulering af tumorsuppressor FOXO3 ved thromboxan-A

2 receptorer i urothelial Cancer. PLoS ONE 9 (9): e107530. doi: 10,1371 /journal.pone.0107530

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Februar 4, 2014 Accepteret: August 19, 2014; Udgivet: 9 September, 2014

Copyright: © 2014 Sobolesky et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Imaging faciliteter for denne forskning blev støttet, delvist af Cancer center Support Grant P30 CA138313 til Hollings Cancer center, MUSC. Forskningsprojektet beskrevet var delvist støttet af tilskud RO1127905CA, UL1TR000062, og UL1RR029882 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den femte mest udbredte kræftform i USA med overfladiske overgangsordning celle carcinom (TCC) er den mest almindeligt diagnosticeret form [1]. TCC har en høj gentagelse sats og kræver dyre livslang opfølgning, hvilket gør blærekræft et af de dyreste kræftformer at behandle over en patients levetid [2]. Forstå mekanismerne i oncogen transformation af urothelial celler er afgørende for at designe effektive og nye terapier til behandling af blærecancer. Vi tidligere identificeret en omvendt sammenhæng mellem thromboxan-synthase (TXS) ekspression og overlevelse af blærecancerpatienter, hvilket antyder en rolle for thromboxan prostaglandin (TP) signalering i urotelial tumorprogression [3]. TXS er et vigtigt enzym, som katalyserer omdannelsen af ​​prostaglandin H

2 til thromboxan

2 (TXA

2). Den TXA

2-ligand på sin side aktiverer TP-receptor, fremmer cellemigration, proliferation og invasion, som er centrale kendetegnende for cellulær transformation og progression af sygdom [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Andre undersøgelser har indikeret en rolle for TXA

2 signalering i tumorigenese og maligne fænotyper af prostata [8] og brystkræft [9], [10].

Den menneskelige TP-receptor-genet koder to isoformer, TPα og TPβ [11]. Begge isoformer er syv transmembrane G-protein-koblede receptorer, som kun afviger ved C-terminale domæne [12]. Den C-terminale variant tillader hver isoform for at interagere med både identiske og unikke signalsystemer mediatorer [13]. Ekspression af TP-receptor isoformer er væv og celler-typen afhængig. Vi har tidligere rapporteret TPβ overekspression i blærecancerpatienter var forbundet med et signifikant fald i overlevelse [14]. Desuden overekspression af TPβ, men ikke TPα, var tilstrækkelig til at forøge migration, invasion og proliferation, samt fremkalde den maligne transformation af en immortaliseret ikke-transformerede urotelial cellelinie [14]. Mekanismen for transformation induceret af TPβ overekspression fortsat ukendt.

transskription faktor forkhead box-O3 (FOXO3) regulerer vigtige celle overlevelse processer, herunder oxidativ stress modstand, cellecyklusstop, og apoptose gennem regulering af sit mål gener f.eks mangan superoxiddismutase (MnSOD), p27

Kip1, Fas ligand (FasL), og Bim [15], [16]. FOXO3 transkriptionel aktivitet kan reguleres gennem post-translationelle modifikationer (PTM), såsom acetylering og phosphorylering. Dysregulering af FOXO3 aktivitet og lokalisering er blevet associeret med cancer initiering og progression, samt kemoterapeutisk resistens [17], [18], [19]. Acetylering af FOXO3 af histon acetyl-transferase p300 er blevet forbundet med nedsat FOXO3 aktivitet, øget cytoplasmatisk lokalisering, og nedbrydning [20]. Deacetylering af NAD-afhængig deacetylase sirtuin-1 (SIRT1) har vist sig at differentieret regulere FOXO3 mål ved at fremme transskription af P27

Kip1 og MnSOD, men med færre transskription af Bim og FasL [21]. Ekstracellulær signal-regulerede kinase 1 og 2 (ERK1 /2) har vist sig at phosphorylere FOXO3 på -S294, -S344 og -S425, og negativt påvirke dens funktion og stabilitet gennem murine dobbelt minutter 2 (MDM2) -medieret FOXO3 nedbrydning [ ,,,0],22]. Mens stimulering af TPβ vides at inducere phosphorylering og aktivering af ERK [23], [24], [25], så vidt vi ved ingen undersøgelse har undersøgt virkningerne af TP-signalering på FOXO3 graduering.

Her er vi identificeret FOXO3 som en nedstrøms mål for TP-receptor-vej og undersøgte de negative virkninger af TP signalering på FOXO3 lokalisering og funktion i blæren-cancer afledt cellelinje UMUC3. Interessant nok blev samlet FOXO3 transkriptionel aktivitet reduceret efter TP agonist stimulering resulterer i reduceret ekspression af en apoptotisk mål, men forøget ekspression af en stress resistens mål. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [21], blev forskellen udtryk for FOXO3 mål efter TP-agonist stimulering forbundet med øget SIRT1 udtryk og deacetyleret FOXO3. Tilsammen har dette studie belyser en mekanisme, som TP induceret modulering af FOXO3 aktivitet gennem post-translationelle modifikationer bidrager til den maligne fænotype urothelial celler.

Materialer og metoder

Cell kultur

UROsta cellelinje, venligst stillet til rådighed af Dr. Donald Sens (University of North Dakota, Grand Forks, ND) blev afledt fra normale humane urothelial celler og udødeliggjort med SV40 T-antigen [26]. UROsta celler blev holdt i en 70:30 blanding af DMEM-medium (1 g /l glucose: 4,5 g /l glucose; Mediatech, VA, USA), 10% føtalt bovint serum (FBS). Den Simian virus 40-immortaliseret human uroepitele (SV-HUC), blev ikke-transformeret urotelial cellelinie venligst leveret af Dr. Santhanam Swaminathan (University of Wisconsin, Comprehensive Cancer Center, Madison, WI) [27], [28], [29] og celler blev dyrket i F12K Khaigns modificerede medium suppleret med 10% FBS, insulin, hydrocortison, og transferrin. Blæren cancercellelinie UMUC3 blev opnået fra American Type Culture Collection og celler dyrket i RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) indeholdende 10% FBS. Alle medier indeholdt 1% penicillin /streptomycin. Cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2

Antistoffer, reagenser og plasmider

Følgende antistoffer blev anvendt i overensstemmelse med producentens anbefalinger:. PFOXO3-S 294 , pc-jun Ser63, c-jun, Pakt Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ERK, p300, SIRT1, Bim, p27

Kip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), FOXO3, GFP (Santa Cruz), Lamin B1 (GeneTex, Irvine, CA, USA) MnSOD (EnzoLife Sciences, Ann Arbor, MI, USA), α-tubulin (ABD Serotec, Raleigh, NC, USA), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA). TP specifik agonist, U46619 blev indkøbt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA). ERK1 /2-inhibitor U0126 blev købt fra Sigma-Aldrich. FHRE-luc-plasmid var en gave fra Michael Greenberg (Addgene plasmid # 1789, Cambridge, MA, USA). Den GFP-FOXO3

3A (seriner-294, -344, og -425 erstattes til alaniner) og kontrollere pEGFP-C

2-plasmidet var gaver fra Mien-Chie Hung på The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center. Den GFP-TPβ plasmid var en gave fra Jean-Luc Parent fra University of Sherbrooke, Canada.

Western blot-analyse

Celler blev vasket med PBS og høstet i RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific ) suppleret med Complete proteasehæmmere Cocktail Tabletter og PhosSTOP phosphataseinhibitorer Cocktail Tabletter (Roche Applied Science). Proteiner blev denatureret ved kogning i Laemmli-buffer (BioRad, Hercules, CA, USA) og opløst ved 12% SDS-PAGE. Efter protein overdragelse blev nitrocellulosemembranen blokeret med 5% mælk i 1 × TBST og probet med primært antistof i 5% BSA i 1 × TBST natten over ved 4 ° C. Efter primære antistof inkubation blev membranerne vasket i 1 × TBST og inkuberet med HRP-bundet sekundært antistof (Cell Signaling Technology) i 1 × TBST. Membraner blev vasket 5 x i 5 minutter med 1 × TBST og påvisning blev visualiseret under anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific). Western blots blev kvantificeret under anvendelse Billede Studio Lite Ver. 3.1 Følgende software instruktioner og tegnes på GraphPad Prism 5.

transfektioner og generering af stabile kloner

For at generere stabile FOXO3 knockdown kloner, SV-HUC og UROsta celler blev transficeret med enten pRFP-C- RS kontrol plasmid, pRFP-C-Scrambled eller pRFP-c-shRNA til FOXO3 plasmid (tys-29; OriGene, Rockville, MD, USA) ved hjælp FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Enkelte kloner blev selekteret i medium indeholdende 2,5 ug /ml puromycin (Invivogen, San Diego, CA, USA) og knockdown blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af et FOXO3 specifikt antistof (H-144; sc-11351; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA). Transfektion af GFP-TPβ ind SVHUC celler blev udført med TurboFect transfektionsreagens (Thermo Fisher Scientific) under anvendelse af et forhold på 1,5 ug DNA til 4 gl TurboFect. UROsta celler (1 x 10

6) blev elektroporeret med 3,5 ug GFP-TPβ hjælp af Amaxa cellelinie Nucleofector kit V opløsning boks (cat #: VCA-1003 Lonza, Allendale, NJ, USA) og Nucleofector 2b enhed (Lonza) med den forprogrammerede protokol T-030. Fire timer efter elektroporering blev mediet aspireret og erstattet med komplet medie og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2. Transfektionseffektiviteten blev kontrolleret 24 timer efter elektroporering. For at generere stabile GFP-FOXO3

3A udtrykkende UMUC3 kloner, blev celler i en plade med 6 brønde transficeres under anvendelse af 4 pi X-tremeGENE HP DNA-transfektion Reagent (Roche Applied Science) og 1,5 ug plasmid-DNA. Enkelte kloner blev udvalgt i medier, der indeholder 500 ug /ml Geneticin Selektiv Antibiotika (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).

cellemigrationsassay

BD falk Cell Culture Insert System indeholder polyethylenterephthalat (PET) membraner med 8 um porer (BD Biosciences, Rockville, MD, USA) blev anvendt til dette assay. Indsatsene blev præ-coatet natten over med 5 ug /cm

2 fibronectin ved 4 ° C og ækvilibreret i vand i 2 timer ved 37 ° C før brug. Trypsinerede celler blev opsamlet, talt og 5 × 10

4 celler blev resuspenderet i 250 pi serum-frit medium. Det øvre kammer af insertet blev fyldt med cellesuspensionen, hvorimod 750 pi medium indeholdende 10% FBS blev tilsat til bunden af ​​hver brønd. UROsta Cellerne fik lov til at migrere i 16 timer i en fugtig miljø ved 37 ° C med 5% CO

2. Efter migrering blev cellerne fjernet fra den øvre overflade af membranen ved at tørre den med en fugtig vatpind. Den nedre overflade af membranerne blev farvet under anvendelse af Hema-3 Farvning kit (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA). Når farvningen var færdig blev membranerne skyllet i destilleret vand i overskydende pletfjernelse og lufttørret natten over. Procent migration eller invasion blev beregnet ved at tælle og midling antallet af celler invaderet i 10 tilfældige synsfelter ved en 40 x forstørrelse, divideret med arealet af mikroskopet visning feltet og derefter multipliceret med arealet af Transwell insert. Derefter opdele tidligere beregnede antal med antallet af celler podet og endelig gange med 100 for at få en procent. Dette forsøg blev udført uafhængigt tre gange i dubletter.

Cell invasion assay

BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber Cell Culture Insert System indeholdende 8 um PET-membran (BD Biosciences) med et tyndt lag af MATRIGEL basalmembranmatrix blev anvendt til dette assay. Trypsinerede celler blev opsamlet, talt og resuspenderet ved 5 x 10

4 celler /ml i serum-frie medier. Den øverste kammer modtog 500 pi af cellesuspensionen, mens 750 pi RPMI med 10% FBS blev tilsat til brønden. Cellerne fik lov til at invadere i 16 timer i en fugtig miljø ved 37 ° C med 5% CO

2 før celle fjernelse fra den øvre overflade med en fugtig vatpind. Membraner blev farvet under anvendelse af Hema-3 Farvning kit (Thermo Fisher Scientific) og procent invasion blev beregnet som beskrevet i cellemigrationsassay sektion. Dette eksperiment blev udført uafhængigt tre gange i dubletter.

Dual luciferase assay

UMUC3 celler blev podet i plader med 6 brønde ved 0,3 x 10

6 celler /brønd, derefter kortvarigt transficeret inden 24 timer ved anvendelse af X-tremeGENE HP DNA-transfektionsreagens (Roche Applied Science) med 4 ug 3 × forkhead responselement (FHRE) reporterkonstruktion (Addgene plasmid # 1789) og 0,1 ug pBind Renilla luciferase kontrolvektor (Promega, Madison, WI, USA). Transficerede celler blev inkuberet i 24 timer i en fugtig miljø ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev derefter serum sultet natten over og behandlet med enten vehikel kontrol (methylacetat, Sigma-Aldrich) eller 1 uM U46619 (Cayman Chemical) i 30 eller 120 minutter. Efter behandling blev cellerne vasket to gange med PBS og høstet i Reporter Lysis Buffer (Promega). Luminescens blev målt under anvendelse af en Veritas Microplate Luminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA) i 20 pi af hver prøve i 10 sekunder efter hver injektion af 50 pi luciferaseassayreagens II derefter 50 pi Stop og Glow. Den gennemsnitlige Firefly luciferase-ekspression blev indstillet til totalt protein og kontrol vektor Renilla luciferase ekspression, og derefter normaliseret til vehikelkontrol. Resultaterne repræsenterer den gennemsnitlige procent aktivitet tre uafhængige forsøg udført i dubletter, Student

t

-test (*) P. 0,05

Nuclear /cytoplasmatisk celle fraktionering

UMUC3 celler blev serum sultet natten over, derefter forbehandlet med 1 uM indomethacin (Cayman Chemicals) i 10 minutter for at reducere endogen TXA

2 signalering. Celler blev behandlet med vehikel eller 1 uM U46619 i 5, 30 eller 120 minutter. Celler blev trypsinbehandlet, opsamlet og vasket to gange med PBS. Fraktionering blev udført under anvendelse af Pierce NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) ved at følge fabrikantens protokol. Ekstrakterne blev analyseret ved Western blot.

Immunopræcipitation

Immunopræcipitation af FOXO3 fra UMUC3 celler blev udført under anvendelse af NHS-linked IP /Co-IP-kit (Thermo Fisher Scientific) efter producentens protokol. Kort fortalt blev UMUC3 cellerne dyrket til 80% konfluens i 10 cm plader, og derefter anbragt i serumfrit medium i 24 timer i en fugtig miljø ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev derefter behandlet med enten vehikel kontrol (methylacetat, Sigma-Aldrich) eller 1 uM U46619 (Cayman Chemical) i 30, 60 eller 120 minutter. Efter behandling blev cellerne vasket en gang med PBS (-CA, -Mg) og høstet i iskold IP lysis /vaskebuffer tilsat protease inhibitor EDTA-fri cocktail og PhosSTOP inhibitor cocktail (Roche). Indsamlet lysat derefter centrifugeret for at fjerne cellerester og bestemmes proteinkoncentrationen ved hjælp BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific). NHS-aktiverede magnetiske perler blev hvirvlet og 25 pi opslæmning blev overført til 1,5 ml rør pr IP reaktion. Rørene blev placeret på magneten og opbevaring opløsning blev kasseret, og derefter vasket med iskold 1 mM HCI og forsigtigt hvirvlet i 5 sekunder. Perler blev opsamlet på magnetiske stativ og kasseret supernatanten.

Antistofopløsningen blev fremstillet ved fortynding af to ug FOXO3 (Santa Cruz Biotechnology) og negativ kontrol kanin immunoglobulin fraktion (fast fase absorberet) (Dako, Carpinteria, CA , USA) til en endelig koncentration på 2 ug antistof i 100 pi 0.067M boratpuffer. Tilsat 100 pi af tilberedt antistofopløsning til de aktiverede perler, forsigtigt hvirvelbehandlet og inkuberet på en roterende platform i 60 minutter ved stuetemperatur. Reaktioner blev hvirvlet hvert 10. minut under inkubationen for at sikre perlerne forblev i suspension. Perler blev opsamlet og supernatanten blev kasseret. Vasket to gange med perler elueringspuffer, vortexbehandling rør hver vask for at fjerne ikke-kovalent bundet antistof. Quenching buffer blev tilsat til perlerne og inkuberet på en roterende platform i 60 minutter ved stuetemperatur. Perler blev indsamlet på magnetisk stativ og kasseret supernatanten. Fremstillet og tilsat 0,5 ml modificeret boratpuffer til hver IP og blandet forsigtigt ved vortex, så perlerne blev opsamlet på magnetiske stativ og kasseret supernatanten. Reaktioner blev vasket to gange med IP lysis /vaskebuffer, inkuberes derefter hver IP omsætning med 100 ug lysat i slutvolumen på 500 pi IP lysis /vaskebuffer suppleret med protease og phosphatase cocktail inhibitorer natten over (mellem 14-18 timer ved 4 ° C på en rotator. perlerne blev hvirvelbehandlet hvert 15. minut den første time for at sikre perlerne forblev i suspension. Efter antigen inkubation blev perlerne opsamlet, vasket to gange med IP lysis /vaskebuffer og derefter overført til et nyt 1,5 ml rør. Washed perler med ultrarent vand (pH 7,0), derefter anbragt på magnetisk stativ og kasseret supernatanten. proteiner blev elueret fra perlerne med lav pH elueringspuffer (pH 2,0) to gange og neutraliseret med Tris-HCI pH 8,5. eluerede proteiner blev derefter analyseret ved Western-blot .

Statistisk analyse

Kontinuerlig resultater blev sammenlignet på tværs af betingelser ved hjælp af en to-sidet to stikprøver Students

t

-test. Eksperimenter, der indeholder mere end to variable blev sammenlignet ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt med en Tukey post-hoc test. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Knockdown af FOXO3 Øger urothelial Migration og Invasion

Vi har tidligere rapporteret en rolle for TPβ receptoren i urotelial. migration, invasion, og malign transformation [3], [14]. Reduceret FOXO3 ekspression i patienter er også blevet forbundet med urotelial cancer invasionsevne [30]. For at bestemme om FOXO3 inaktivering ville være tilstrækkelig til at inducere en malign fænotype uafhængig af TPβ, lav endogen TPβ udtrykker UROsta og SVHUC cellelinier (tidligere bestemt [14]) blev stabilt transficeret med FOXO3 specifik shRNA (figur 1A). FOXO3-shRNA transficerede celler reducerede FOXO3 proteinekspression over én halvdel sammenlignet med forvrænget (SCR) -shRNA observeret ved Western blot og valideret ved at undersøge nedstrømsmål MnSOD (figur 1A). Sammenlignet med scr-shRNA celler knockdown af FOXO3 udtryk resulterede i en 39% og 114% stigning i migration, samt en 63% og 18% stigning i invasionen af ​​SV-HUC og UROsta celler, henholdsvis (P 0,05, figur 1B-C). Da fraværet af FOXO3 var tilstrækkelig til at inducere en malign fænotype i immortaliserede ikke-transformerede urothelial celler undersøgte vi virkningen af ​​TPβ overekspression på FOXO3 inaktivering. SV-HUC og UROsta celler transficeret med TPβ viste en 0,5 gange forøgelse i den basale ekspression af det inaktive pFOXO3-S 294 protein (figur 1 D-E).

(A) Western blot af hele cellelysater fra SV -HUC og UROsta celler stabilt transficeret med FOXO3-shRNA eller kontrol scrambled (scr-) shRNA immunoblottedes for total FOXO3 og dens kendte nedstrøms mål MnSOD. a-tubulin blev anvendt som ladningskontrol. Blots viste er repræsentative for tre individuelle eksperimenter og tal repræsenterer de gennemsnitlige forhold mellem FOXO3 til a-tubulin. Nøgletal kvantificeres ved hjælp af billede Studio Lite Ver.3.1. SV-HUC og UROsta FOXO3 Knockdown og kontrol kloner blev podet i indsatse overtrukket med fibronectin eller matrigel og fik lov til at migrere (B) eller invadere (C) i 16 timer. Knockdown af FOXO3 øget SV-HUC og UROsta celle migration (39% og 114%) og invasion (63% og 18%, henholdsvis) i forhold til scr-shRNA. Data repræsenterer tre uafhængige assays udført i dubletter og udtrykt som middelværdien ± SEM. Signifikans blev bestemt med en to-sidet to stikprøver

t

-test, (* = P 0,05, n = 3) sammenlignet med scr- kontrol. (D) Overekspression af GFP tagged TPβ i UROsta og SVHUC celler øger basal pFOXO3-S 294-ekspression (E) sammenlignet med vektorkontrol (n = 3). Tal repræsenterer de gennemsnitlige forhold mellem pFOXO3-S 294 til FOXO3. Nøgletal kvantificeres ved hjælp af billede Studio Lite Ver.3.1. [AU] = arbitrære enheder.

Virkninger af TP agonist stimulering på FOXO3 Phosphorylering, Lokalisering, og transkriptionsaktiviteten

For at demonstrere TXA

2 signalering er involveret i FOXO3 regulering, phosphoryleringen status FOXO3 og dets kendte regulator ERK blev undersøgt i UMUC3 celler efter TP agonist U46619 stimulation (figur 2A). TP-agonist-medieret phosphorylering af ERK på T202 /Y204 blev signifikant forøget (-1-fold) 15 og 30 minutter efter stimulering (figur 2A og C). Tilsvarende blev en signifikant stigning i pFOXO3-S 294 observeret 15 (5 gange), 30 (7 gange), og 60 (3,5-fold) minutter efter TP agonist stimulering (figur 2A-B). Behandling af UMUC3 celler med TP antagonist pinan (PTXA

2) eller ERK inhibitor (U0126) svækkede U46619 medierede virkninger af aktiverede ERK og pFOXO3-S 294 (figur 2D-I).

(A) UMUC3 celler blev behandlet med 1 uM U46619 i de angivne tidsrum. Cellelysater blev analyseret ved immunoblotting for både total og phosphoryleret ERK og FOXO3. GAPDH tjente som lastning kontrol. Blots blev kvantificeret og nøgletal for (B) pFOXO3-S 294 til FOXO3 og (C) pERKT202 /Y204 til ERK1 /2 blev afbildet ved hjælp GraphPad Prism 5. UMUC3 celler forbehandlet i 15 minutter med (D) 2 uM TP antagonist pinan (PTXA

2) eller (G) 10 uM ERK inhibitor (U0126) svækkede aktivering af ERK og phosphorylering af FOXO3 efter behandling med 1 uM U46619 i 30 minutter. Cellelysater blev immunoblottedes for både total og phosphoryleret ERK og FOXO3. a-tubulin tjente som lastning kontrol. Grafer repræsenterer kvantificeret nøgletal for (E og I) pFOXO3-S 294 til FOXO3 og (F og G) pERKT202 /Y204 til ERK1 /2 blev afbildet. Signifikans blev bestemt for alle kvantificerede blots ved hjælp af en gentagen foranstaltning One-ANOVA med Tukey post-hoc test. P. 0,05

Virkningerne af TP-agonist stimulering på FOXO3 transkriptionel aktivitet blev undersøgt af en dobbelt luciferaseanalyse. UMUC3 celler blev transient transficeret med forkhead responselementet (FHRE) ildflueluciferase reporterkonstruktion og Renilla styrevektor, før behandling med vehikel eller TP agonist. FOXO3 transkriptionsaktivitet blev signifikant reduceret med 36% og 44% ved 30 og 120 minutter, henholdsvis efter TP agonist stimulering sammenlignet med vehikelkontrol (figur 3A).

(A) UMUC3 celler transient transficeret med 3 × forkhead responselement (FHRE) reporterkonstruktion og Renilla luciferase kontrol vektor blev behandlet med 1 uM U46619 i 30 eller 120 minutter og resulterede i nedsat FOXO3 transkriptionsaktivitet. Den gennemsnitlige Firefly luciferase-ekspression blev indstillet til totalt protein og kontrol vektor Renilla luciferase ekspression før normalisering til vehikelkontrol. Resultaterne repræsenterer den gennemsnitlige procent luciferaseaktivitet af tre uafhængige forsøg udført in duplo. * P 0,05, En-vejs ANOVA med Tukey post-hoc test. (B) UMUC3 celler blev serum sultet natten over og forbehandlet i 15 min. med 1 uM Indomethacin før behandling med enten vehikel eller 1 uM U46619 i 5, 30 eller 120 minutter. Cellerne blev udsat for nuklear og cytoplasmatisk fraktionering og proteiner blev analyseret ved Western-blot. α-tubulin og Lamin-B1 tjente som lastning kontrol for cytoplasmatiske og nukleare fraktioner henholdsvis. (C) Densitometri af blots viser langvarig agonist stimulering øget cytoplasmatisk FOXO3 protein og øget nuklear pFOXO3 proteiner sammenlignet med kontroller af køretøjer. Signifikans blev bestemt for alle kvantificerede blots ved hjælp af en gentagen foranstaltning One-ANOVA med Tukey post-hoc test. P. 0,05

Baseret på phosphoryleringsbegivenheder kinetik FOXO3 undersøgte vi den cellulære fordeling af FOXO3 i UMUC3 celler behandlet med køretøj eller TP agonist til 5, 30 eller 120 minutter. Nukleare og cytoplasmiske proteinfraktioner blev analyseret ved Western blot (figur 3B) og band densiteter blev kvantificeret under anvendelse Billede Studio Lite Ver 3.1 (figur 3C). UMUC3 celler stimuleret med TP-agonist viste en initial stigning i nukleare FOXO3 som også blev forbundet med en stigning i den nukleare pFOXO3-Ser294 (figur 3C). Langvarig stimulation resulterede i en betydelig stigning i den samlede FOXO3 i cytoplasmaet (figur 3C).

TP stimulation øger SIRT1 udtryk, deacetylering af FOXO3, og påvirker FOXO3 target udtryk

Effekten af ​​U46619 stimulation på ekspressionsniveauerne af velkarakteriserede FOXO3 mål p27

Kip1, MnSOD, og ​​Bim blev undersøgt ved Western-blot (figur 4A). UMUC3 celler stimuleret med U46619 i 30, 120 og 240 minutter observeret nedsat p27

Kip1 og Bim proteiner og forøget MnSOD-proteinekspression (figur 4A). Da ekspressionsmønsteret for FOXO3 mål lignede mønsteret iagttaget efter overekspression af histon deacetyltransferase SIRT1 [21], undersøgte vi virkningen af ​​U46619 stimulation på SIRT1 ekspression. UMUC3 celler stimuleret med TP agonist de viste forøget ekspression af SIRT1 og nedsat ekspression af p300 sammenlignet med vehikelkontrol (figur 4B-C). For at bestemme om den forøgede SIRT1 ekspression i UMUC3 celler stimuleret med TP agonist påvirkede FOXO3 acetylering status, blev FOXO3 immunopræcipiteret fra UMUC3 celler behandlet med enten vehikel eller U46619, og immunoblottedes for acetylerede lysinrester. Stimulering af UMUC3 celler med U46619 for 120 og 240 minutter viste en reduktion i acetyleret FOXO3 henholdsvis (figur 4D-E) 48% og 70%.

(A) UMUC3 celler behandlet med vehikel eller 1 uM U46619 for 30, 120 og 240 minutter. Cellelysater blev indsamlet og analyseret ved Western blot for total FOXO3 udtryk og nedstrøms mål p27

Kip1, MnSOD, og ​​Bim. (B) Protein udtryk for p300 og SIRT1 i samme cellelysater. α-tubulin tjente som ladningskontrol. (C) kvantificerede værdier fra blots af tre uafhængige forsøg er afbildet. (*) Angiver p 0,05, One-way ANOVA, sammenlignet med tiden 0 for hver Target ratio. (D) Øget SIRT1 udtryk medieret af U46619 i UMUC3 celler svarede med nedsat acetyleret FOXO3. Total FOXO3 blev immunopræcipiteret fra serum sultet UMUC3 celler behandlet med vehikel eller 1 uM U46619 i 30, 120 eller 240 minutter. Eluerede proteiner blev analyseret ved Western blot med antistoffer mod acetylerede lysinrester og FOXO3. Blots er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Blots blev kvantificeret og nøgletal for (E) acetyleret-lysin (acetyl-K) til FOXO3 blev afbildet. Signifikans blev bestemt ved hjælp af gentagne målinger En-vejs ANOVA med Tukey post-hoc test. P. 0,05

ERK resistente muterede FOXO3

3A Reduceret TP agonist Mediated Migration og Invasion

UMUC3 celler blev stabilt transficeret med et GFP-vektor eller muteret GFP-FOXO3

3A-konstruktion, hvor alle tre ERK phosphorylering rester blev substitueret alaninrester at efterligne et ikke-phosphoryleret eller aktiv tilstand (figur 5A). For at bestemme om U46619 medieret phosphorylering af FOXO3 af ERK påvirker celle migration og invasion, blev stabilt transficerede celler lov til at migrere og invadere efter stimulering med bærer eller U46619. Kontrolsekvenserne GFP-vektor-celler resulterede i en 2 gange stigning i cellemigrering og invasion med U46619 stimulation sammenlignet med vehikelkontrol, hvorimod ekspression af GFP-FOXO3

3A protein reduceret U46619 medieret migration og invasion (figur 5B-C) .

(A) GFP-FOXO3

3A eller EGFP-C

2 (Vector) blev stabilt transficeret i UMUC3 celler og mutant FOXO3 ekspression blev bekræftet ved immunoblotting for GFP. α-tubulin tjente som ladningskontrol. Celler blev podet i indsatse belagt med fibronectin for migration eller matrigel til invasion i serum frie medier indeholdende 1 uM U46619 og placeret i brønde, der indeholder komplet medier med en uM U46619. Cellerne fik lov til at migrere (B) i 8 timer eller invadere (C) i 16 timer. Signifikans blev bestemt med en to-sidet to stikprøver

t

-test, (* = P 0,05, n = 3) sammenlignet med GFP-vektorkontrol. (D) UMUC3 celler blev forbehandlet med 10 pM U0126 i 15 minutter før stimulering med 1 uM U46619 og fik lov til at migrere i 16 timer. Data repræsenterer tre uafhængige assays udført i dubletter og udtrykt som middelværdien ± SEM. Signifikans blev bestemt med en en-vejs ANOVA med Tukey post-hoc test. P. 0,05

For yderligere at demonstrere betydningen af ​​ERK-signalering i TXA

2 medieret celle mobilitet, vi pre-behandlet med ERK-hæmmer U0126 (10 uM) i 10 minutter før måling af effekt på U46619 medieret migration.