PLoS ONE: eicosapentaensyre og Oxypurinol i Behandling af muskelsvind i en musemodel of Cancer Cachexia

Abstrakt

Kræft kakeksi er et wasting tilstand, drevet af systemisk inflammation og oxidativt stress. Dette studie undersøgte eicosapentaensyre (EPA) i kombination med oxypurinol som en behandling i en musemodel for cancer kakeksi. Mus med cancer kakeksi blev randomiseret i 4 behandlingsgrupper (EPA (0,4 g /kg /dag), oxypurinol (1 mmol /l ad lib), kombination eller kontrol), og aflivet efter 29 dage. Analyse af oxidative skader på DNA, mRNA-analyse af pro-oxidant, antioxidant og proteolytiske pathway komponenter, sammen med enzymaktiviteten af ​​pro- og antioxidanter blev afsluttet den musculus gastrocnemius. Kontrolgruppen viste tidligere debut af tumor i forhold til EPA og oxypurinol grupper (P 0,001). EPA-gruppen opretholdt legemsvægt i en længere varighed (20 dage) sammenlignet med oxypurinol (5 dage) og kombination (8 dage) (p 0,05). EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) og kombination (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupper havde signifikant højere 8-OH-dG niveauer end kontrolgruppen (12,9 ± 1,4 pg /ml, p ≤ 0,05), hvilket indikerer øget oxidativ beskadigelse DNA. mRNA-niveauer af GPx1, MURF1 og MAFbx blev højere efter EPA behandling i forhold til kontrol (p ≤ 0,05). Ud fra følgende betragtninger oxypurinol var forbundet med højere GPx1, MnSOD, CAT, XDH, MURF1, MAFbx og UBB mRNA sammenlignet med kontrol (p ≤ 0,05). Aktivitet af total SOD var højere i oxypurinol gruppen (32,2 ± 1,5 U /ml) sammenlignet med kontrol (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), GPX-aktivitet var lavere i EPA-gruppen (8,76 ± 2,0 U /ml) sammenlignet med kontrol (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05), og katalaseaktivitet var lavere i kombinationsgruppen (14,4 ± 2,8 U /ml) sammenlignet med kontrol (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01). Der var ingen ændring i XO aktivitet. Den forhøjede sats af vægt nedgang i mus behandlet med oxypurinol indikerer, at XO kan spille en beskyttende rolle under udviklingen af ​​kræft kakeksi, og dets hæmning er til skade for resultater. I kombination med EPA, der var lidt betydelig forbedring fra kontrol, er usandsynligt, at være en levedygtig behandling stof i cancer kakeksi indikerer oxypurinol

Henvisning:. Vaughan VC, Sullivan-Gunn M, Hinch E, Martin P, Lewandowski PA (2012) eicosapentaensyre og Oxypurinol i Behandling af muskelsvind i en musemodel of Cancer Kakeksi. PLoS ONE 7 (9): e45900. doi: 10,1371 /journal.pone.0045900

Redaktør: Atsushi Asakura, University of Minnesota Medical School, USA

Modtaget: May 3, 2012; Accepteret: August 27, 2012; Udgivet: 20 September, 2012

Copyright: © Vaughan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. VV er modtageren af ​​den victorianske Cancer Agency Palliativ og understøttende behandling Scholarship gennem victorianske Cancer Agency finansieret af delstatsregeringen i Victoria, Australien, og Bellberry Support Scholarship gennem Bellberry Ltd. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange former for kræft er til stede med en kompleks. metaboliske profil karakteriseret ved tab af mager kropsmasse og fedtvæv, kendt som cancer kakeksi. Ca. halvdelen af ​​alle cancerpatienter udvikler kakeksi [1], med forekomsten stiger så højt som 86% i de sidste 1-2 uger af livet [2], og 20% ​​af kræftdødsfald tilskrives kakeksi [3]. Patienter, der lider kakeksi kan miste op til 30% af deres oprindelige kropsvægt, med 45% af patienterne mister mere end 10% af deres oprindelige vægt over sygdomsprogression [4].

Oxidativ stress kan spille en integrerende rolle i cancer kakeksi, med tegn på oxidativ beskadigelse og høje niveauer af reaktive oxygenarter (ROS), der findes i mange cancerceller stater [5]. Rolle ROS i udviklingen af ​​kræft kakeksi, og de mekanismer, der forårsager sygdommen stort set ukendt, trods flere fremskridt i at identificere kredsløbssygdomme faktorer og veje, der er aktive. Et skift i balancen mellem reaktive oxidanter og antioxidanter kan fremkalde en tilstand af oxidativt stress, der er til skade for cellen, og kan være en af ​​de vigtigste faktorer i udviklingen af ​​kakeksi.

superoxiddismutase (SOD) er et enzym ansvarligt for dismutation af superoxid anion (O

2

– ·) til hydrogenperoxid og oxygen. Aktiviteten af ​​SOD er ​​blevet vist at være nedsat i kakektiske tilstand [6], [7], hvilket indikerer, at der er en manglende evne til at kompensere for stigninger i ROS, og derfor en manglende evne til at beskytte cellen mod oxidativ stress i kakektiske tilstand . De antioxidant enzymer katalase og glutathionperoxidase (GPX), der nedbryder hydrogenperoxid til ilt og vand har også vist sig at have lavere aktivitet i kræft kakeksi undersøgelser [8], hvilket indikerer, at systemerne kan være vigtige bidragydere til oxidativ stress og skader observeret i cancer kakeksi.

Mens nogle af de involverede i den overskydende produktion af ROS veje er blevet undersøgt grundigt i kræft kakeksi, der er andre, der har vist sig at spille en rolle i oxidativ fornærmelse i andre sygdomme, som har endnu at blive undersøgt nærmere i kræft kakeksi. Xanthin-oxidoreduktase er et enzym med to forskellige former, der er ansvarlige for at katalysere omdannelsen af ​​hypoxanthin til xanthin og xanthin til urinsyre [9]. Xanthin (XDH) udtrykkes

in vivo

, og bruger NAD + som en elektronacceptor for reduktionsreaktionen, danner NADH. I nærværelse af pro-inflammatoriske mediatorer, XDH lettest spalter i xanthin oxidase (XO), som i stedet anvender molekylært oxygen til omdannelse af hypoxanthin til xanthin og xanthin til urinsyre, producerer meget reaktive O

2

– ·, eller hydrogenperoxid [9]

data præsenteret som gennemsnit ± SEM

Mens XO er normalt ikke til stede i høje niveauer i skeletmuskulatur, forhøjede niveauer er almindeligt set.. i muskelvæv skader og iskæmi-reperfusionsskade [10]. Høje niveauer af XO er også blevet observeret i blodet hos nogle kræftpatienter sammenlignet med patienter uden kræft [11], og det er blevet foreslået, at kakektiske dyr reagere positivt, når de behandles med XO-hæmmere [12]. Den overflod af pro-inflammatoriske faktorer i kakeksi kan føre til en stigning i spaltningen af ​​XDH til XO form forklarer højere cirkulerende niveauer af XO. Øgede niveauer af XO ville så føre til overskydende produktion af ROS, og bidrage til oxidativt stress i kræft kakeksi.

Data præsenteret som gennemsnit ± SEM.

Oxypurinol er en kompetitiv, irreversibel inhibitor af XO, betragtes mere potent end allopurinol, som den er en metabolit [10]. Øjeblikket oxypurinol anvendes som en behandling af tilstande, hvor XO er en bidragyder, og har vist sig at nedsætte vævsspild og øge hjertefunktion hos kakektiske dyr [12], [13]. Et fald i purin og dermed forbundne metabolisme krav kan foranledige en reduktion af XDH ekspression, og derfor nedstrøms aktiviteten af ​​dette enzym. Urinsyre, produceret af XO, øger omdannelsen af ​​arachidonsyre til dets biologisk aktive metabolitter [14]. Det forøger aktiveringen af ​​NADPH-oxidase, og således gør det signaleringskaskade, som resulterer i aktiveringen af ​​øget transkription af komponenterne i ubiquitin-proteasom system.

Data præsenteret som gennemsnit ± SEM.

en væsentligt anderledes i forhold til kontrol,

b væsentligt anderledes i forhold til EPA,

c væsentligt anderledes i forhold til oxypurinol (P 0,05).

Den gradvise katabolisme af muskel i cancer kakeksi foreslår en central rolle i systemer af proteinnedbrydning, såsom ubiquitin proteolytiske pathway (UPP). UPP har vist sig at være opreguleret både i forsøgsmodeller og patienter med kakeksi [15], [16], hvilket indikerer bidrag til muskeltab og tilknyttede negative resultater. Før proteiner nedbrydes af UPP, skal de blive ramt af konjugeret til flere molekyler af ubiquitin. For at denne konjugering kan forekomme, skal ubiquitin først aktiveres af en ubiquitin-aktiverende enzym (E1), og derefter overført til det aktive sted i en ubiquitin-bærerprotein (E2). Det bundne E2 genkender ubiquitin konjugerende enzymer (E3 eller E3-protein ligase), som giver konjugeringsreaktioner at finde sted, som danner en kæde af ubiquitins forbundet med hinanden og proteinsubstratet. Kun når ubiquitin er målrettet til en udvalgt protein kan derefter blive anerkendt af proteasomet, og forarbejdes til mindre peptider [17]. Adskillige E3 protein ligaser har vist sig at være aktive under proteolyse i muskelatrofi, især muskel-specifik F-boks (MAFbx) /atrogin-1 og muskel specifik ringfinger 1 (Murf-1) [18].

data præsenteret som gennemsnit ± SEM.

en væsentligt anderledes i forhold til kontrol,

b væsentligt anderledes i forhold til EPA,

c væsentligt anderledes i forhold til oxypurinol (P 0,05).

eicosapentaensyre (EPA) er et naturligt forekommende omega-3 fedtsyrer, der findes i fede fisk og visse alger, almindeligt anset for at have stort potentiale som en antigenotoxic, antioxidant og kemoforebyggende middel. Indgivelse af EPA har vist sig at øge aktiviteten af ​​ROS scavenging SOD [19], forsinke udviklingen af ​​visse kræftformer, og øge vægtstigning og livskvaliteten i patienter med pancreascancer [20]. I de senere år har EPA blevet afprøvet som en behandling for cancer cachexia på grund af dens forskellige roller som en agonist af SOD og i opstrøms regulering af ekspressionen og aktiviteten af ​​UPP [20] – [22]. EPA erstatter arachidonsyre i phospholipidmembraner når de indtages i store mængder [23], og er også blevet vist at inhibere 15-HETE-produktion fra arachidonsyre, som har været impliceret i UPP regulering i murine modeller af kakeksi [24], [25] . Nogle dyreforsøg EPA har været en succes, som har sin kombination med andre terapeutiske tilgange i mennesker, såsom leucin tilskud, højt proteinindhold kost og motion [26], [27].

Den nuværende undersøgelsen havde til formål at fastslå, om hæmning af xanthinoxidase ved oxypurinol haft en gavnlig virkning i behandlingen af ​​muskelsvind i kræft kakeksi. Endvidere forskerne forsøgt at fastslå, om EPA i kombination med oxypurinol var en effektiv multimodal behandling for muskelsvind i kræft kakeksi. Det blev en hypotese, at den hæmmende virkning af oxypurinol på XO kombineret med agonistisk effekt af EPA på SOD ville reducere forekomsten af ​​overskydende O

2

– · i kakektiske muskel, hvilket fører til en reduktion i oxidativt fornærmelse og deraf følgende skade eller spilder sammenlignet med kakektiske kontroller.

data præsenteret som gennemsnit ± SEM.

en væsentligt anderledes i forhold til kontrol,

b væsentligt anderledes i forhold til EPA,

c væsentligt anderledes i forhold til oxypurinol (P 0,05).

Resultater

Animal Model

Fire dyr fra kontrolgruppen og en hver fra oxypurinol og kombinationsbehandling grupper blev aflivet inden afslutningen af ​​forsøget på grund af etiske overvejelser, og blev ikke inkluderet i statistiske analyser.

Mus i kontrolgruppen viste tumor indtræden fra 6 ± 0,3 dage (figur 1), mens alder og vægt matchede EPA (10 ± 0,7 dage) og oxypurinol (9 ± 0,6 dage) behandlingsgrupper havde en signifikant forsinkelse i tumor indtræden ved sammenligning (P 0,001). EPA-gruppen også havde betydeligt forsinket indtræden i forhold til kombinationen gruppen (7 ± 0,7 dage, P 0,001). Den oxypurinol behandling forsinket tumor debut i forhold til kombinationen (P 0,01) gruppe. Der var ingen statistisk forskel i størrelsen af ​​den endelige tumor mellem EPA (338 ± 67 mm

3) og kontrol (308 ± 28 mm

3) grupper, mens oxypurinol (489 ± 78 mm

3) og kombinationen (515 ± 41 mm

3) behandlingsgrupper viste øget endelig tumorstørrelse sammenlignet med både kontrol (p 0,01) og EPA grupper (p 0,05).

Vægttab blev beregnet som en procentdel af oprindelige vægt, korrigeret for tumormasse (figur 2). Kontrolgruppen oplevet en betydelig vægttab i forhold til oprindelige vægt fra dag 12 og frem (P 0,05). EPA-gruppen steg i kropsvægt i før-kakektiske fase, før vægt stabilisering, og fastholdt denne pre-kakektiske tilstand indtil dag 22, hvor vægte begyndte at falde, med betydeligt vægttab fra dag 25. oxypurinol gruppen oplevede gradvist fald fra peak vægt fra dag 3, før et kraftigt fald i vægt på dag 13. Vægttab var signifikant i denne gruppe fra dag 14 og gradvist faldt til endpoint. Kombinationen gruppe genvundet fra et kraftigt fald i kropsvægt på dag 4, væsentlig forøgelse i kropsvægt fra indledende, og var stabile, før oplever signifikant vægttab fra dag 17 (ekskl dag 19; P 0,01). Kontrolgruppen havde gennemsnitlige vægtændring på -9,06% ved eutanasi, EPA-gruppen -4,91%, oxypurinol -9,11% og kombinationen gruppe -5,03%, Der var ingen signifikante forskelle i procentvise vægttab mellem grupper ved eutanasi. EPA-behandlingsgruppen viste vægttab signifikant lavere end kontrolgruppen (P 0,05) i en længere varighed (Days 3-15, 17-23, i alt 20 dage) sammenlignet med både oxypurinol (dag 3, 4, 7, 8, 10, alt 5 dage) og kombination (dage 6-12, 19, alt 8 dage) behandlingsgrupper. Mens der var en meget stærk sammenhæng mellem tumorstørrelse og vægttab i kontrolgruppen (r

2 = 0,94), mindre variation blev forklaret af sammenhængen mellem vægttab og tumorstørrelse i EPA (r

2 = 0,72), oxypurinol (r

2 = 0,72), og kombinationen (r

2 = 0,70) behandlingsgrupper.

i EPA behandlingsgruppen, quadriceps, soleus, TA og gastrocnemius muskler udgjorde en signifikant højere procentdel af den samlede kropsvægt end kontrolgruppen ved slutpunktet (p ≤ 0,05; figur 3). I oxypurinol behandlingsgruppen, TA og gastrocnemius var også en signifikant højere procentdel af total legemsvægt sammenlignet med kontrolgruppen ved slutpunktet (p ≤ 0,05). Vægte af soleus, TA og gastrocnemius var også højere end kontrolgruppen hos dyr udsat for kombinationsbehandlingen (p ≤ 0,05). Quadricep vægtøgning i EPA behandlingsgruppen sammenlignet med både oxypurinol og kombinationsbehandlinger, men TA og plantarus blev også faldet i forhold til oxypurinol og kombination grupper, henholdsvis.

Oxidative Stress

8-OH- dG-niveauer i musculus gastrocnemius fra kontrolgruppen var 12,9 ± 1,4 pg /ml. EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) og kombination (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupper havde signifikant højere niveauer end kontrolgruppen (p ≤ 0,05, figur 4), hvilket indikerer øget oxidativt stress i disse grupper. Den oxypurinol gruppe ikke vise signifikant højere 8-OH-dG-niveauer sammenlignet med kontrol (14,9 ± 1,5 pg /ml, P≤0.07).

Gene Expression

genekspression i musculus gastrocnemius er vist i tabel 1. den antioxidantbestanddelen GPx1 steg 3,1 gange i EPA-gruppen og 4,1 gange i oxypurinol gruppen sammenlignet med kontrol (P 0,01), som gjorde ekspressionen af ​​ubiquitin E3-ligaser MURF1 og MAFbx, 2,5 gange i EPA-gruppen, og 2,8 gange og 3,6 gange i oxypurinol gruppen henholdsvis (P 0,05). Oxypurinol også øget ekspression af antioxidant komponenter MnSOD 1,9 gange (P 0,05) og CAT med 2,4-fold (P 0,01) sammenlignet med kontrol, mens XDH steg 2,7 gange (P 0,01) og en 1,3 gange stigning i proteasom subunit UBB (P 0,05) blev observeret. Behandlingerne kombineret fald EcSOD udtryk 0,3 gange sammenlignet med kontrolværdier (P 0,05).

enzymassays

Aktivitet af total SOD signifikant øget i oxypurinol gruppen (32,2 ± 1,5 U /ml; figur 5) sammenlignet med kontrol (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), kombination (25,0 ± 3,4 U /ml, P 0,01) og EPA-grupper (28,3 ± 1,5 U /ml, P 0,05). Der var ingen ændring mellem andre grupper. Aktivitet af GPX blev reduceret betydeligt i EPA-gruppen (8,76 ± 2,0 U /ml) sammenlignet med både kontrolgruppen (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05) og kombinationsgrupperne (13,6 ± 2,0 U /ml, P 0,05) . Katalase-aktivitet blev reduceret i kombinationsgruppen (14,4 ± 2,8 U /ml) sammenlignet med både kontrolgruppen (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01) og oxypurinol grupper (24,3 ± 4,7 U /ml, P 0,05). Der var ingen væsentlige ændringer mellem grupper. Der var ingen signifikant forskel i XO aktivitet mellem grupper.

Diskussion

EPA er blevet almindeligt accepteret at have potentiale til at hjælpe i behandlingen af ​​cancer kakeksi, især som del af en kombineret fremgangsmåde til terapi [26], [27], men yderligere belysning af de nøjagtige mekanismer er påkrævet. I den aktuelle undersøgelse, havde dyr behandlet med EPA betydeligt forsinket tumorudvikling, og derfor forbedrede resultater, som kan have været på grund af EPA tidligere beskrevne antitumorvirkningen [28] i stedet for anti-kakektiske indsats alene. mens hæmmet tumorvækst delvist kan forklare dæmpning af vægttab, tidligere forskning viser dog, at den anti-kakektiske effekt af EPA er større end forventet i betragtning af størrelsen af ​​tumor reduktion [29], og synes at fremkalde en reaktion adskiller sig fra den anti-tumor effekt [30], støtter det synspunkt, at den øgede variation ses i EPA-gruppen i denne undersøgelse kan skyldes andre end hæmmet tumorvækst faktorer. Fremtidige undersøgelser vil drage fordel af de dyr, der aflives på vægt-tab eller tumor størrelse grænser, snarere end vilkårlige datoer, med henblik på at fastslå, om dyrene behandlet med EPA erfaring lignende vægttab med ubehandlede dyr med lignende tumor størrelse og masse, trods forsinket debut .

Langkædede n-3 PUFA, såsom EPA, er kendt for at blive kompromitteret af oxidativ stress, lipid hydroperoxidases og fedtsyreestere peroxyl radikaler, som igen kan beskadige lipidmembraner [31]. Inkorporeringen af ​​EPA i lipide membraner af celler i dyr, der tilskud [23] kan øge tilbøjeligheden af ​​disse membraner til oxidativ skade, herunder celle- og nukleare membraner, og yderligere udsætte celleindhold, herunder DNA, til den forøgede oxidative tilstand, og kan forklare den forøgede oxidative skader på DNA angivet med niveauerne af 8-OH-dG i EPA-gruppen. 8-OH-dG er fremherskende i den fri radikal-induceret oxidativ læsion, og anvendes almindeligvis som biomarkør for oxidativ stress [32]. 8-OH-dG produceres under oxidative skader på DNA, der skyldes interaktion mellem de hydroxylradikalscavengers og nukleotidbaser af DNA-strenge, og betragtes som en velkarakteriseret og følsom markør for sådanne skader [32].

EPA behandling forårsagede et fald i GPX aktivitet sammenlignet med kontrolgruppen ved slutpunktet. Dette fald i antioxidant kapacitet kan også være tegn på en formindsket krav om antioxidantvirkning, som følge af enten reduceret ROS tilstedeværelse eller forøget ROS scavenging af andre enzymer. Der var også nogen ændring i SOD eller katalaseaktivitet. Sammen indikerer dette, at EPA indsats er ikke som en agonist af antioxidant aktivitet som hypotese, og at ved slutpunktet, er potentialet for øget antioxidant handling angivet af stigningen i GPx1 genekspression bliver dæmpet i denne gruppe. Således trods ændringer i genekspression, som i fravær af sygdom kan have forårsaget øget aktivitet af antioxidant enzymer såsom GPX-, tilstedeværelsen af ​​kræft kakeksi forhindrede sådanne funktionelle ændringer opstår. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen, havde EPA-gruppen begyndt at falde i vægt, og det er derfor muligt, at en tidligere effekt af EPA på antioxidant funktion forårsagede den forsinkede indtræden af ​​vægttab; dog yderligere tid-kursus undersøgelser er at bekræfte denne hypotese. Faldet i kropsvægt i EPA-gruppen i slutningen af ​​undersøgelsen var tegn på kræft kakeksi er til stede.

En tidligere undersøgelse har vist, at inhibering af XO ved oxypurinol behandling reducerede tab af samlet legemsvægt og lean body masse, og reduceret produktion af ROS sammenlignet med kontroller [12]. den aktuelle undersøgelse tyder dog på, at oxypurinol behandling kan forårsage uønskede udfald i gnaver-modellen, især den hurtige nedgang i ydeevne angives ved vægttab ses tidligt i sygdommen. Opregulering af komponenter i UPP foreslår også en skift mod muskelsvind i denne gruppe. Faktisk oxypurinol, snarere end at nedsætte aktiviteten af ​​XO, forårsagede nogen samlet ændring sammenlignet med kontrolgruppen. Set i sammenhæng med den øgede genekspression af XDH, indikerer dette, at der kan være en hæmmende effekt, som bliver kompenseret ved øget produktion af XOR. Den oxypurinol behandlingsgruppe udviste også en tendens til forøget oxidativ skade sammenlignet med kontrol ( 0,07), hvilket indikerer at der kan være en forøget forekomst af ROS. Øget aktivitet af SOD i denne gruppe sammenlignet med kontrol viser øget scavenging af ROS, sandsynligvis som reaktion på denne stigning i oxidativ skade. Disse forskelle i respons kan skyldes en lav biotilgængelighed af oxypurinol i indgivelsesmåde anvendt i denne undersøgelse [13], og alternativ, højere potens præparater eller leveringsformer bør overvejes i fremtidige studier. Fremtidige undersøgelser rolle XOR og purin metabolisme i kakeksi kan også drage fordel af hæmning af denne vej på et punkt opstrøms XOR. Men på grund af forskelle mellem gnaver og primater metabolisme af puriner, er det vigtigt, at denne reaktionsvej undersøges fuldt ud i en model, der tillader kliniske paralleller, der kan drages.

Under studiet progression, kombinationsgruppen viste vægttab fase egenskaber svarende til både EPA og oxypurinol grupper. For eksempel er den oprindelige vægt forøgelse og stabilisering afspejler EPA-gruppen, det bratte fald på 12 dage spejle den for oxypurinol gruppe på 14 dage. Mængden af ​​vægt tabt ved kombinationen gruppe er, for det meste, ikke så ekstreme som oxypurinol gruppe, men vægten er ikke så godt bevaret som EPA-gruppen. Disse vægttab mønstre er også forskellige fra kontrolgruppen, hvilket indikerer, at det er kombinationen af ​​de to grupper, snarere end en mangel på virkning, forårsager dette mønster forringelsen. En vekselvirkning mellem de to behandlinger er yderligere understøttet af genekspression og enzym aktivitetsdata, hvor effekten i kombinationen gruppen er signifikant forskellig fra effekten af ​​enten alene behandling.

I betragtning af de betydelige ændringer i mange parametre oplevet i kombinationsbehandlingen gruppen sammenlignet med hver komponent isoleret, er det muligt, at de pathways ændret af EPA og oxypurinol er forbundet. Skønt EPA er tidligere blevet vist at undertrykke urat krystal-induceret inflammation i Sprague-Dawley-rotter [33], dette er ikke tidligere blevet vist i en model for kakeksi. Yderligere forskning er nødvendig, men skæringspunktet for disse to veje på arachidonsyre er den mest sandsynlige punkt for interaktion [14], [23], [24]. Den kombinerede inhibering af UPP af EPA og oxypurinol understøttes af reduktionen i genekspression af UBB, MURF1, og MAFbx i denne undersøgelse (se tabel 1). Hæmmet handling af vejen opstrøms for NADPH-oxidase af EPA og oxypurinol understøttes yderligere af tendensen i retning af en formindskelse i ekspression af NOX2 i kombinationen behandlingsgruppen sammenlignet med kontrol (P 0,06), og den nedsat ekspression af NOX2 i kombinationsgruppen sammenlignet med EPA gruppe angiver, at forbindelsen virkning af kombinationsterapien er stigende inhibering af denne vej, sandsynligvis via den tidligere foreslåede mekanisme. Et fald i purin og dermed forbundne metabolisme krav, udløst af feedback inhibering af amidophosphoribosyl transferase [13], kan foranledige en reduktion af XDH ekspression ses i kombinationen gruppen. De betydelige ændringer, der ses i kombinationen gruppe kan også være forårsaget af forøget optagelse af oxypurinol skyldes ændret permeabilitet af cellemembraner forårsaget af EPA tilskud, og kan være årsag til den tilsyneladende interaktion. Altered fluiditet og phospholipid sammensætning af cellemembraner er blevet observeret efter n-3 PUFA tilskud [34], ændre optagelsen af ​​hydrofobe stoffer. På grund af den relativt høje lipid opløselighed oxypurinol [13], vil denne ændring tillade stoffet at passere nemt via passiv diffusion.

Konklusion

EPA fortsætter med at vise lovende som en del af en multimodal behandling for kakeksi, med en positiv ændring i retning vedligeholdelse af lean muskelmasse, og forsinket indtræden af ​​vægttab hos dyr, der gennemgår EPA behandling i forhold til dem, der modtager andre behandlinger. Mekanismer for beskyttelse ikke længere var aktive ved end-point studeret, derfor tid-retters undersøgelser er at bestemme de ansvarlige for de beskyttende virkninger observeret. Oxypurinol synes at forårsage en øget hyppighed af vægt nedgang i mus med kræft kakeksi forhold til alle andre behandlingsgrupper. Dette indikerer, at XO kan spille en beskyttende rolle under udviklingen af ​​kræft kakeksi, og dets hæmning er til skade for resultater. bevarelse af masse i visse muskler indebærer imidlertid, at oxypurinol kan være gavnlig til at opretholde muskelmasse. De øgede effekter i kombination gruppen i forhold til EPA eller oxypurinol behandlinger antyder et skæringspunkt for de to mekanistiske veje, eller at der i en øget optagelse af oxypurinol i overværelse af EPA tilskud, der forårsager den tilsyneladende interaktion. Yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at belyse den interaktive effekt af oxypurinol og EPA, og den rolle, XO i kræft kakeksi.

Materialer og metoder

Cell Culture

murine adenocarcinom 16 (MAC16) cellelinie blev dyrket i RPMI med 10% FBS og 0,5% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Mulgrave, Australien). Cellerne blev dyrket til 80% konfluens, centrifugeret ved 500

g

i 5 minutter ved 4 ° C, og isoleres fra vækstmedierne. Cellerne blev derefter resuspenderet i sterilt PBS, og trukket ind i en 25-gauge kanyle til injektion.

Animal Model

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Welfare udvalg, på Deakin University (godkendelsesnummer A13 /2010). Balb /c

Nu Nu

mus alderen 8 uger (Animal Resource Center, Canning Vale, Australien) blev anbragt i grupper på 5, med fri adgang til standard chow og vand gennem hele undersøgelsen, vejet ugentligt for at bestemme forbruget . Omgivelsestemperatur blev reguleret til 22 ° C ± 2 ° C, ved 40-60% fugtighed, med en 12-timers lys /mørke-cyklus. Mus blev injiceret med tidligere fremstillede celler, derefter randomiseret i 4 grupper, der består af EPA behandling (EPAX, Aalesund, Norge, 0,4 g /kg /dag, n = 9 [EPA]), oxypurinol behandling (Sigma-Aldritch, Castle-Hill , Australien; 1 mmol /l i drikkevand, n = 9), kombinationsbehandling (som pr EPA og oxypurinol grupper n = 9), eller canceren cachexia kontrolgruppen (n = 13). Dyr blev monitoreret dagligt for ændringer i kropsvægt og tumorstørrelser målt ved anvendelse skydelære. Musene blev opsagt af natrium pentobarbital injektion (30 mg /kg) (Virbac Animal Health, Regents Park, Australien) på 29 dage, når vægttabet nåede 25%, eller tumor størrelse nåede 1000 mm

3, alt efter hvad skete først. Muskelvæv, herunder gastrocnemius, soleus, plantarus, tibialis anterior (TA), og quadriceps, blev fjernet og vejet. Alle prøver blev hurtigt nedfrosset og opbevaret ved -80

oC til yderligere analyse.

Oxidative Stress

En ELISA-kit blev anvendt til at måle DNA oxidation biprodukt 8-hydroxy-2-deoxy guanosin (8-OH-2DG) (StressMarq Biosciences, Victoria, Canada) som en markør for oxidativ stress [32]. DNA blev ekstraheret fra 10 mg musculus gastrocnemius anvendelse af et DNA isolation kit (Promega, Sydney, Australien). Hver prøve blev derefter fortyndet således at 50 pg DNA blev anvendt i 8-OH-2DG assay. Den konkurrerende immunoassay involverer bindingen af ​​fri 8-OH-2DG til et antistof overtrukket plade med 96 brønde. assay og prøve koncentration på 8-OH-2DG den blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger.

Gene Expression

Totalt RNA blev ekstraheret fra 10 mg frosset musculus gastrocnemius hjælp TRI-reagens (Astral videnskabelige, Sydney, Australien) ifølge producentens specifikationer. Den totale RNA-koncentrationen blev bestemt ved A260 /A280 måling. Et mikrogram af total RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV-revers transkriptase første streng cDNA syntese kit ifølge producentens protokol (Marligen Biosciences, Sydney, Australien). Real-Time PCR blev udført under anvendelse af en Bio-Rad IQ5 detection system, med reaktioner udført under anvendelse af SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Sydney, Australien). Primere blev konstrueret under anvendelse af primer 3 og opnået fra Geneworks (Hindmarsh, Australien, se tabel 2). Amplifikation af cDNA prøver blev udført ved anvendelse IQ SYBR green ™ ifølge producentens protokoller (BioRad, Sydney, Australien) Fluorescerende emissionsdata blev fanget og mRNA-niveauer blev analyseret ved anvendelse af den kritiske tærskelværdi (CT) værdi [35]. Termisk cykling og fluorescens detektion blev udført under anvendelse af BioRad IQ5 Sequence Detection System (BioRad, Sydney, Australien). Prøverne blev normaliseret til cDNA koncentration bestemt med OliGreen (Invitrogen, Mulgrave, Australien) [36]

Protein Enzymaktivitet Analyse Salg

musculus gastrocnemius vævsprøver (20 mg) blev homogeniseret og centrifugeret ved 10.000

g

ved 4 ° C i 10 minutter. Proteinkoncentrationen blev bestemt via Bradford-metoden (BioRad, Sydney, Australien). Samlet SOD, glutathionperoxidase (GPX), blev katalase, og XO aktivitet målt med kommercielle enzym assay kits som pr producentens anvisninger (Sapphire Bioscience, Waterloo, Australien, Invitrogen, Mulgrave, Australien).

Statistik

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse SPSS Statistics Version 17.0 (IBM, Chicago, USA) eller GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA), med resultaterne udtrykt som middel ± standardfejl på middelværdien (SEM) og betragtes statistisk signifikant hvis P 0,05, medmindre andet er angivet. Dataene blev analyseret ved anvendelse tovejs ANOVA, med en Tukey test post hoc-analyse udført for at bestemme forskelle mellem grupper, hvor det er relevant. Korrelation blev analyseret ved hjælp af Pearsons Test Vægttab data blev analyseret ved hjælp Gentagne foranstaltninger ANOVA med Bonferroni post-hoc analyse.