PLoS ONE: Kombinationsbehandling af VEGF-Trap og gemcitabin resulterer i forbedret anti-tumor effekt i en mus lungekræft Model

Abstrakt

Baggrund

Angiogenese er afgørende for vækst og metastase af kræft. Selvom antiangiogene midler, især vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) -inhibitorer, har udvist single-agent-aktivitet, er der stor interesse for at kombinere disse nye lægemidler med konventionelle kemoterapi reagenser at opnå en optimal klinisk virkning. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere fordelene ved kombinationsbehandling af vaskulær endotel vækstfaktor fælde (VEGF-Trap) med gemcitabin i en lunge tumor model.

Metoder

En luciferase-udtrykkende Lewis-lungecarcinom (LLC) model blev etableret i C57BL /6J-mus og tumorbærende mus blev randomiseret i kontrol, VEGF-Trap, gemcitabin og VEGF-Trap /gemcitabin kombinationsgrupperne. Tumorvækst og dyrs overlevelse blev overvåget. Tumor mikrokar densitet og celleproliferation blev vurderet ved CD31 og Ki-67 immunhistokemisk analyse. TUNEL-assayet blev udført til påvisning af apoptotiske celler. Protein- niveauerne af cyclin D1, Pro-caspase-3, Bcl-2, blev MMP2 og MMP9 i tumorekstrakter undersøgt ved western blot.

Resultater Salg

VEGF-Trap i kombination med gemcitabin viste signifikant forøget inhibering af tumorvækst og langvarig mus overlevelse sammenlignet med VEGF-Trap eller gemcitabin monoterapi. Den VEGF-Trap /gemcitabin kombinationsbehandling ikke kun potent hæmmede tumor angiogenese og celledeling, men også øget cellulær apoptose inden tumorvæv. Desuden kombinationsbehandlingen markant nedreguleret ekspression af proliferation, anti-apoptose og invasion relaterede proteiner.

Konklusion

kombinationsterapi ved anvendelse VEGF-Trap og gemcitabin resulterede i forbedret anti-tumor effekt i en lungekræft model og VEGF-Trap /gemcitabin kombination kan udgøre en lovende strategi i behandlingen af ​​menneskelig lungekræft

Henvisning:. Zhou S, Yang Y, Yang Y, Tao H, Li D, Zhang J et al. (2013) Kombinationsbehandling af VEGF-Trap og gemcitabin resulterer i forbedret anti-tumor effekt i en mus lungekræft Model. PLoS ONE 8 (7): e68589. doi: 10,1371 /journal.pone.0068589

Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA

Modtaget: 15. marts 2013; Accepteret: 6 Juni 2013; Udgivet: 9 jul 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Shanghai “Videnskab og Teknologi Innovation Action Plan” forsøgsdyr forskningsprojekt (nr 10140900400), National Natural Science Foundation of China (nr 31.000.527), Shanghai Health Bureau forskningsfonden for unge investigator (til Dr. Shuang Zhou) og Hong Kong Scholar program (nr XJ2011025). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Junli Zhang er ansat af Yantai Rongchang Biotechnologies, Ltd Eli Lilly and Company Shanghai forudsat gemcitabin (Gemzar) til denne undersøgelse. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Angiogenese er processen med nye blodkar dannelse fra eksisterende kar. Det er en vigtig proces i udviklingen af ​​ondartede tumorer som neoplastiske læsioner nødt til at etablere deres egen blodforsyning at vokse ud over 1-2 mm i diameter [1]. Den fremherskende regulator af tumorangiogenese er vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [2], [3], hvilket er nøglen angiogen faktor kendt for at være til stede i hele tumoren livscyklus [4]. Sin kontinuerlige ekspression, sammen med den genetiske stabilitet af VEGF-receptorer i endotelceller, gør direkte og konstant undertrykkelse af VEGF signalere en vigtig anti-tumor-strategi [3], [4]. Med rollen af ​​angiogenese i tumorvækst og progression fast etableret, har anti-angiogene agenter fået megen stor opmærksomhed, men kliniske strategier for deres optimale anvendelse er stadig under udvikling [5].

Den anti-angiogene middel vaskulær endotel vækstfaktor fælde (VEGF-Trap eller aflibercept) er en manipuleret kimært protein indeholdende det ekstracellulære domæne 2 af VEGF-receptor-1 (VEGFR-1, Flt-1) og ekstracellulære domæne 3 af VEGFR-2 (KDR) fusioneret til Fc-delen af humant immunoglobulin G1. VEGF-Trap potent blokerer alle VEGF-A isoformer og PIGF af både mennesker og mus oprindelse [6]. VEGF-Trap udøver sine antiangiogene virkninger gennem regression af tumorvaskulatur [7], [8], normalisering af overlevende vaskulatur, og inhibering af ny tumor fartøj spiring [9], [10]. Disse lovende resultater førte til udviklingen af ​​dette middel i kliniske studier [11], og det er for nylig blevet godkendt af US FDA for tarmkræft [12]. Det er imidlertid usandsynligt, at antiangiogene terapier er helbredende på egen hånd, fordi antiangiogene midler selv ikke kan dræbe tumorceller direkte. Snarere kan deres største potentiale, når det anvendes sammen med konventionelle anti-cancer-terapier, for eksempel, kemoterapi [13], [14]. Anti-angiogenese-induceret normalisering af tumorvaskulatur kan forbedre tumor perfusion og føre til øget kemoterapi levering [15] – [18]

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan.. Gemcitabin er et deoxycytidin analog, har vist effekt som en behandling for mange faste tumorer. Gemcitabin har været almindeligt ordineret til behandling af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [19], [20], er imidlertid dens fordele begrænset på grund af en lav svarprocent eller erhvervet tumor modstand.

i den foreliggende undersøgelse, vi har forsøgt at evaluere effekten af ​​kombinationsbehandling ved anvendelse VEGF-Trap og gemcitabin i en mus LLC lungekræft model, og at undersøge den mulige mekanisme er ansvarlig for den øgede anti-tumor effekt.

Materialer og metoder

mus og reagenser

C57BL /6J hunmus blev købt fra Chinese Academy of Science og huse på Animal Maintenance Facility af Tongji Universitet i mindst 1 uge før brug. Protokollerne blev godkendt af Det Dyreetiske udvalg Tongji Universitet. Alle dyreforsøg blev udført under specifikke patogenfrie forhold i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. VEGF-Trap blev konstrueret ifølge Holash og medarbejdere [8], og udtrykt i kinesisk hamsterovarie (CHO) celler efter stabil transfektion. Det rekombinante VEGF-Trap blev oprenset ved protein-A affinitet og ionbytningskromatografi og rekonstitueret i sterilt PBS. Kvaliteten af ​​VEGF-Trap blev bestemt ved reducerende SDS-PAGE. Bindingsaktiviteten af ​​rekombinant VEGF-Trap til muse VEGF blev bekræftet ved en ELISA-basen direkte bindingsassay. Proteinet blev opbevaret ved -20 ° C indtil dens anvendelse til subkutan (sc) indgivelse ved 1 g /kg. Gemcitabin (Gemzar) blev venligt leveret af Eli Lilly (Indianapolis, Ind., USA) og opbevaret ved 4 ° C. Ifølge de tidligere undersøgelser [21], blev gemcitabin opløses i sterilt PBS til intraperitoneal (ip) injektion i en dosis på 60 mg /kg.

Konstruktion af luciferase-udtrykkende tumorcellelinje

LLC muse lungeadenocarcinom celler (CRL-1642) var fra American Type Culture Collection (ATCC), som blev opformeret i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (GIBCO-BRL), 1 uM natriumpyruvat, 2 mM glutamin og 100 mg /l penicillin, og holdt ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 i luft. Luciferase genet blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) fra et cDNA-skabelon under anvendelse af en forward primer: 5′-CAC CGA CTC TAG AGC CGC CAC CAT GGA AGA TGC CAA AAA C og en revers primer: 5′-CGG CAA GAT CGC CGT GTA ATA ACG GTC CGT CGA CAA TCA AC, flankeret med X-bal og Sall restriktionssite. PCR’er blev udført med 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 45 sekunder og ekstension ved 72 ° C i 60 sekunder. PCR-fragmentet blev fordøjet med X-bal og Sall og indsat i pRRL-CMV Lenti-viral plasmid ved X-Bal I og Sal I-stedet. Lenti-luciferase (Lenti-Luc) viral vektor blev pakket i 293T-celler ved transfektion af Lenti-Luc og emballering plasmider (Invitrogen). Efter 48 timer efter transfektion blev supernatanterne indeholdende Lenti-Luc virus høstet. For Lenti-Luc viral transduktion, blev LLC-celler podet i en 6-brønds plade og Lenti-virus-holdige supernatanter blev tilsat til mediet (supernatanter: frisk medium = 01:01, ca. 1 × 10

8 viruspartikler /ml) i nærværelse af polybren (8 ug /ml). En stabil luciferase-udtrykkende klon blev valgt af begrænset fortynding for at skabe en Luc-LLC-cellelinje. Luciferaseaktivitet i Luc-LLC-celler blev bestemt ved luciferase assay under anvendelse af en luciferase påvisning kit (Beyotime) og bioluminescerende billeddannelse (Berthold). Yderligere sammenligninger af cellevækst, migrering og tumor dannende evne LLC og Luc-LLC-celler blev udført ved MTT-assay, sårheling og subkutan tumormodel vurdering henholdsvis.

Animal Tumor Model og behandlingsgrupper

for at inokulere tumorer, 2 × 10

6 Luc-LLC-celler blev resuspenderet i 200 pi serumfrit DMEM medium og subkutant injiceret i den højre flanke af 6 til 8 uger gamle C57BL /6J-mus. En uge efter Luc-LLC podning blev tumorbærende mus tilfældigt opdelt i følgende grupper (n = 8 pr gruppe) baseret på bioluminescens måles efter første billeddannelse og tumorer volumen nåede ca. 100 mm

3: (a) ubehandlet kontrol (200 pi PBS tre gange ugentligt ved intraperitoneal injektion); (B) VEGF-Trap alene (1 g /kg tre gange ugentligt ved subkutan injektion); (C) Gemcitabin alene (60 mg /kg tre gange ugentligt ved intraperitoneal injektion); (D) VEGF-Trap /Gemcitabin kombination (VEGF-Trap 1g /kg tre gange ugentligt ved subkutan injektion, og gemcitabin 60 mg /kg tre gange ugentligt ved intraperitoneal injektion). Behandlingen blev fortsat i 2 uger. Tumorstørrelse blev overvåget hver anden dag i 15 dage med en skydelære efter behandlingsstart. Tumorvolumener blev bestemt ved hjælp af formlen: Mange (mm

3) =

en

×

b

2 × 0,5, hvor

en

er den lange diameter og

b

er den korte diameter som tidligere beskrevet [22]. Alle data er repræsenteret som middelværdi ± SE. Musene blev underkastet billeddannelse på dag 12 efter påbegyndelse af behandlingen. På dag 15 efter behandlingsstart blev mus i alle grupper ofret. Tumorer blev vejet og fotos blev taget efter dissektion. Halvdelen af ​​tumorvævet blev fikseret i periodat-lysin-paraformaldehyd (PLP) og O.C.T (Sakura Finetek) indlejret for immunhistokemi. Den anden halvdel var snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Overlevelseskurve Analysen blev udført i en uafhængig behandlingsgruppe. Mus død blev bestemt ved hjælp af en forudbestemt kriterium.

Bioluminescens Imaging

in vivo

bioluminescens billeddannelse blev udført ved hjælp af et dyr billeddannende system (Nightowl LB 983 Molekylær Imaging System , Berthold). Musene blev injiceret med en intraperitoneal injektion af 150 mg /kg D-luciferin kaliumsalt (Caliper Life Sciences) i 200 pi DPBS. Efter 5 minutters luciferin injektion blev musene bedøvet via intraperitoneal injektion af pentobarbital (50 mg /kg). Hver mus blev placeret i en venstre lateral decubitus position og et digitalt gråtoner dyr billede blev taget, efterfulgt af køb og overlejring af et pseudo-billede, som repræsenterer den rumlige fordeling af detekterede fotoner nye fra aktiv luciferase inden dyret. Eksponeringstiden varierede fra 10 til 30 sekunder, afhængig af intensiteten af ​​bioluminescens emission fra tumorcellerne. Fotoner udsendt fra specifikke regioner blev kvantificeret under anvendelse af en Indigo software (Berthold). Regioner af interesse (ROI), er opstillet rundt om tumor sites og kvantificeres som fotontællinger per sekund.

Immunhistokemi

tumorvæv blev fikseret i PLP, indlejret i OLT og skæres i 10 um sektioner . Derefter blev snittene farvet med specifikke antistoffer til analyse.

I mikrokardensitet densitetsanalyse, tumor snit blev farvet med et rotte-anti-muse CD31-antistof (BD Pharmingen) efterfulgt af FITC-konjugeret kanin anti-rotte IgG (Invitrogen ). Cellulære kerner blev modfarvet med DAPI (Sigma-Aldrich). Kvantificeringen af ​​mikrokardannelse densitet (MVD) blev vurderet ifølge fremgangsmåden af ​​Weidner et al. [23]. Kort fortalt blev snittene først screenet ved lave forstørrelser (× 40 og x 100) for at identificere den mest vaskulære område af tumoren (hot spot). Inden for det hot spot område, blev den farvede mikrokar tælles i en enkelt høj-effekt (× 400) felt. MVD blev udtrykt som antallet af mikrokardannelse /felt. Eventuelle CD31-farvede endotelceller eller endotele celleklynger, der var klart adskilt fra tilstødende mikrokar, tumorceller eller bindevævselementer blev betragtet som en enkelt tællelig mikrokar.

Immunohistokemisk analyse af celleproliferation blev udført på de frosne tumorsnit med en rotte-anti-muse Ki-67-antistof (Biolegend) efterfulgt af FITC-konjugeret kanin anti-rotte IgG (Invitrogen). Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​Ki-67 positive celler ± SEM pr × 400 forstørrelse. I alt ti × 400 felter blev undersøgt og talt fra tre tumorer i hver af behandlingsgrupperne. Ki-67 spredning indeks blev beregnet efter følgende formel: antallet af Ki-67 positive celler /den totale celletal × 100%

TUNEL Assay

In situ.

påvisning af apoptotiske celler i tumorvæv blev udført ved den terminale deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) -teknik under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt apoptose afsløring kit (Beyotime) ved at følge fabrikantens protokol. TUNEL-positive celler fra 10 uafhængige felter blev kvantificeret manuelt. Den apoptose-indekset blev beregnet efter følgende formel:. Antallet af apoptotiske celler /totale antal celler med kerne × 100%

Western blot analyse

tumorvæv på dag 15 efter behandlingsstart var homogeniseret med lysepuffer (RIPA) (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 1 mM PMSF, 10 mg /ml aprotinin , 10 mg /ml leupeptin) på is. Efter centrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter blev supernatanter opsamlet og totale protein- koncentrationer blev bestemt ved BCA-assay (Pierce). Ens mængder af denaturerede proteiner blev påsat 10% SDS-PAGE-gel og overført på PVDF-membran (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i TBST (1 × TBS indeholdende 0,1% Tween 20) og derefter inkuberet med anti-muse primære antistoffer til CyclinD1, Pro-caspase-3, Bcl-2, MMP2 og MMP9 (alle fra Santa Cruz Biotechnology) natten over ved 4 ° C. Efter vask med TBST tre gange, blev HRP-konjugerede sekundære antistoffer bundet og udført med kemiluminescens under anvendelse SuperSignal West Pico-substrat (Pierce). Band intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af Band Leader software.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en-vejs ANOVA eller Students

t

test, som er relevant.

*

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og

**

P

. 0,01 ville være yderst statistisk signifikant

Resultater

Etablering af LLC tumor Model med Stable luciferase Expression

for bedre skærm tumorvækst og metastase

in vivo

, vi konstrueret LLC cellelinjer med stabil luciferaseekspression og subkutant podet Luc-LLC celler i C57BL /6J-mus. Tumorer blev målt og afbildet på dag 7, 14 og 21 efter podning med tumoren. Som vist i figur 1A og B, blev Luc-LLC tumorvækst visualiseret med bioluminescens billeddannelse og fotoner udsendt fra specifikke regioner blev kvantificeret under anvendelse af en Indigo software, hvilket var i overensstemmelse med tumorvækst kurve (figur 1C). Ingen forskel blev set mellem Luc-LLC og patent LLC-celler i cellemorfologi, migration og vækst

in vitro

samt tumoren dannende evne

in vivo

(figur S2). Forskellige behandlingsplaner var repræsenteret i figur 1D

(A) bioluminescens billeder af LLC tumorer på dag 7, 14 og 21 efter Luc-LLC subkutan podning (n = 6).; (B) Målinger af fotoner per sekund skildrer tumor mængder af mus ved hjælp af IndiGo billedbehandling analyse software,

*

P

0,05,

**

P

0.01

vs

dag 7; (C) Tumor vækstkurve fra dag 5 til 25 efter Luc-LLC subkutan podning (n = 6),

*

P

0,05,

**

P

0,01

vs

dag 5; (D) Skematisk repræsentation af eksperimentet beskrevet i materialer og fremgangsmåder protokol blev dyr inddelt i fire grupper: (a) Kontrollen; (B) VEGF-Trap alene; (C) Gemcitabin alene; (D) Kombination af VEGF-Trap og Gemcitabin.

Effekter af VEGF-Trap i kombination med gemcitabin på LLC tumorer

For at undersøge de terapeutiske virkninger af kombinationsbehandling af VEGF-Trap og gemcitabin på væksten af ​​LLC tumorer, C57BL /6 mus, der bærer LLC tumorer blev inddelt i fire behandlingsgrupper som beskrevet ovenfor. VEGF-Trap blev fremstillet som beskrevet i Materialer og Metoder. Det oprensede VEGF-Trap viste som et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 50 kD (fig S1a) og udviste en potent bindingsaktivitet til muse VEGF som bestemt ved en direkte bindingsassay (figur S1B). Når mængden af ​​tumorerne nåede omkring 100 mm

3, blev behandlingen påbegyndes. På dag 6 efter første behandling, VEGF-Trap og gemcitabin kombinationsterapi viste signifikante inhibitoriske virkninger på tumorvækst i sammenligning med kontrolgruppen. Selvom VEGF-Trap eller gemcitabin alene også signifikant hæmmede tumorvækst, kombinationsbehandlingen resulterede i en mere robust hæmning på tumor udvikling og havde den mest betydelige forsinkelse i tumorvækst, bestemt ved tumor volumen på dag 9, 12 og 15 efter indledende behandling ( Figur 2C,

P

0,01, sammenlignet med kontrolgruppen). Bioluminescens imaging analyse af LLC tumorer på dag 12 efter starten af ​​behandlingen bekræftede antitumorvirkningen (figur 2A og B). Signifikante forskelle i tumor størrelser og vægt blev set på dag 15, når behandlingen blev stoppet og tumorer blev dissekeret (figur 2D og E). Ingen statistisk signifikant forskel i tumorstørrelse blev fundet mellem VEGF-Trap og gemcitabin monoterapi grupper. Kombinationen terapi af VEGF-Trap og gemcitabin forøget anti-tumor effekt i LLC tumor model. Tilsvarende blev den forøgede inhibering af tumorvækst i kombinationsterapien oversat til langvarig dyr overlevelse ifølge Kaplan-Meier analyse og de mus, der modtog kombinationsterapien forblev på et 100% overlevelsesrate ved udgangen af ​​observationsperioden (fig 2F) .

(A) bioluminescens billeder af subkutane podede LLC tumorer på dag 12 efter starten af ​​behandlingen; (B) Imaging analyse (fotoner per sekund) afbilder tumorvolumener hos mus ved hjælp Indigo imaging analyse software; (C) Tumorvolumen beregnes på dag 3, 6, 9, 12,15 efter starten af ​​behandlingen; (D) Repræsentative tumor billeder på dag 15 efter starten af ​​behandlingen; (E) Tumorvægte blev målt på dag 15, når tumorer blev høstet; (F) Overlevelseskurver blev konstrueret ifølge Kaplan-Meier-analyse. n = 8 for hver gruppe, *

P

0,05, **

P

. 0,01

vs

kontrolgruppen

Hæmning af tumorangiogenese og Cell Proliferation

LLC tumorer fra alle behandlingsgrupper blev høstet på dag 15 efter behandlingens start og var forberedt på immunehistochemistry undersøgelser som beskrevet i materialer og metoder. Angiogenese i tumorvæv blev vurderet ved at tælle mikrokar densitet efter immunhistokemisk farvning for CD31. Behandling med VEGF-Trap eller kombinationsbehandlingen medførte en indlysende inhibering af angiogenese i tumorer sammenlignet med kontrolgruppen. De gennemsnitlige fartøj tællinger pr high-power field i VEGF-Trap eller en kombination gruppen var signifikant lavere (

P

0,01) end i kontrolgruppen (figur 3A og B). Selv om der var en statistisk signifikans i mikrokardensitet tæthed, vi bemærkede også, at gemcitabin behandlede tumorer viste en stærkere CD31-positive område end tumorer i kombinationsbehandling gruppen.

(A) Repræsentative billeder af CD31-positive mikrokar område og Ki67-positive celler i de levedygtige LLC tumorvæv på dag 15 efter behandlingsstart blev estimeret ved immunhistokemisk farvning; (B) og (C) mikrokar tæthed og procentdelen af ​​Ki67-positive celler blev bestemt ved at tælle antallet af positiv farvning pr høj effekt felt i afsnittet, som beskrevet i “Materialer og metoder”. *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolgruppen. Scale bar, 50 um.

For at undersøge celleproliferation i tumorvæv efter behandling blev frosne tumorsnit farvet med Ki-67-antistof og Ki-67 proliferation index blev beregnet på grundlag af immunhistokemisk analyse. Ki-67 proliferationsindeks viste en 8 gange formindskelse i VEGF-Trap og gemcitabin kombination gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (figur 3A og C), hvilket antyder en signifikant undertrykkelse af tumorcelleproliferation i behandlingsgrupperne.

Stigning i tumor Cell apoptose

for yderligere at undersøge den mekanisme af de kombinerede effekter af VEGF-Trap og gemcitabin på LLC tumorer blev et TUNEL assay udføres for at studere tumor celle apoptose. Som vist i figur 4A og B, TUNEL-assayet viste en markant stigning i apoptose i tumorvæv fra kombinationsbehandling (

P

0,01)., Sammenlignet med de andre grupper

(A) Cell apoptose blev vurderet ved TUNEL-farvning, de repræsentative dele af LLC tumorvæv blev opnået fra mus på dag 15 efter behandlingsstart; (B) Den apoptotiske indeks blev bestemt som beskrevet i “Materialer og metoder”. *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolgruppen. Scale bar, 50 um.

Nedregulering Angivelse af spredning, Anti-apoptose og Invasion Related Proteiner

Efter at have konstateret ændringer i mikrokardensitet tæthed, celledeling og apoptose indeks i respons til VEGF-Trap og gemcitabin kombinationsbehandling, vi næste forsøgt at undersøge den mulige mekanisme af de kombinerede effekter observeret i tumor model

in vivo

ved at vurdere ekspression af celleproliferation (cyclin D1), anti-apoptose ( pro-caspase-3, Bcl-2), invasion (MMP2, MMP9) beslægtede proteiner ved anvendelse western blot. I uddrag LLC tumorer på dag 15 efter behandlingens start, cyclin D1, Pro-Caspase, Bcl-2, MMP2 og MMP9 udtryk blev nedreguleret i VEGF-Trap og gemcitabin kombination gruppe sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,01). Western blot resultater bekræftede, at VEGF-Trap eller gemcitabin monoterapi kunne nedregulere ekspressionen af ​​alle disse proteiner, men kombinationsterapi yderligere forbedret disse virkninger (figur 5A og B). Disse data var i overensstemmelse med resultaterne fra immunhistokemisk analyse og TUNEL-assay (figur 3, figur 4).

(A) Western blot-analyse viste, at VEGF-Trap kombineret med gemcitabin inhiberede ekspression af cyclin D1, Pro- caspase-3, Bcl-2, MMP2 og MMP9 i LLC tumorer; (B) Kvantificering af proteinniveauer. p-actin tjente som en intern kontrol. Densitometer kvantificering var i forhold til det første datasæt i hvert tilfælde (angivet med en værdi på 1). Alle data er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

. 0,01

vs

kontrolgruppen

Diskussion

Angiogenese er en tæt reguleret proces, der involverer en dynamisk balance mellem stimulerende og hæmmende signaler. Angiogenese opstår, når balancen mellem angiogene stimulatorer og inhibitorer er tilhænger af stimulatorer [24]. Blokaden af ​​nøglen angiogene stimulator, VEGF, er et effektivt middel til at hæmme angiogenese i dyretumormodeller [25], [26]. Imidlertid har anti-VEGF monoterapi begrænsede kliniske fordele for kræftpatienter og i høj dosering kan ofte føre til forskellige bivirkninger, såsom hypertension, proteinuri, tromboser, og GIP [27], [28]. Derfor kræves yderligere forskning for at maksimere anti-tumor effekt og samtidig minimere antallet af bivirkninger fra antiangiogen terapi.

Stigende beviser har antydet, at kombinationen af ​​angiogenese-hæmmere med kemoterapi produceret bedre terapeutiske resultater i behandling af cancer [29] – [35]. Et klinisk fase III-forsøg har vist, at en kombination af anti-VEGF monoklonalt antistof bevacizumab med carboplatin-paclitaxel signifikant forbedret samlet overlevelse (OS) i patienter med lungecancer i forhold til kemoterapi alene [36]. Således er det klinisk relevant at udforske flere kombinationer mellem antiangiogene midler og kemo regimer for flere terapeutiske muligheder.

I betragtning af den omfattende brug af gemcitabin til behandling af NSCLC, er det vigtigt at afgøre, om kombinationen af et anti-angiogent middel med gemcitabin kan producere en klinisk fordel. For nylig, en fase III studie (Benytte forsøg), der sammenlignet bevacizumab plus cisplatin-gemcitabin at chemocherapy (cisplatin-gemcitabin) viste en forbedret udvikling overlevelse, men ikke samlet overlevelse [37]. Det er fortsat en udfordring at udvide den samlede patient overlevelse på toppen af ​​gemcitabin behandling.

VEGF-Trap er en kimære VEGF-lokkedue receptor-Fc-fusionsprotein og er for nylig blevet godkendt af US FDA til metastatisk kolorektal cancer [12]. Sammenlignet med bevacizumab, VEGF-Trap er en mere potent angiogeneseinhibitor grundet dens højere affinitet til VEGF. Desuden kan VEGF-Trap også blokere PIGF som også er et pro-angiogen faktor. Det ville således være interessant at vurdere, om kombinationen af ​​VEGF-Trap og gemcitabin kan resultere i en mere effektiv behandling af lungekræft.

I den foreliggende undersøgelse har vi den hypotese, at en kombinationsterapi bestående af VEGF-Trap og gemcitabin kunne opnå forbedrede antitumorvirkninger. For at teste denne hypotese undersøgte vi de terapeutiske virkninger af denne kombinationsterapi i en LLC lungekræft model. Resultaterne viste, at kombinationsbehandling med VEGF-Trap og gemcitabin billede flere terapeutiske fordele end hver enkelt modalitet. Kombinationsbehandling havde signifikant højere hæmmende virkning på tumorvækst og en forlænget overlevelse, ikke kun hæmme tumor angiogenese og celledeling, men også stigende celle apoptose inden tumorvæv.

At udforske mulig mekanisme der ligger bag den forbedrede anti tumor effekt i VEGF-Trap og gemcitabin kombinationsterapi, blev tumor- vævsekstrakter undersøgt ved Western blot til proteinekspression. Resultaterne viste, at VEGF-Trap eller gemcitabin alene nedreguleres ekspressionen af ​​proliferation (cyclin D1), anti-apoptose (Pro-caspase-3, Bcl-2), invasion (MMP2, MMP9) relaterede proteiner, men kombinationen terapi resulterede i en mere markant nedregulering af disse markører i forhold til monoterapi grupper. Disse data var i overensstemmelse med resultaterne fra immunhistokemisk analyse og TUNEL-assay, støtter tanken om, at kombinationsterapi af VEGF-Trap og gemcitabin kan forbedre antitumoreffektivitet.

Den høje styrke af VEGF inhibering med VEGF-Trap mærker denne agent en ideel partner for kombination med tiltag rettet mod andre mekanismer tumor progression. På klinikker, kan VEGF-Trap terapi tilbyde ekstra fordele gennem normalisering af tumorvaskulatur, hvilket reducerer interstitielle tryk og beholder permeabilitet, og øger afgivelse af andre midler i tumorvæv, som kan gøre tumorceller mere følsomme over for kemoterapi [38] – [40]. Kombinationen af ​​kontinuerlige VEGF inhibering med VEGF-Trap med andre behandlingsmodaliteter kan repræsentere en mere optimal terapeutisk mulighed i en række tumortyper.

Vores resultater tydede på, at kombinationen af ​​VEGF-Trap og gemcitabin kan være en mere effektivt alternativ til human lungecancer, som kan danne grundlag for et rationale for humane kliniske undersøgelser for at undersøge fordelene ved kombinationsterapien af ​​VEGF-Trap og gemicitabine i lungekræft.

som konklusion kombinationsterapi af VEGF -fælde og gemcitabin resulterede i forbedret antitumorvirkning i LLC tumor model. Kombinationsterapien inhiberede tumorvækst og langvarig dyr overlevelse gennem undertrykt tumorangiogenese og celleproliferation, samt øget tumorcelle apoptose. VEGF-Trap /gemcitabin kombinationsbehandling kan udgøre en lovende strategi for menneskelig lungekræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

kvalitet og aktivitet af VEGF-Trap. (A) Kvaliteten af ​​VEGF-Trap blev bestemt ved reducerende SDS-PAGE for at vise som et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 50 kD; (B) VEGF-Trap udviste en potent bindingsaktivitet til mus VEGF som bekræftet ved en direkte binding assay

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068589.s001

(TIFF)

figur S2. Sammenligning af biologiske funktioner i LLC og Luc-LLC-celler

. Cellemorfologi og migration (A), vækst (B), og tumor dannende evne (C) af LLC og Luc-LLC-celler blev udført ved sårheling, MTT assay og subkutan tumormodel vurdering henholdsvis som viste ingen forskel mellem den transgene og ikke-transgene celler. Scale bar, 200 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068589.s002

(TIFF)

Tak

Vi takker Eli Lilly and Company Shanghai for venligt at give gemcitabin (Gemzar).