PLoS ONE: Nedsat Ekspression af ARID1A Gene er associeret med dårlig prognose i Primary Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

ARID1A

genet koder adenin-thymin (AT ) -rige interaktive domæne-holdigt protein 1A, som deltager i kromatin remodeling.

ARID1A

er blevet vist at fungere som en tumorsuppressor i forskellige cancertyper. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi udtrykket og prognose værdi på

ARID1A

i den primære gastrisk kræft. I mellemtiden, den biologiske rolle

ARID1A

blev yderligere undersøgt ved anvendelse af celle model in vitro.

Metode /vigtigste resultater

For at undersøge betydningen af ​​

ARID1A

gen i primær gastrisk kræft patogenese blev real-time kvantitativ PCR og western blotting bruges til at undersøge

ARID1A

udtryk i parrede ondartede og noncancerous væv. Resultaterne viste faldt

ARID1A

mRNA (

P

= 0,0029) og protein (

P

= 0,0015) udtryk i de fleste tumor-bærende væv sammenlignet med den matchede tilstødende ikke-tumor væv, og i gastriske cancercellelinjer. For yderligere at undersøge klinisk-patologiske og prognostiske roller

ARID1A

udtryk, vi udførte immunhistokemisk analyse af de 224 paraffin-indlejret gastrisk kræft væv blokke. Data, afslørede, at tabet af

ARID1A

udtryk var signifikant korreleret med T fase (

P

= 0,001) og kvalitet (

P

= 0,006). I overensstemmelse med disse resultater, fandt vi, at tabet af

ARID1A

udtryk var signifikant korreleret med dårlig overlevelse i mavecancerpatienter (

P

= 0,003). Cox regressionsanalyser viste, at

ARID1A

udtryk var en uafhængig prædiktor for total overlevelse (

P

= 0,029). Desuden funktioner

ARID1A

i spredning og kolonidannelse af gastriske cellelinjer blev analyseret ved transfektion af celler med fuld-længde

ARID1A

ekspressionsvektor eller siRNA målretning

ARID1A

. Gendannelse

ARID1A

udtryk i gastriske kræftceller signifikant hæmmede celledeling og kolonidannelse. Silencing

ARID1A

udtryk i gastrisk epitelcelle linje væsentligt forbedret celle vækstrate.

Konklusioner /Betydning

Vores data tyder på, at

ARID1A

kan spille en vigtig rolle i gastrisk kræft og kan tjene som en værdifuld prognostisk markør og potentielt mål for genterapi til behandling af mavekræft

Henvisning:. Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg et al. (2012) Nedsat Angivelse af

ARID1A

Gene er associeret med dårlig prognose i Primary Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: Januar 19, 2012; Accepteret: 6 juni 2012; Udgivet: 13 Jul 2012

Copyright: © 2012 Dandan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (30973398) og Guangdong Natural Science Foundation (925.100.890). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige malignitet i hele verden og den anden mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald hvert år (10,4% af kræftdødsfald) [1]. Behandling af gastrisk cancer indbefatter en kombination af kirurgi, kemoterapi eller strålebehandling. Men næsten 60% af patienterne påvirkede bukke under for mavekræft selv efter en kurativ resektion alene eller efter adjuverende terapi [2]. Det har længe været kendt, at gastrisk cancer skyldes en kombination af miljøfaktorer og akkumuleringen af ​​generaliserede og specifikke genetiske ændringer. Mange af de genetiske eller epigenetiske ændringer forbundet med gastrisk cancer, herunder tab af heterozygositet, mikrosatellit og kromosomal ustabilitet og hypermethylering, er blevet rapporteret [3]. Forståelsen af ​​disse ændringer og de molekylære mekanismer, der er involveret i gastrisk carcinogenese vil være afgørende for at forbedre diagnose, terapi og prognose forudsigelse af denne sygdom.

eukaryotisk bevarede SWI /SNF kromatin-remodeling kompleks spiller væsentlige roller i en række af cellulære processer, herunder differentiering, proliferation og DNA-reparation [4]. Tab af SWI /SNF-underenheder er blevet rapporteret i de fleste tumorer, og et stort antal eksperimentelle observationer antyder, at dette kompleks er kritisk for tumor suppression [5]. Komplekserne indeholder syv eller flere ikke-katalytiske underenheder, der formentlig hjælpe modulere målretning og aktivitet af ATPase [6]. En underenhed af dette komplekse, hSNF5 /Ini1 /BAF47, er blevet identificeret som en tumor suppressor [7], [8]. Den anden ikke-katalytisk underenhed, P270 /ARID1A /BAF250a (adenin-thymin AT-rige interaktive domæne-holdigt protein 1A), har vist sig at være vigtig for normal cellecyklusstandsning [9]. Knockdown af

ARID1A

i en leukæmicellelinje giver resistens mod Fas-medieret apoptose [10].

For nylig

ARID1A

mutationer og tab af BAF250a protein har vist sig at korrelerer stærkt med ovarie clear-celle carcinom og uterin lav kvalitet endometrioide carcinom [11] – [13]. Disse observationer viser, at

ARID1A

er en potentiel kandidat tumorsuppressorgen. Men den kliniske betydning af en sådan differentieret udtryk og funktion ARID1A protein forbliver udefineret på grund af manglen på undersøgelser med anvendelse af friske humane tumorprøver. I den foreliggende undersøgelse, vi analyserede

ARID1A

udtryk niveau mavekræft ved hjælp af real-time kvantitativ RT-PCR, western blotting og immunhistokemi. I mellemtiden har vi identificeret forholdet mellem

ARID1A

udtryk og klinisk-patologiske træk og evalueret sin prognostisk værdi i post-resektion overlevelse mavecancerpatienter. Desuden evalueres vi den funktionelle rolle

ARID1A

i tumorigenese af primær mavekræft ved at undersøge in vitro spredning og kolonidannelse i gastrisk cellelinjer.

Resultater

ARID1A

mRNA ekspression Analyseret af real-time kvantitativ RT-PCR

mRNA niveau af

ARID1A

blev bestemt ved real-time kvantitativ RT-PCR-analyser i 66 parrede kræft og de matchede hosliggende normale gastriske mucosa væv.

ARID1A

udtryk niveau var signifikant lavere i 43 (65,15%) tumor-bærende væv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumorvæv (

P

= 0,0029, Figur 1).

Den relative mRNA udtryk for

ARID1A

blev signifikant reduceret i gastrisk kræft væv sammenlignet med de matchede tilstødende nontumorous væv (n = 66,

P

= 0,0029). Vandrette linjer repræsenterer middelværdien.

ARID1A Protein Expression analyseret ved Western Blotting

Western blotting blev udført på 25 mavekræft prøver og tilsvarende tilstødende ikke-kræft maveslimhinden væv fra 66 parrede prøver. Resultaterne viste en ARID1A bånd ved den forventede størrelse på 242 kDa og mængden af ​​ARID1A protein til stede blev yderligere målt ved densitometri. Overensstemmelse med de kvantitative real-time PCR-resultater, blev et fald i ARID1A ekspression set i 13 (52%) af de gastriske tumorvæv sammenlignet med matchede tilstødende ikke-tumorvæv (

P

= 0,0015, figur 2A og Figur 2B). Ligeledes blev ARID1A proteinekspression bemærkelsesværdigt reduceret i gastrisk cancer cellelinjer, SGC7901, AGS, især i MGC803, sammenlignet med normal gastrisk cellelinje GES1 (Figur 2C).

(A) Relative ARID1A protein udtryk niveauer i mavekræft væv og noncancerous væv (ARID1A /GAPDH, n = 25,

P

= 0,0015). Horisontale linjer repræsenterer middelværdien. (B) Repræsentant resultat af ARID1A proteinekspression i 4 parrede gastrisk tumorform og de matchede tilstødende nontumorous væv (C, mavekræft væv N, matchede noncancerous maveslimhinden). (C) Den ARID1A proteinniveau blev bemærkelsesværdigt reduceret i gastrisk cancer cellelinjer, SGC7901, AGS, især i MGC803, sammenlignet med normal gastrisk cellelinje GES1.

immunhistokemisk analyse af ARID1A Expression i Gastric Cancer Tissue prøver og dets forhold til den klinisk-patologisk Parametre

for yderligere at undersøge klinisk-patologiske og prognostiske roller ARID1A udtryk, vi udførte immunhistokemisk analyse af de 224 paraffin-indlejret gastrisk kræft væv blokke. Samlet set 115 af 224 (51,3%) tilfælde viste negativ ARID1A udtryk i ondartede væv (figur 3B), mens 109 (48,7%) tilfælde viste positiv immunfarvning (figur 3C D). Normal maveslimhinden viste den stærkeste ARID1A positiv farvning (figur 3A). Sammenhængen mellem ekspressionen af ​​ARID1A og forskellige klinisk-patologiske parametre er anført i tabel 1. Dataene viste, at tabet af ARID1A ekspression blev signifikant korreleret med dybden af ​​tumor infiltration (T fase,

P

= 0,001) og tumor bedømmelse (

P

= 0,006), men ikke med alder, køn, tumorstørrelse, fjernmetastaser (M fase), og tumor locus eller lokal lymfeknude metastaser (N etape).

( A) Stærk ARID1A farvning blev observeret i noncancerous maveslimhinden. (B) ARID1A-negative gastrisk adenocarcinom, Grade 3. (C) Svag ARID1A farvning i gastrisk adenocarcinom, Grade 2. (D) Stærk ARID1A farvning i gastrisk adenocarcinom, Grade 1.

Angivelse af ARID1A og Klinisk Outcome

De 5-årige samlet overlevelse hos patienter med positiv og negativ ARID1A udtryk var 68,8% og 52,2%, hhv. Den samlede overlevelse af patienter med negativ ARID1A udtryk var betydeligt værre end for ARID1A-positive patienter (

P

= 0,003, log-rank test, figur 4). Univariate Cox regression analyser viste, at dybden af ​​tumor infiltration, lokale lymfeknudemetastaser, fjernmetastaser, tumorstørrelse og ARID1A ekspression signifikant var associeret med samlet overlevelse (tabel 2). Endvidere en multivariat Cox regressionsanalyse bekræftede dybden af ​​tumor infiltration, lokale lymfeknudemetastaser, fjernmetastaser og ARID1A ekspression som uafhængige prædiktorer for den samlede overlevelse mavecancerpatienter (tabel 2).

Overlevelsesraten for patienter i ARID1A-negative gruppe var signifikant lavere end for patienter i ARID1A-positive gruppe (log-rank test,

P

= 0,003).

The rolle

ARID1A

i celledeling og kolonidannelse i MGC803 og GES1 cellelinier

for at vurdere virkningerne af

ARID1A

på celleproliferation,

ARID1A

ekspressionsvektor og kontrolvektoren blev hver transficeret ind MGC803 celler.

ARID1A

ekspression i transficerede celler blev detekteret ved western blotting (figur 5A). Cellevæksten assay viste, at celle vækst i

ARID1A

transficerede gastriske cancerceller var væsentligt lavere end styrevektor-transficerede gastriske cancerceller (figur 5C). I mellemtiden, effektiviteten af ​​kolonidannelse var signifikant (

P

= 0,0379) hæmmede i

ARID1A

transficerede gastriske kræftceller sammenlignet med kontrol vektor-transficerede mavekræft celler (Figur 5D). For yderligere at bekræfte spredning undertrykkelse funktion

ARID1A

, vi tavshed

ARID1A

udtryk i GES1 cellelinje med siRNA.

ARID1A

ekspression i transficerede celler blev detekteret ved western blotting (figur 5B). Vi fandt, at tavshed udtryk for

ARID1A

i GES1 væsentligt forbedret celleproliferation sammenlignet med mock siRNA behandling (figur 5E).

(A) Western blotting analyse genoprette

ARID1A

ekspression i MGC803 celler. (B) Western blotting analyse af tavshed

ARID1A

udtryk i GES1 celler. (C) Cell proliferationsassay viser den undertrykkende virkning genoprette

ARID1A

ekspression på in vitro proliferation af MGC803 cellelinie. (D)

ARID1A

hæmmede koloni dannelse af MGC803 celler. Billederne vises til venstre og til højre, er kvantitative analyser af plak numre som middel ± SD. (E) Cell proliferation assay viser væsentligt forbedret spredning på

ARID1A

-silenced GES1 celler sammenlignet med mock siRNA behandling GES1 celler. *,

P

0,05 versus mock-kontrol; **,

P

. 0,01 versus mock-kontrol

Diskussion

På trods af store fremskridt i diagnose og terapi, mavekræft er stadig en af de mest dødbringende neoplasmer, med en trist prognose efter radikal gastrektomi [14], [15]. Det kliniske resultat af gastrisk cancer bestemmes af en række tumor egenskaber, såsom locoregional tumorvækst og invasion, differentiering kvalitet, angiogenese, fjernt metastase og cellecyklusprogression, der reguleres af en række beslægtede gener, herunder onkogener og tumor-suppressor gener. Derfor identifikation af gastriske cancerspecifikke biomarkører involveret i disse procedurer er meget vigtigt for diagnose, terapi og prognose forudsigelse i klinikken.

ARID1A

, et nyligt identificeret tumorsuppressorgen som koder for et medlem af SWI /SNF komplekset, har en høj mutationsfrekvens i blærekræft, uterin endometrioide carcinom, ovarie endometrioide og clear cell carcinoma [11] – [13], [16], [17]. I ovarie clear cell carcinoma, rapporteres det, at

ARID1A

mutation signifikant associeret med ARID1A immunreaktivitet [18]. For nylig, exome sekventering undersøgelse viste, at

ARID1A

er også ofte muteret i gastrisk kræft [19], [23]. Men indtil videre udtrykket, kliniske betydning og biologiske funktioner af

ARID1A

i mavekræft er ikke blevet undersøgt. Derfor evalueret vi ekspressionen af ​​

ARID1A

i gastrisk cancer ved real-time PCR, western blotting og immunhistokemi, ud over sin klinisk-patologisk og prognostisk betydning i et stort human prøve. Desuden bruger in vitro celle model, vi undersøgte også tumor suppressor rolle

ARID1A

i mavens celler i detaljer.

I den aktuelle undersøgelse, viste vi, at

ARID1A

blev udtrykt både lavere mRNA og protein niveau i mavekræft væv end tilsvarende ikke-kræft slimhinde. Efter aftale med disse molekylærbiologiske fund, immunhisto- kemi med en anti-ARID1A antistof viste, at

ARID1A

blev fuldstændig tavshed i 115 ud af 224 patient mavekræft prøver med positive udtryk i en anden 109 patienter. Vores observation er i overensstemmelse med en række undersøgelser afslørende at

ARID1A

udtryk ofte tabt eller reduceret i en række kræftformer væv og cellelinjer, såsom brystcancer, uterin endometrioide karcinom, æggestokkene klar celle og endometrioide karcinom [13,18,20 og 21].

til dato, årsagerne til

ARID1A

lyddæmpning er ikke blevet fuldt belyst. De eksisterende undersøgelser fokuserer på mutationer i

ARID1A

, især i gynækologiske kræftformer. Det forlyder, at en nonsense eller Indel mutation af

ARID1A

var korreleret med tab eller reduktion af protein-ekspression i livmoderen endometrioide karcinom, æggestokkene endometrioide karcinom og klar celle karcinom [11] – [13], [18]. I et integreret genomisk undersøgelse, Mamo

et al

. kun findes én trunkeret mutation af

ARID1A

i T47D brystcancercellelinie, uden mutation i 11 brystcancer prøver, som viste DNA kopital tab ved 1p36.11 locus støder op til

ARID1A

[22]. Otte af ni prøver med DNA-kopi nummer tab på 1p36.11 har også lav ARID1A proteinekspression, hvilket tyder på en overensstemmelse mellem DNA-kopi nummer tab og

ARID1A

inaktivering. I exome sekventering undersøgelse af Wang

et al

., Blev fundet i alt 46 mutationer hos 32 ud af 109 (29%) gastrisk kræft prøver, med 39 (85%) trunkerede mutationer [19]. Fireogtyve (75%) af de 32 gastriske prøver kræft med

ARID1A

mutationer viser enten tab eller væsentligt reduceret protein-ekspression i forhold til dem uden

ARID1A

mutation. I modsætning hertil er der kun 6 mavekræft prøver viser fraværende eller svag proteinekspression i fravær af påviselig

ARID1A

mutation, hvilket antyder, at andre mekanismer kan bidrage til

ARID1A

inaktivering. For nylig, en anden exome sekventering forskning ved Zang

et al

. viste også

ARID1A

mutationer i 8% af gastriske prøver, hvoraf 75% tabt eller reduceret protein udtryk [23]. Mere interessant, demonstrerede højere begge undersøgelser

ARID1A

ændringer i gastrisk prøver kræft med end dem med mikrosatellit stabilitet (MSS) mikrosatellit instabilitet (MSI). Desuden mutationen spektrum af

ARID1A

adskiller mellem de to genetiske typer af mavekræft, med de fleste indels i MSI typen og flere single-neucliotide variationer i MSS typen. MSI defineres som InDel mutationer i nukleotid- gentagelser (kendt som mikrosatellit regioner) resulterede fra DNA mismatch reparation geninaktivering-induceret replikering fejl [24]. Foreslået som de initierende genomiske begivenheder af gastrisk cancer, MSI ofte fører til akkumulering af yderligere kræftrelaterede genetiske ustabilitet, såsom allele tab og rammeskift mutationer i gener involveret i celleproliferation regulering, apoptose og DNA-reparation. Det er blevet rapporteret, at MSI forekommer i 25% til 50% af sporadiske gastrisk cancer, definerer en unik gentypen sygdom med forskellige klinisk-patologiske træk [24]. I undersøgelsen af ​​Wang

et al

., Den Indel mutation sats (78%) af

ARID1A

i MSI mavekræft er sammenlignelig med

TGFBR2

i MSI kolon cancer, en veletableret og funktionelt valideret driver gen inaktiveret af MSI [25]. Disse data viser, at mutation af

ARID1A

sammen med MSI kan spille en vigtig rolle i gastrisk carcinogenese. Derfor er forholdet mellem

ARID1A

ombygninger og MSI status i gastrisk cancer, såvel som dens klinisk-patologisk betydning, behov for yderligere undersøgelser i fremtidig forskning.

I undersøgelsen af ​​Wang

et al.

, udtryk for

ARID1A

blev kun fundet i en lille størrelse stikprøve (32 tilfælde), og der var ingen yderligere udforskning af sin kliniske betydning [19]. Her, i en større gastrisk cancer befolkning (224 sager), fandt vi, at tabet af

ARID1A

udtryk var signifikant korreleret med en højere T stadium af mavekræft, hvilket indebærer, at der ikke findes

ARID1A

ekspression kan fremme tumorvækst og invasion. Desuden har vi opdaget lavere ARID1A immunoreaktivitet i dårligt differentierede gastrisk kræft væv end i godt differentierede dem, tyder på, at faldet

ARID1A

udtryk kan spille en rolle i tumor de-differentiering. I overensstemmelse med vores resultater, andre efterforskere fandt også, at faldet

ARID1A

udtryk er signifikant associeret med en højere kvalitet af brystkræft [22], samt en højere FIGO stadie i æggestokkene klar celle karcinom [21]. ARID1A fremmer dannelsen af ​​BRG1 eller BRM-indeholdt SWI /SNF kromatin remodeling komplekser, som er afgørende for normal cellecyklusstop [9], [26].

En Kaplan-Meier overlevelse analyse viste en signifikant sammenhæng mellem tabet af

ARID1A

udtryk og dårligere klinisk resultat af mavecancerpatienter efter radikal operation. Cox hazard ratio regressionsanalyser yderligere vist, at

ARID1A

udtryk niveau var en uafhængig risikofaktor for overlevelse, hvilket tyder på, at det kan tjene som en værdifuld prognostisk biomarkør for mavecancerpatienter efter kirurgi og et potentielt mål for genterapi i behandling af gastrisk cancer. I æggestokkene klar celle karcinom, blev det også rapporteret, at patienter med positiv

ARID1A

udtryk havde en længere progressionsfri overlevelse end dem med negativ

ARID1A

udtryk [21]. Desuden er tab af

ARID1A

ekspression korrelerede signifikant med kemoresistens i æggestokkene clear cell carcinoma, som også er forbundet med en dårlig prognose af cancer. Disse data tyder på, at

ARID1A

udtryk og mutation undersøgelse kan være nyttigt at vejlede kliniske behandling. Tilsammen vores observationer, at tabet af

ARID1A

udtryk i mavekræft er forbundet med flere maligne fænotyper og en dårligere prognose indebærer, at det kan spille en tumor suppressor rolle i gastrisk carcinogenese.

Vi yderligere undersøgt den funktionelle rolle af

ARID1A

i gastrisk cellelinjer. Gendannelse

ARID1A

udtryk i gastriske kræftceller signifikant hæmmede celledeling og kolonidannelse. Silencing ekspressionen af ​​

ARID1A

i gastriske epitelceller signifikant forøget cellevæksthastigheden. Disse resultater er angivet som

ARID1A

kan spille en vigtig rolle, at hæmme tumorcellevækst. For nylig, funktionelle assays af

ARID1A

i gastrisk cancer cellelinjer af Zang

et al

. foreslog, at

ARID1A

udøve tumor-suppressor-aktivitet [23]. Guan

et al

. viste, at genoprette ekspressionen af ​​vildtype

ARID1A

er tilstrækkelig til at undertrykke spredning og tumorigenecity af xenografter med humane ovariecancer cellelinjer huser

ARID1A

mutationer, mens RNA-interferens-medieret

ARID1A

nedregulering forbedrer celleproliferation og tumorgenicitet i to ikke-transformerede humane ovarieepitelceller cellelinjer, IOSE-80PC og OSE4 [27]. Disse data sammen med vores, tyder på, at tabet af

ARID1A

kan spille en vigtig rolle i processen med carcinogenese.

Som konklusion har vi vist tab af

ARID1A

ekspression i gastrisk cancer og dens korrelation med en mere malign fænotype og dårligere prognose i et stort antal kliniske prøver. Desuden har vi bevist, at

ARID1A

kan hæmme tumorcellevækst og kolonidannelse in vitro. Så vidt vi ved, de data, der genereres i den aktuelle undersøgelse repræsenterer den første rapport korrelere tilstedeværelsen af ​​

ARID1A

med klinisk-patologiske egenskaber og den samlede overlevelse mavecancerpatienter. Taget sammen med resultaterne af Wang

et al.

Zang

et al

. [19], [23], vi yderligere bekræftet, at

ARID1A

kunne tjene som kandidat tumorsuppressor og prognostisk biomarkør i gastrisk carcinogenese.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af Sun Yat-sen University Cancer center, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient involveret i undersøgelsen.

cellelinier og dyrkningsbetingelser

de gastrisk cancer cellelinjer, SGC7901, AGS, MGC803, og den gastriske epithel slimhinde cellelinje GES1 blev opnået fra udvalget Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinierne blev dyrket i RPMI 1640-medier, der leveres med 10% varme-inaktiv kalvefosterserum (FBS). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i et fugtigt kammer, der indeholder 5% CO

2.

Menneskelig vævsprøve

s

I alt 66 parrede kræft og matchede tilstødende noncancerous maveslimhinden væv blev indsamlet fra gastrisk kræftpatienter i gastrektomi på Sun Yat-sen University Cancer center mellem 2009 og 2011, og diagnosen blev bekræftet af patologisk undersøgelse. Den 25 parrede kræft og tilsvarende tilstødende noncancerous gastrisk mucosa væv anvendes til at påvise ARID1A proteinekspression i western blotting blev udvalgt fra de 66 parrede prøver. Efter kirurgisk resektion blev friske væv umiddelbart immerged i RNAlater (Ambion, Inc., USA) for at undgå RNA-nedbrydning, opbevaret ved 4 ° C natten over for at tillade grundig indtrængen af ​​RNAlater i vævet og derefter nedfrosset ved -80 ° C indtil RNA og proteinekstraktion blev udført. Yderligere 224 paraffinindlejrede primære gastrisk karcinom prøver, der var blevet indsamlet mellem 2003 og 2005, blev opnået fra Sun Yat-sen University Cancer Center. Ingen af ​​disse patienter havde fået strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. De opfølgende data for de mavecancerpatienter i denne undersøgelse er tilgængelige og fuldstændige. Postoperativ opfølgning fandt sted på vores ambulatorium og omfattede kliniske og laboratorieundersøgelser hver 3. måned i de første 2 år, hver 6. måned i tredje til femte år, årligt for yderligere 5 år, eller indtil patienten død, alt efter hvad fandt sted først. Den histopatologiske type og stadium af mavekræft blev bestemt i henhold til kriterierne i World Health Organization klassificering og TNM scenen sat ud af Unionen for International Cancer Control.

Udvinding af Total RNA og Real-time kvantitativ PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) ifølge producentens protokol. Total RNA-koncentrationen blev vurderet ved at måle absorbansen ved 260 nm ved anvendelse af en NANO DROP spektrofotometer (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Revers transkription (RT) at syntetisere den første streng af cDNA blev udført med 2 ug samlet RNA behandlet med M-MLV revers transkriptase (Promega, USA) ifølge producentens anbefalinger. Det resulterende cDNA blev derefter udsat for real-time kvantitativ PCR for vurdering af de relative mRNA-niveauer af

ARID1A

GAPDH

(glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, som en intern kontrol) med følgende primere:

ARID1A

frem: 5′-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ‘, og omvendt: 5′-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3’;

GAPDH

frem: 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, og omvendt: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. Gene-specifik amplifikation blev udført under anvendelse af et ABI 7900HT realtids-PCR-systemet (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA) med en 15 pi PCR-blanding indeholdende 0,5 pi cDNA, 7,5 pi 2 x SYBR Green Master Mix (Invitrogen, Carlsbad , Californien, USA), og 200 nM af de passende oligonukleotidprimere. Blandingen blev forvarmet ved 95 ° C (10 min) og derefter amplificeret ved 95 ° C (30 sek) og 60 ° C (1 min) i 45 cykler. Kurven opløsning blev målt ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 15 sek og 95 ° C i 15 sek. Den Ct (tærskel cyklus) værdien af ​​hver prøve blev beregnet ud fra de grænseværdier cykler med instrumentets software (SDS 2.3), og den relative ekspression af

ARID1A

mRNA var normaliseret til

GAPDH Drømmeholdet værdi . Data blev analyseret ved anvendelse af sammenlignende tærskelcyklus (2

-ΔCT) metode.

Western blotting-analyse

De homogeniserede mavekræft prøver, herunder tumor- og ikke væv, såvel som cellelinier , blev lyseret i RIPA lysebuffer, og lysaterne blev høstet ved centrifugering (12.000 rpm) ved 4 ° C i 30 minutter. Ca. 50 ug protein prøver blev derefter separeret ved elektroforese i en 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidenfluoridmembran. Efter blokering af de ikke-specifikke bindingssteder i 60 min med 5% fedtfri mælk blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med et monoklonalt muse-antistof mod ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, ved en 1:1000 fortynding) . Membranerne blev derefter vasket tre gange med TBST (Tris-bufret saltvand med Tween-20) i 10 minutter og probet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret kanin-anti-muse-IgG-antistof (Immunology Consultants Laboratory, USA, ved en 1: 2000 fortynding) ved 37 ° C i 1 time. Efter tre vaske blev membranerne udviklet af en forøget kemiluminescens-systemet (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Bandet intensitet blev målt ved densitometri under anvendelse af Mængde One software (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). De protein niveauer blev normaliseret til den i GAPDH opdages ved hjælp af musen GAPDH monoklonalt anti-humant antistof (Shanghai Kangchen, Kina, på en 1:10000 fortynding).

Immunhistokemi Analyse

The vævssnit var afparaffiniseret med dimethylbenzen og rehydreret gennem 100%, 95%, 90%, 80% og 70% ethanol. Efter tre vaske i PBS (phosphatpufret saltopløsning) blev objektglassene kogt i antigen-genvinding puffer indeholdende 0,01 M natriumcitrat-saltsyre (pH = 6,0) i 15 min i en mikrobølgeovn. Efter skylning med PBS blev vævssnit inkuberet med primært antistof og objektglassene blev derefter skyllet i 3% peroxidase quenching-opløsning (Invitrogen) for at blokere endogen peroxidase. Snittene blev derefter inkuberet med et monoklonalt museantistof mod ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, ved en 1:300 fortynding) ved 4 ° C natten over og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) ved stue temperatur i 30 minutter. Efter vask i PBS blev visualisering signal fremkaldt med 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) opløsning, og alle dias blev modfarvet med hematoxylin. Som negative kontroller blev tilstødende sektioner behandlet som beskrevet ovenfor, bortset fra at de blev inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringsopløsning uden det primære antistof.

Den samlede ARID1A immunfarvning score blev beregnet som summen af ​​procentdelen af ​​positivt farvede tumorceller og den farvningsintensitet. Kort fortalt blev procentdelen af ​​positiv farvning bedømt som 0 (0-9%, negativ), 1 (10% -25%, sporadisk), 2 (26% -50%, fokal) eller 3 (51% -100%, diffus), og intensiteten som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (moderat farvning) og 3 (mørk farvning). Den samlede immunfarvning score blev beregnet med værdien af ​​procent positivitet score × farvningsintensitet score, der varierede fra 0 til 9. Udtrykket niveau ARID1A blev defineret som følgende: “-” (negativ, score 0), “+” (svagt positiv, score 1-3), “++” (positiv, score 4-6), “+++” (stærkt positiv, score 7-9). Baseret på de ARID1A ekspressionsniveauerne blev mavens kræftpatienter inddelt i to grupper:. Negativ ARID1A udtryk gruppe (ARID1A-) og positiv ARID1A udtryk gruppe (ARID1A +, ARID1A ++ eller ARID1A +++)

ekspressionsplasmid og Forbigående transfektioner

En eukaryot ekspressionsplasmid pCMV6-post, der indeholder den fulde længde af menneskets

ARID1A

cDNA blev opnået fra Asbio Technology Company (Guangzhou, Kina). Tom vektor blev anvendt som negativ kontrol.