PLoS ONE: Den Aryl Hydrocarbon receptoren grundlæggende aktiv i Advanced Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Distant prostatakræft er almindeligt hormonrefraktær og udviser øget vækst ikke længere hæmmet af androgen deprivation terapi . Forståelse alle molekylære mekanismer, der bidrager til ukontrolleret vækst er vigtigt at opnå effektive behandlingsstrategier for hormon refraktær prostatakræft (HRPC). Aryl hydrocarbon receptor (AhR) påvirker en række biologiske processer, herunder cellevækst og differentiering. Flere undersøgelser har vist, at eksogene ahr ligander hæmme cellulær proliferation men nye oplysninger tyder AhR kan have iboende funktioner, der fremmer celleproliferation i fravær af eksogene ligander.

Metoder /Results

QRT-PCR og Western blot-analyse blev anvendt til bestemmelse AhR mRNA og proteinekspression i hormonfølsomme LNCaP-celler samt hormon ildfaste DU145, PC3 og PC3M prostata cancercellelinjer. LNCaP-celler udtrykker AhR mRNA og protein på et meget lavere niveau end de hormon ildfaste cellemodeller. Cellular fraktionering og immuncytokemi afslørede nukleare lokalisering af AhR i de etablerede hormon ildfaste cellelinjer, mens LNCaP celler er blottet for nuklear AhR protein. QRT-PCR-analyse anvendes til at vurdere basale CYP1B1 niveauer, og en miljøfremmede lydhør element bindende assay bekræftede ligand uafhængig transkriptionel aktivitet af AhR i DU145, PC3 og PC3M celler. Basale CYP1B1 niveauer blev reduceret ved behandling med specifik AhR inhibitor, CH223191. En

in vitro

vækst assay viste, at CH223191 hæmmede væksten af ​​DU145, PC3 og PC3M celler i en androgen forarmet miljø. Immunhistokemisk farvning af prostata cancer væv afslørede øget nuklear lokalisering af AhR i grad 2 og grad 3 kræftformer sammenlignet med den godt differentieret klasse 1 kræftformer.

Konklusioner

Sammen disse resultater viser, at AhR er konstitutivt aktiv i fremskreden prostatacancer cellelinier, model hormon refraktær prostatacancer. Kemisk ablation af AhR signalering kan reducere væksten af ​​fremskreden prostatacancer celler, en effekt der ikke opnås med androgen receptor hæmmere eller vækst i androgen udtømte medier

Henvisning:. Richmond O, Ghotbaddini M, Allen C, Walker A, Zahir S, Powell JB (2014) aryl Hydrocarbon receptoren grundlæggende aktiv i fremskreden prostatacancer Cells. PLoS ONE 9 (4): e95058. doi: 10,1371 /journal.pone.0095058

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: December 20, 2013; Accepteret: 23. marts 2014 Udgivet: 22 April, 2014

Copyright: © 2014 Richmond et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health /National Institute on Minority Health og sundhed Forskelle /Research center i Minority institutioner Grant # 8 G12 MD007590. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

i USA, prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald for mænd [1]. The American Cancer Society anslår, at der vil være ca. 238.590 mænd diagnosticeret med PCa, og at 29.720 vil dø af PCa relaterede årsager i 2013 [1]. Ifølge nationale overlevelse statistik, de fem års overlevelse for mænd diagnosticeret med lokale eller regionale prostatakræft er 100%. Men mænd diagnosticeret med en fjernmetastaser har en fem års overlevelse på kun 29% [2].

Da PCa er androgen afhængig, primær behandling indebærer androgen deprivation terapi (ADT) for metastatisk sygdom [3] . Fleste prostatakræft oprindeligt svare ADT som målt ved en reduktion i serum prostata specifikt antigen (PSA). Men inden for 2 år de fleste patienter op med at reagere på behandlingen og udvikle hormon refraktær prostatacancer (HRPC) [4], [5]. Der er ingen kur for hormon refraktær prostatacancer (HRPC), som selv ADT resistente stadig androgen receptor afhængig [6]. Talrige mekanismer er blevet impliceret i langvarig androgen receptor signalering i HRPC. Disse omfatter stigninger i androgen receptor ekspression, forøgede steroidgenesen inden tumorcellerne, punktmutationer som ændrer androgen receptor aktivitet, ændringer i balancen i co-aktivator /co-repressor proteiner, og ændringer i celle signalveje, der krydstale med androgen receptor [5 ], [7]. Nylige fund tyder på, at aryl hydrocarbon receptor kan deltage i krydstale med AR og support AR vækst under androgen berøvet betingelser. Derudover har undersøgelser vist, at AhR har en indvirkning på androgen receptor transkriptionel aktivitet. AhR og Ahr-nukleare translokatoren (Arnt) interagerer med androgen receptor [8]. Dog kun AhR kunne forbedre androgen receptor transkriptionel aktivitet i fravær af en eksogen ligand [9].

I øjeblikket AhR er den eneste kendte ligand-aktiverede medlem af basis–helix-loop-helix ( bHLH) familie af transkriptionsfaktorer. Den aktiveres ved binding af en lang række miljømæssige toksiner, herunder polyaromatisk og polycykliske hydrocarboner (PAH) [10]. Mens i cytosolen, er AhR findes i et kompleks, som består af to molekyler af HSP90, co-chaperone p23, immunophilin-lignende AhR interagerende protein (AIP) og tyrosinkinase c-src [11], [12], [13] , [14]. Dette protein kompleks designet til at opretholde den inaktive kropsbygning og forhindre nuklear translokation.

Efter binding af ligander, aktiverede AhR translokeres til kernen og heterodimeriserer med AhR nukleare translokatoren protein (Arnt) [10], [15] . Det nukleare AhR kompleks interagerer med miljøfremmede respons elementer (XRE) i genet initiativtagere til fase I og fase II narkotika enzymer at øge transskription [16], [17], [18]. Efter induktion af Ahr responsive gener, er AhR signalering straks afsluttet ved nedbrydning eller ved binding af en inhibitor-protein [19], [20], [21].

AhR ligandaktivering er blevet rapporteret at antagonisere androgenreceptoren signalering. Potente AhR agonist, 2,3,7,8-tetrachlor-dibenzo

s

-dioxin (TCDD), inhiberede testosteron-afhængig transkriptionel aktivitet og testosteron-regulerede prostataspecifikt antigen (PSA) ekspression på dosisafhængig måde [22]. TCDD hæmmer også androgenafhængig proliferation af prostatacancerceller [23]. Co-aktivering af AhR og androgen receptor med TCDD og dihydrotestosteron (DHT) faldt AR proteinniveauer [24]. Denne observation er bidraget til evnen hos AhR at fremme proteolyse af AR gennem samling af en ubiquitin ligase kompleks, hvori AhR virker som et substrat-genkendelse subunit at rekruttere AR og kan forklare de antiandrogene handlinger foretaget af en række Ahr ligander [25].

på trods af de undersøgelser, der bekræfter AhR ligand regulering af AR-signalering, kan AhR besidder iboende funktioner, der regulerer væksten af ​​prostatakræft er uafhængige af AR status, der ikke er fuldt undersøgt. Strukturelt indeholder AhR både en nuklear lokalisering signal og en nuklear signal eksport, der er nødvendige for nuklear-cytoplasmatisk shuttling af AhR [26]. Adskillige rapporter afslører konstitutive AhR signalering inden for forskellige kræftformer. I mangel af eksogene ligander, AhR overekspression opreguleret ekspression af målgenet CYP1B1 i den tidlige fase af lunge adenocarcinom [27]. CYP1B1 udtrykkes også i ikke-småcellet lungekræft celler i fravær af en eksogen ligand. CYP1B1 ekspression er ledsaget af forøget AhR ekspression og konstitutiv aktivitet af receptoren [28], [29]. Udtømning af AhR protein resulterede i den efterfølgende nedgang i CYP1B1-ekspression, hvilket bekræfter, at den basale CYP1B1 ekspression reguleres af konstitutiv AhR signalering. Præmaligne og maligne brystvæv er rapporteret at konstitutivt udtrykker CYP1B1 mRNA. I disse menneskelige og gnavere brysttumorer, AhR var også overudtrykt og konstitutivt aktiv [30].

Endvidere blev muse hepatomaceller ikke er udsat for eksogene AHR ligander viste sig at indeholde transskriptionelt aktive AhR. Desuden blev et betydeligt niveau af konstitutiv AhR aktivitet rapporteret i celler isoleret fra hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) patienter (DiNatale2012). Også transient overekspression af AhR i en AhR null cellelinie også induceret ligand uafhængig transkriptionel aktivitet [29], [31].

prostatavæv analyseret ved immunohistokemi viste, at godartet hyperplasi (BPH) epitelceller besidder faldt betydeligt AhR ekspression sammenlignet med normalt væv. Imidlertid blev AhR ekspression ofte forøget i mere dedifferentierede tumorområder [32]. En separat undersøgelse også detekteret signifikant højere AhR ekspression og aktivering i tumorceller sammenlignet med godartet kirtelepitel [33].

LNCaP-cellelinie, afledt fra en lymfeknude-metastase, er et meget anvendt human prostatacancer-cellelinie anvendes til at påvise androgen følsomhed. LNCaP-celler udtrykker en muteret androgen receptor og prostataspecifikt androgen [34]. LNCaP-celler er ikke tumorigene i nøgne mus [35], [36]. I modsætning hertil androgen prostatacancer-cellelinier, DU145 og PC3 er yderst tumorigene i nøgne mus. Selvom de ikke udtrykker androgenreceptoren, er de reagerer på androgener men ikke har undertrykt vækst under androgen berøvet vækstbetingelser [37], [38]. Disse cellelinier er almindeligt anvendt som

in vitro

modeller til undersøgelser med hormon refraktær prostatacancer. Den PC3M prostatacancer-cellelinie blev isoleret fra nøgne mus efter intraspenic injektion af PC3-celler og er yderst metastatisk [39]. Selv om flere undersøgelser har vist virkningen af ​​AhR ligandaktivering i prostatacancercellelinjer, har ingen undersøgelse undersøgte rollen af ​​konstitutiv AhR signalering på prostatakræft cellevækst. Vi har tidligere rapporteret, at AhR er nødvendig for at opretholde hormon uafhængig signalering og vækst ved androgenreceptoren i c4-2 prostatacancerceller. Dette beviser en direkte rolle for AhR i androgen receptor afhængig vækst af prostatakræft celler [29]. I denne foreliggende undersøgelse viser vi, at AhR er konstitutivt aktiv i fremskreden prostatacancer celler, og at ablation af konstitutiv AhR signalering at inhibere androgen uafhængig vækst er ikke afhængig af androgen receptor status.

Materialer og metoder

kemiske og reagenser

AhR agonist, 2,3,7,8-tetrachlor-dibenzo

s

-dioxin (TCDD) blev købt fra AccuStandard (New Haven, Connecticut). AhR antagonist, (CH223191) blev købt fra Sigma Aldrich. Androgenreceptorantagonist, Casodex (CDX) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich.

Cell Culture

Adhærente monolagskulturer af human prostatacancer-cellelinier LNCaP, DU145, PC3 og PC3M blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 100 mmol /l hver af penicillin og streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO2 i befugtet atmosfære, og medium blev erstattet hver tredje dag. Celler blev delt (01:03), da de nåede nær sammenløb. Deres reaktion på androgener for vækst og androgen receptor aktivitet blev overvåget med mellemrum i løbet af undersøgelsen.

RNA-ekstraktion og kvantitativ QRT-PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret fra cellemonolag dyrket i 100 mm vævskultur retter med RNeasy Mini Kit (Qiagen). 2 pg af det totale RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af Superscript II (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. CDNA tjente som en skabelon i en reaktionsblanding 25 pi og blev behandlet under anvendelse af følgende protokol: en indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 39 amplifikationscykler (95 ° C i 10 s og 55-65 ° C i 30 s), 95 ° C i 10 s, 65 ° C i 5 s og 95 ° C i 50 s. Den 25 pi qPCR reaktionsblandingen blev blandet med GoTaq qPCR Master Mix (Promega). Smelt kurve analyser blev udført efter hver kørsel for at sikre et enkelt produkt. Relativ genekspression blev bestemt under anvendelse af ΔΔCq beregningsmetode. Primersekvenserne anvendte var: L-19: Forward (5′-3 ‘) TCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTT Reverse (5′-30:) TGCCTGTCACTATTCCTCATGCCA Omvendt (5’-3 ‘) TCTGCTGGTCAGGTCCTTGTTGAT Specificiteten af ​​disse primersæt blev valideret ved at udføre eksperimenter ved hjælp specifikke shRNAs der er målrettet mod AhR i’ TTGAGACCAGCCTGACCAACATGA CYP1B1 Forward (5′-3. «. tran et al [29].

Protein Isolering og Western blot analyse

Proteinprøver blev isoleret ved anvendelse af Thermo Scientific NE-PER Extraction kit til cellulære fraktioner eller kommercielt tilgængelige celle lysis buffer (Cell Signaling ) for total protein. Proteinprøver blev opløst ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran. Immunoblotting blev udført med 1 ug /ml muse AhR monoklonalt antistof ved 1:1000 fortynding med 5% mælk. Blots blev vasket tre gange (15 minut hver) med TBST. blottene blev derefter inkuberet i 1:2500 fortynding af sekundært antistof og vasket tre gange (15 min hver) med TBST, tre gange (10 min hver) med TBS og en gang med ddH20 (10 min). Bands blev visualiseret med forøget kemiluminescens (ECL) kit som angivet af fabrikanten. Flere eksponeringer af hvert sæt prøver blev produceret. Den relative koncentration af målprotein blev bestemt ved computeranalyse og normaliseret til en intern standard (topoisomerase, β-tubulin, β-actin).

immuncytokemisk farvning og fluorescensmikroskopi

Celler dyrket på glas dækglas i 6-brønds plader blev vasket i kold PBS og fikseret ved inkubering i en 1:01 methanol: acetone-opløsning ved 4 ° C i 30 minutter og derefter lufttørret. Celler blev skyllet og hydreret med Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 (TBST) og overført til en ren plade med 6 brønde. Cellerne blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time i 5% mælk opløsning i TBST at blokere uspecifik binding, efterfulgt af inkubation ved stuetemperatur i 1 time med affinitetsoprenset kanin-anti-AhR polyklonalt antistof ved 1 ug /ml ved 1:1000 fortynding i 4% mælk opløsning i TBST. Celler blev derefter vasket tre gange (15 min hver) med TBST. Celler blev inkuberet med et 1:200 fortynding af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-kanin-antistoffer (Jackson Immunoresearch laboratorier, West Grove, PA) i 4% mælk ved stuetemperatur i 1 time. Cellerne blev derefter vasket tre gange (15 min hver) med TBST, tre gange (10 min hver) med TBS og en gang med ddH20 (10 min). Cellerne blev derefter monteret på dias ved hjælp UltraCruz hårdt sat montering medium indeholdende 4’6′-diamidino-2-phenylindol (DAPI).

XRE Bindende

4 × 10

4 celler udpladet i en plade med 96 brønde. Prostatacancerceller blev transficeret med XRE reporter, samt med positive og negative kontrol reporter plasmider under anvendelse attractene. Efter 18 timers transfektion blev mediet ændret til standard assay media (DMEM + 0,5% FBS +0,1 mM NEAA). Celler blev dyrket i yderligere 24 timer under normale celle betingelser. En dual luciferase assay blev udført efter 42 timers transfektion, og promotoraktivitet værdier er udtrykt som arbitrære fluorescens enheder (AFU). Eksperimenter blev udført tre gange og standardfejl er angivet.

Proliferation Studies

Vækst af celler blev analyseret under anvendelse af Promega CellTiter 96 Cell Proliferation Assay. Celler blev resuspenderet til en slutkoncentration på 1,0 x 10

5 /mL i RPMI. 50 pi af cellesuspensionen (5000 celler) blev tilsat til hver brønd i 96-brønds plade indeholdende 50 pi medier med tilsvarende behandling resulterer i et samlet volumen på 100 pi. Mikropladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 24-72 timer i en fugtig, 5% CO

2 atmosfære. Pr producentens anvisninger, efter inkubation blev 20 pi MTS-opløsning tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. 100 pi stopopløsning tilsat til hver brønd og inkuberet i 1 time. Absorbanser blev aflæst ved 570 nm ved Synergy H1m multimode mikropladelæser.

immunhistokemisk farvning

Tissue slides blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i graduerede ned-serie af ethanol (70, 90 og 100% ) og endelig ddH20. Antigener blev hentet via Biocare buffer før inkubering i 0,3% H

2O

2 i 10 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev vasket tre gange (5 min hver) i PBS. Objektglas blev blokeret ved inkubering i normalt gedeserum blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur. Objektglassene blev inkuberet med 1 ug /ml kanin-anti-AhR polyklonalt antistof (1:100 fortynding) natten over ved 4 ° C. Efter inkubation med primært antistof blev objektglassene vasket tre gange (5 min hver) med PBS forud for en 1 times inkubation med gede, anti-kanin sekundært antistof (1:400) fortynding ved stuetemperatur. Objektglassene blev vasket tre gange (5 min hver) i PBS og inkuberet 10 minutter med diaminobenzedine pr fabrikantens instruktioner. Igen blev slides vasket tre gange (5 min hver) med PBS, skylles med Hedeselskabet

2O og dehydreret i gradueret up-serie af ethanol, før bliver ryddet i xylen og monteres med xylen baseret montering medier. Billeder af hver vævsprøve samt tilsvarende hematoxylin og eosin pletter blev taget til fange ved 400x forstørrelse til efterfølgende scoring. Anti-AhR reaktivitet blev scoret på en skala fra 1-3 (1 = lav reaktivitet og 3 = høj reaktivitet) til cytoplasmaet og kernen af ​​hver vævsprøve af to uafhængige undersøgere.

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev udført mindst 3 gange og alle værdier er udtrykt som middelværdi + SEM. Forskellene mellem grupperne blev sammenlignet ved t-test eller ANOVA under anvendelse InStat software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). En værdi på P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

jeg.. AhR er overudtrykt i fremskreden prostatacancer cellelinier

DU145, PC3 og PC3M prostata cancer cellelinjer blev anvendt som hormon prostatacancer celle modeller. Disse 3 cellelinier har vist sig at opretholde vækstrater i en androgen forarmet miljø [37], [38], [39]. LNCaP er en androgen følsom prostatacancer celle model, hvis vækstrate reduceres under androgen udtømt betingelser [34]. Ekspressionen af ​​AhR mRNA i cellelinjer blev kvantificeret ved QRT-PCR. AhR proteinekspression af hver linje blev undersøgt ved western blot. Advance prostata cancercellelinier har en stigning i ekspressionen af ​​AhR mRNA og protein i forhold til androgen følsomme, LNCaP, cellelinie. LNCaP-celler udtrykker både AhR mRNA og protein. Men DU145 og PC3 celle har en 2,5 og 5 gange stigning i Ahr mRNA (fig. 1B). Dette korrelerer med 2 gange stigning i Ahr protein i DU145 og stigningen mere end 2,5 gange i PC3-celler (Fig. 1A). PC3M celler har den største stigning i Ahr ekspression sammenlignet med LNCaP-celler. Der var en 10 gange stigning i PC3M mRNA og 3 gange stigning i Ahr protein (fig. 1).

A. Samlede mængde celleproteiner blev isoleret fra LNCaP, DU145, PC3 og PC3M prostata cancercellelinjer. Proteiner blev separeret ved SDS polyacrylamine gelelektroforese og blottet under anvendelse af et anti-AhR antistof. Anti-β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Billede J blev brugt til at opnå desitometric foranstaltninger fra 3 uafhængige membraner. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3) og blev analyseret ved student t-test. Statistisk signifikante forskelle (* p 0,05) sammenlignet med LNCaP kontrol. B. Totale RNA’er blev isoleret og kvantitativ RT-PCR blev udført for at bestemme mRNA ekspression af AhR i prostata cancercellelinier. mRNA niveauer blev normaliseret under anvendelse af L-19, der tjener som en intern kontrol. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3) og blev analyseret ved student t-test. (*) Angiver statistisk signifikante forskelle mellem grupperne.

II. Ligand Uafhængig Nuclear Lokalisering af AhR

For at bestemme lokalisering af AhR protein, vi isoleret cellulære fraktioner og udført immunoblotting for AhR på det nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Western blot analyse af cellulære fraktioner afslørede, at stigningen AhR ekspression i fremskreden prostatacancer-cellelinier er ledsaget af nukleare akkumulering af AhR uden stimulering med et eksogent ligand. Selv AhR protein blev påvist i de cytoplasmatiske fraktioner af LNCaP-celler, blev der ikke AhR detekteret i LNCaP nukleare fraktioner. I modsætning hertil viste de avancerede prostatacancerceller linjer høj ekspression af AHR protein i nukleare fraktioner (fig. 2A). Immuncytokemi bekræftede tilstedeværelsen af ​​AhR i kernen af ​​DU145, PC3 og PC3M celler. Fraværet af enhver farvning overlay i det flettede billede af DAPI farvede kerner og FITC-farvet AhR endvidere vist, at LNCaP celler ikke besidder nukleare AhR (Fig. 2B).

A. Nukleare og cytoplasmiske fraktionering: Cellelinier blev dyrket på 100 mm skåle indtil -75% konfluente, vasket med kold PBS og cellulære fraktioner blev isoleret ved pr producentens instruktioner under anvendelse af et NE-PER ekstraktionssæt. De nukleare og cytoplasmiske fraktioner blev analyseret ved western blotting for AhR proteinekspression. Det relative niveau af cytoplasmatisk AhR blev normaliseret med β-tubulin ekspression og det relative niveau for nuklear AhR blev normaliseret med topoisomerase ekspression. Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM af de korrigerede værdier fra tre uafhængige forsøg og (*) angiver konstitutive nukleare niveauer af AhR som er signifikant forskellig mellem cellelinier. B. subcellulære lokalisering af AhR i prostata cancer cellelinjer ved immuncytokemisk farvning: Celler blev dyrket på dækglas og fikseret med methanol: acetone. AhR blev visualiseret ved farvning med kanin-anti-Ahr polyklonale antistoffer efterfulgt af FITC-konjugeret gede-anti-kanin-antistof. Kernerne blev counter-farvet med DAPI fluorescens farvestof. Billeder fra FITC og DAPI-fluorescens-kanaler blev fusioneret. Billeder blev taget til fange på et Olympus bred fluorescens mikroskop (400x forstørrelse).

III. Konstitutiv AhR transkriptionsaktivitet

Cignal XRE reporter blev anvendt til at måle den basale aktivitet af AHR signalvejen i fremskreden prostatacancer-cellelinier. Assayet anvendt til at teste AhR promotoraktivitet afslørede, at den forudbetalte prostatacancerceller DU145, PC3 og PC3M, alle har et højt niveau af AhR binding til XRE i fravær af en eksogen ligand. Androgen følsomme LNCaP-cellelinje demonstrerede minimal XRE binding. PC3 celler demonstrerede den højeste promotoraktivitet med et 10-gange stigning i XRE binding sammenlignet med LNCaP-cellelinjer. DU145 og PC3M celler demonstrerede en 2,5 og 8 gange stigning i promotoraktivitet sammenlignet med LNCaP-cellelinien, (fig. 3A).

A. Hver prostatacancer cellelinje blev transficeret med en XRE reporterplasmid, samt med positive og negative kontrol reporter plasmider under anvendelse attractene. Efter transfektion blev en dobbelt luciferase assay udføres. Promotoraktiviteten værdier er udtrykt som arbitrære fluorescens enheder (AFU). Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3) og blev analyseret ved student t-test. (*) Angiver statistisk signifikante forskelle (* P 0,05). B. QRT-PCR-analyse af CYP1B1 mRNA-ekspression i prostatacancerceller. Celler blev behandlet med 50 pM AhR inhibitor (CH223191) eller vehikelkontrol (DMSO) i 24 timer og totale RNA’er blev isoleret og kvantitativ RT-PCR blev udført for at bestemme mRNA-ekspression af CYP1B1 i hver prostata cancercellelinier. mRNA niveauer blev normaliseret under anvendelse af L-19, der tjener som en intern kontrol. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3) og blev analyseret ved student t-test. (*) Angiver statistisk signifikante forskelle (* P 0,05) sammenlignet med LNCaP prostatakræft cellelinje

Ovenstående resultater tyder på en transkriptionelt aktiv AhR i fremskreden prostatacancer cellelinjer.. Adskillige rapporter har bekræftet forhøjet AhR og CYP1B1 men ikke CYP1A1 i tumorigene modeller [30], [40]. Disse undersøgelser antyder eksistensen af ​​forskelle i reguleringen af ​​disse to gener. CYP1A1 og CYP1B1 udtryk er både AhR medieret men forskelle i promotor struktur kan resultere i differentiel udtryk. Rapporterne viser, at CYP1A1 er kontrol ligand aktivering af AhR og CYP1B1 er reguleret af konstitutive AhR signalering [41], [42], Derfor, for at bekræfte transkriptionsaktivitet af Ahr signalvejen, AhR lydhør gen, CYP1B1 blev målt ved qRT- PCR i androgen følsomme LNCaP-cellelinie samt fremskreden prostatacancer-cellelinier, DU145, PC3and PC3M. LNCaP-celler udtrykte minimale niveauer af CYP1B1 transkript. DU145 og PC3-celler viste en 12 og 25 gange stigning i CYP1B1 sammenlignet med LNCaP-celler. PC3M celler viste den største fold stigning i CYP1B1 med en næsten 30 gange stigning i forhold til LNCaP celler. Hæmning af AhR signalering ved direkte hæmmer, CH223191, resulterede i et betydeligt fald i CYP1B1 niveauer i de avancerede prostata kræft cellelinjer. Grundet den lave basale ekspression af CYP1B1 i LNCaP-celler, CH223191 havde ingen signifikant virkning på CYP1B1 mRNA-ekspression (fig. 3B).

IV. Ablation af konstituerende AhR Signaling Hæmmer Androgen Independent Vækst

Ovenstående data viser evnen af ​​AhR antagonist, CH223191, at hæmme konstitutive AhR signalering. For at bestemme virkningen af ​​konstitutiv AhR signalering på væksten af ​​avancerede prostatacancerceller blev hver cellelinie dyrket i fravær og nærvær af den specifikke AhR inhibitor, CH223191. LNCaP, DU145, PC3 og PC3M prostatacancerceller blev dyrket i nærvær af AhR inhibitor CH223191191 i koncentrationer i intervallet fra 1 pM til 50 uM (fig. 4A). Ablation af AhR signalering var tilstrækkelig til at reducere væksten i alle cellelinjer, herunder androgen følsomme LNCaP celler. For at bekræfte virkningerne af CH223191191 var AhR afhængig, DU145-celler blev transficeret med en kontrolvektor (SCR) og en vektor, som bærer specifikke shRNA at målrette AhR protein (-AhR). De resulterende celler, som udtrykker AhR (SCR) og mangler AhR protein (-AhR) blev behandlet med 50 pM CH223191191 (fig. 4B). De DU145 (SCR) celler reagerer på CH223191191 behandling med en betydelig nedgang i væksten, mens DU145 (-AhR) celler udviste ingen vækst svar på AhR antagonist (fig. 4B). Androgen receptor inhibering med Casodex var kun effektiv i LNCaP-celler. Behandling af fremskreden prostatacancer cellelinier (DU145, PC3 og PC3M) med CDX havde ingen effekt på vækstraten. LNCaP-celler udviste et fald på 40% i vækstraten i nærvær af CDX. CH223191 behandling resulterede i den største væksthæmning i DU145 celler. DU145 celler viste også den højeste vækstrate af alle cellelinjer under kontrol betingelser. Også co-behandling med CH223191 og CDX medførte yderligere fald i væksthastighed sammenlignet med CH223191 alene i alle cellelinjer (fig. 4C). Vækstinhibering af prostata cancer cellelinier ved CH223191191 forblev i op til 72 timer (Fig. 4D).

A. Celler blev dyrket i en 96 brønds plade på 5,0 x 10

3 celler pr. Cellerne blev behandlet med DMSO eller 1 pM, 5 pM, 10 pM, 25 pM eller 50 uM CH223191. Cellevækst blev målt ved anvendelse Promega CellTiter 96 celleproliferationsassay pr fabrikantens instruktioner. B. Bekræftelse af AhR proteinekspression i DU145 celler med scrambled vektorkontrol (SCR) og shRNA lentivirus mod AhR (-AhR) ved western blotting. 20 ug protein isoleret fra blev analyseret ved Western blotting. β-handling bruges som en loading kontrol. Proliferation af DU145 (SCR) og DU145 (-AhR) celler blev analyseret ved anvendelse af CellTiter 96 Cell Proliferation Assay i nærvær og fravær af 50 uM CH223191. C. Cellerne blev dyrket i charcoaled strippede medier og behandlet med DMSO (CON), 20 uM Casodex (CDX), 50 uM CH223191 eller en kombination af CDX og CH223191 i 72 timer. Cellevækst blev målt ved anvendelse Promega CellTiter 96 celleproliferationsassay pr fabrikantens instruktioner. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3), * p .05. D. Cellerne blev serum sultet i 24 timer og dyrket i kul strippet (CSS) medier. Celler, hvor derefter behandlet med DMSO (Con) eller 50 pM CH223191 i yderligere 24, 48 eller 72 timer. Ved hver endepunkt blev cellerne analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af celleproliferationsassay som beskrevet i materialer og metoder. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± SEM (n = 3). (*) Angiver en signifikant forskel i forhold til respektive DMSO kontrol.

V. AhR cellekerneakkumulering i prostatakræft Tissue

ekspression og lokalisering af AhR blev vurderet i prostatakræft væv ved immunhistokemisk farvning. I overensstemmelse med formålet med denne undersøgelse at vise, at AhR er konstitutivt aktiv i fremskreden prostatacancer, vi vurderet AhR ekspression i prostata cancer væv spænder fra Grade 1 til Grade 3. Grade 1 væv er godt differentieret og cellerne synes normal. Grade 2 væv er moderat differentieret og cellerne ser lidt anderledes end normalt. Grade 3 væv er dårligt differentieret og cellerne synes unormal og tendens til at vokse og spredes mere aggressivt. 100% af vævene farvet positive for cytoplasmatisk AhR. Men kun 14% af klasse 1 væv var positive for nuklear AhR sammenlignet med 50% af grad 2 og grad 3 kræft væv (fig. 5A og tabel 1). Tilstedeværelsen af ​​nukleare AhR i lønklasse 2 og klasse 3 væv sammen med in vitro-data fra prostatakræft-cellelinier antyder en transkriptionelt aktiv AhR i disse højere lønklasse tumorer. Derudover har alle klasse 1 tumorer positive for nuklear AhR blev alle klassificeret som Stage IV tumorer. Analyse af total AhR udtryk afslørede, at grad 2 og 3 tumorer besidder betydeligt mere samlet AhR forhold til grad 1 væv (fig. 5B). Desuden -80% af væv med Gleason score 7 eller højere er forøget anti-AhR reaktivitet sammenlignet med kun 47% af væv med Gleason score 2-6 (tabel 2).

A. Repræsentant Grade 1, Grade 2 og Grade 3 prostatakræft væv: Overpanel farvet med anti-AhR polyklonale antistof; nedre felt farvet med hematoxylin og eosin. Pilene skildrer positive anti-AhR reaktivitet i kernen af ​​grad 2 og klasse 3 tumorer. B. I alt anti-AhR reaktivitet blev scoret i lønklasse 1, klasse 2 og klasse 3 prostatakræft væv baseret på intensitetsniveau i både cytoplasma og cellekerne (0-1).