PLoS ONE: Aktivering af RhoB signalvejen ved thyroidhormonreceptor β i kræft i skjoldbruskkirtlen celler

Abstrakt

Thyroid hormon receptor (TR) formidler de afgørende virkninger af skjoldbruskkirtelhormon (T3) på cellulær vækst, udvikling og differentiering. Reduceret ekspression eller inaktivering somatiske mutationer af TRs er blevet fundet i humane cancere i lever, bryst, lunge, og skjoldbruskkirtel. Mekanismerne i TR-associeret carcinogenese er stadig ikke klarlagt. At fastslå, hvilken funktion TRp i skjoldbruskkirtlen cancercelleproliferation, konstruerede vi en rekombinant adenovirusvektor, AdTRβ, som udtrykker humant TRβ1 cDNA. Thyroidea cancercellelinier hvori TRp proteinniveauer var betydeligt reducerede i sammenligning med intakte skjoldbruskkirtlen væv blev inficeret med AdTRβ og funktionen af ​​TRp på celleproliferation og migration blev analyseret. Ligandbundet TRp induceret HDAC1 og HDAC3 dissociation fra, og histonacetylering forbundet med RhoB promotoren og forøgede ekspressionen af ​​RhoB mRNA og protein. I AdTRβ-inficerede celler, T3 og farnesyltransferaseinhibitor (FTI) -Behandling inducerede fordelingen af ​​RhoB på cellemembranen og øget overflod af aktive GTP-bundne RhoB. Dette RhoB protein førte til p21-associeret celle-cyklus anholdelse i G0 /G1 fasen, efter hæmning af celledelingen og invasion. Omvendt sænke cellulære RhoB af små interfererende RNA knockdown i AdTRβ-inficerede celler førte til nedregulering af p21 og hæmmede celle-cyklus anholdelse. Væksten i BHP18-21v tumorxenoplantater

i

vivo

var signifikant hæmmet af AdTRβ injektion med FTIs-behandling, sammenlignet med kontrol virus-injicerede tumorer. Denne roman signalvej udløst af ligand bundet TR giver indsigt i mulige mekanismer for spredning og invasion af skjoldbruskkirtelkræft og kan give nye terapeutiske mål for skjoldbruskkirtelkræft

Henvisning:. Ichijo S, Furuya F, Shimura H, Hayashi Y, Takahashi K, Ohta K, et al. (2014) Aktivering af RhoB signalvejen ved thyroidhormonreceptor β i skjoldbruskkirtlen cancerceller. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10,1371 /journal.pone.0116252

Redaktør: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japan

Modtaget: August 12, 2014 Accepteret: December 5, 2014; Udgivet: December 30, 2014

Copyright: © 2014 Ichijo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af JSP’er KAKENHI (Grant nummer 24.591.359). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

thyroideahormonreceptorer (TRs) er ligand-afhængige transkriptionsfaktorer, som medierer handlinger thyroidhormon (T3) i cellulær udvikling, vækst og differentiering. To humane TR gener, thrA og THRB, der er placeret på forskellige kromosomer, indkode T3-bindende isoformer (TRα1, β1, β2, og p3), der er udtrykt i en vævs- og udviklingsorienteret afhængig måde [1]. I de seneste årtier har betydelige fremskridt er gjort i forståelsen af ​​TR tiltag i at opretholde normal cellefunktion. Men roller TRs i human cancer ikke godt forstået. Den reducerede udtryk for TRs grund af hypermethylering eller sletning af TR gener i human cancer tyder på, at TRs kunne fungere som tumorsuppressorer [2]. En tæt sammenslutning af somatiske mutationer af TRs med skjoldbruskkirtelkræft støtter yderligere den opfattelse, at tabet af normale funktioner TR kunne føre til ukontrolleret vækst og tab af celledifferentiering [3].

For at forstå de funktionelle konsekvenser af ligand -bundet TR virkninger på downstream signalveje i skjoldbruskkirtlen cancerceller, fokuserede vi på RhoB der er medlem af ras superfamilien af ​​isoprenylated små GTPaser, som regulerer actin stress fibre og vesikel transport [4]. Andre RhoGTPases, som omfatter RhoA og RhoC, fremme onkogenese, invasion og metastase [5]. I modsætning hertil RhoB har antiproliferativ og proapoptotiske virkninger i cancerceller, og overekspression af RhoB kan inhibere cellemigrering, invasion og metastase [6]. Membran sammenslutning af RhoB protein sker gennem enten geranylgeranylerede (RhoB-GG) eller farnesylerede modifikationer. RhoB reagerer på farnesyltransferaseinhibitor (FTI) -Behandling af en forstærkning af funktion mekanisme, der er karakteriseret ved elevation af RhoB-GG form, der inhiberer proliferation eller apoptose af cancerceller [7]. Således kan ændret ekspression og aktivitet af RhoB være afgørende for cancer progression og terapeutiske responser.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi funktionen af ​​ligand-bundne TRp i skjoldbruskkirtlen cancerceller. Ligandbundet TRp induceret RhoB proteinekspression, hvilket fører til forøget ekspression af p21 efterfulgt af nedsat celleproliferation og motilitet. FTI-behandling forbedret disse antiproliferative funktioner ligand bundet TR. Vores resultater identificere RhoB opregulering som et vigtigt skridt til at målrette kræft i skjoldbruskkirtlen celledeling og tumor progression. Denne roman signalvej udløst af ligand bundet TR giver indsigt i mulige spredning og invasion mekanismer i kræft i skjoldbruskkirtlen.

Materialer og metoder

Cell kultur

BHP18-21 celler, der blev rapporteret af Ohta

et al.

[8], blev leveret som en gave af Dr. Jerome Hershman, UCLA. BHP18-21v celler, som udtrykker Pax-8, men ikke udtrykker enten thyroglobulin eller skjoldbruskkirtlen transkriptionsfaktoren-1-genet, blev isoleret fra BHP18-21v celler [9]. FRO og WRO celler, som blev rapporteret i citation [10], [11] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Shunichi Yamashita, University of Nagasaki. Disse cellelinier er ikke

de

novo

cellelinjer, men er allerede blevet rapporteret [8], [10], [11] og blev venligst stillet til rådighed som gaver ved vores samarbejdspartnere. Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) i en befugtet inkubator under en CO 5%

2 atmosfære. DNA-profilering af cancercellelinier blev analyseret ved Promega Japan (Tokyo, Japan) og er vist i tabel 1. Thyroideahormon, triiodothyronin (T3) og farnesyltransferaseinhibitor (FTI), FTI-277, blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. . Louis, MO). Cellerne blev inkuberet med harpiks-strippet (T

3-forarmet) FBS [12] og blev derefter inficeret med 30 MOI AdTRβ eller kontrol AdLacZ. Cellerne blev inkuberet i medium med eller uden 30 nM T3 eller 5 uM FTI.

Konstruktion af de rekombinante adenovirale vektorer Salg

AdTRβ er en ΔE1-ΔE3 rekombinant adenovirus, der udtrykker det humane TRp-genet [13] under kontrol af den umiddelbare tidlige promotor af cytomegalovirus (CMV). Konstruktion af AdTRβ virus er tidligere blevet beskrevet [13]. AdLacZ, der indeholder CMV-promotor-kontrolleret

lacZ

genet, blev købt fra Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada) og blev anvendt som kontrol. AdTRβPV er en rekombinant adenovirusvektor der udtrykker humant TRβPV, hvilket er en dominant negativ mutant af TRp [14], under kontrol af cytomegalovirus øjeblikkelig tidlig promotor. Det FLAG-TRβPV plasmid [15] blev anvendt som skabelon til kloning

TRβPV

ind pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) ved hjælp af polymerase kædereaktion. PCR-primerne var: FLAG-ApaI-5 ‘(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), og TRβPV-3’ Kpnl (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC), hvor understregninger angiver restriktionssteder. En adenovirusvektor blev derefter konstrueret under anvendelse af Adeno X udtrykke System (Clontech) ifølge fabrikantens protokol. Rekombinante adenovira blev plaque-oprenset, høstet 48 timer efter infektion af 293-celler og oprenset ved dobbelt cæsiumchloridgradient ultracentrifugering [16]. Virale titre blev bestemt ved plaque-assays med dyrkede 293 celler [16] og en adenovirus titrering (Clontech).

Plasmidkonstruktion og luciferaseassays

RhoB reporter plasmid -726 /+ 86 RhoB -Luc plasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. Dimitris Kardassis (Kreta Universitet Medical School) [17]. Forbigående co-transfektioner blev udført in triplo. The Renilla luciferase plasmid blev co-transficeret til normalisering. Plasmid transfektioner blev udført i AdTRβ eller kontrol virusinficerede thyroid cancer celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med eller uden T3 i yderligere 24 timer. Dual luciferase assays blev udført ifølge producentens anvisninger (Promega, Madison, WI).

chip assay

chip assays blev udført under anvendelse af en simpel chip enzymatisk chromatin immunoprecipitation kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). AdTRβ-inficerede celler (5 x 10

7), som blev behandlet med eller uden T3 blev fikseret med 1% formaldehyd og fordøjet kromatin blev immunfældet med anti-histon 3 (positiv kontrol), normalt kanin IgG (negativ kontrol), anti acetyl histon 3 (Lys 9), anti-histon deacetylase (HDAC) 1 eller anti-HDAC3 antistoffer. Fem hundrede pi af fortyndet kromatin blev immunfældet med 5 ug af hvert antistof og protein G magnetiske perler ifølge producentens anvisninger. Kvantitativ real-time (RT) -PCR blev udført under anvendelse af en SYBR green realtids-PCR-kittet (Life Technologies). Primersekvenserne anvendt til RT-PCR var: frem 5′-GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 ‘og omvendt 5′-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3’

Kvantitativ real-time reverse transkriptase PCR

Total RNA blev. ekstraheret fra celler ved anvendelse af et RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter kvantificering ved spektrofotometri blev 5 ug totalt RNA revers transkriberet til opnåelse cDNA ved anvendelse af 160 pM deoxynukleotidtriphosphat, 50 ng af tilfældige hexamere primere og 200 enheder Superscript II ifølge producentens anbefalinger (Life Technologies). TaqMan prober for human RhoB, TRp, og 18S rRNA blev indkøbt fra Life Technologies. mRNA-niveauer blev bestemt ved real-time RT-PCR som tidligere beskrevet af Furuya

et al.

[18].

Western blot-analyse

Denne undersøgelse blev godkendt af etiske udvalg fra University of Yamanashi. Normal thyroid væv fra den modsatte lap af carcinomer blev opnået ved operation efter at patienterne gav skriftligt informeret samtykke. Dokumenterne vedrørende informeret samtykke, som blev godkendt af den etiske komité, blev holdt i universitetshospitalet opbevaringsskab. Normalt væv fra 4 af patienterne blev samlet til Western blotting eksperiment. Væv blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter resektion. Proteinlysater af normalt thyreoideavæv og cancercellelinier blev fremstillet ved anvendelse af cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology) ifølge producentens instruktioner. Membran-protein blev oprenset fra AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler ved anvendelse af en membran proteinoprensning kit (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA) ifølge producentens instruktioner. Bestemmelse af protein overflod ved Western blot-analyse blev udført som beskrevet [19] ved brug af de følgende primære antistoffer (1:500 fortynding): anti-RhoB og anti-phosphoryleret Rb (Cell Signaling Technology); anti PPARy, anti-p21, anti-tubulin, og anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX). Negativ kontrol siRNA og siRNA mod RhoB blev indkøbt fra Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, UK). Western blot analyse af siRNA-transficerede celler blev udført som følger: cancercellelinier (1,0-1,3 × 10

5) inficeret med adenovirus (MOI 30) blev inkuberet med T3 i 12 timer og derefter 50 nm af siRNA blev transficeret ind cellerne ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Efter 48 timer blev cellerne vasket med phosphatpufret saltvand (Ca

2 + /Mg

2 + -fri) og analyseret som beskrevet ovenfor.

immunpræcipitationsanalyse

for at analysere protein ekspression af TRp i celler, 500 ug protein lysat fra thyreoideavæv, HepG2 eller virus-transficerede skjoldbruskkirtlen cancercellelinier blev immunpræcipiteret med 5 pg af C3 muse monoklonalt antistof mod C-terminalen af ​​TRp (Santa Cruz Biotechnology) eller med 5 ug muse-IgG som angivet i teksten ved at anvende Dynabeads protein G immunoprecipitation kit (Life Technologies) ifølge fabrikantens protokol. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af et anti-TR-antistof (Santa Cruz Biotechnology) mod en N-terminal TRp peptid eller et anti-TRa-antistof (Santa Cruz Biotechnology) mod en N-terminal TRa peptid. Cellelysaterne af AdTRβ-inficerede celler blev immunopræcipiteret med Rhotekin RBD mærkede agaroseperler og overflod af GTP-bundne RhoB blev analyseret ved pull-down assay ved anvendelse RhoB aktivering assaykit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA).

Cell-cycle analysis

cellerne blev farvet med 20 ug /ml propidiumiodid (Life Technologies) og blev analyseret under anvendelse af en BD Biosciences FACS Calibur flowcytometer (Franklin Lakes, NJ) og Cell Quest software version 3.0. Procentdelen af ​​celler i G

1, S eller G

2 /M fase blev beregnet ved hjælp af ModFitLT version 3.1.

celledeling og invasion assays

Antallet af cellerne blev målt ved anvendelse af et ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Cell Counting Kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) som tidligere beskrevet af Furuya

et al

[19]. Cellulær invasion blev målt ved anvendelse af Cytoselect Cell Invasion assay kit (Cell Biolabs, Inc.) ifølge producentens anvisninger. Cellekulturmedium med 10% FBS blev anvendt som en kemoattraktant i den nedre brønd i kammeret. Efter rehydrering af basalmembranen, blev skjoldbruskkirtlen cancercellelinier podet i det øvre rum af kammeret i serum-frit medium (1 x 10

4 celler per brønd) med T3 eller FTI-behandling. Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade, og de celler, der havde invaderet membranen (8 um porestørrelse) for at nå den nedre overflade var farvet med CyQuant GR fluorescerende farvestof. Deres fluorescens blev analyseret ved 480 nm ved hjælp af en fluorescenspladelæser.

Xenografter af BHP18-21v celler og vektor injektion

BHP18-21v celler (1 x 10

7) blev transplanteret ind den abdominale subkutane væv 8 uger gammel mand nøgne mus (BALB /C

nu /nu

). Tre uger senere, når tumorerne havde nået ca. 1 cm i diameter, mus blev randomiseret til den eksperimentelle eller kontrolgruppe (6 mus pr gruppe). Fem × 10

8 plakdannende enheder af AdTRβ eller AdLacZ i 100 pi PBS blev injiceret i tumorerne. Adenovirus administration blev gentaget hver 7. dag. På hvert tidspunkt blev alle musene også injiceret intraperitonealt med 100 mg /kg /legemsvægt af FTI-277. På dag 30 blev musene aflivet ved CO

2 inhalation. Tumorer, der blev fjernet fra musene blev fikseret i 10% pufret formalin og indlejret i paraffin. Snit blev permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Serum fri T3 og TSH-niveauer blev bestemt ved anvendelse af den frie T3 ELISA-kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., CA) og en TSH assay kit (Uscn Life Science Inc, Wuhan, Kina), henholdsvis ifølge producentens anvisninger. Den institutionelle biosikkerhed udvalg universitetet i Yamanashi godkendte procedurer dyre- og brugen af ​​rekombinant DNA.

Statistik

Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs variansanalyse eller uparret 2-tailed Students

t

-test, og sandsynlighedsfordelinger værdier på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

at udforske TR funktion i kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation, vi fokuseret på analyse af RhoB, som er et mål for TR og udtrykkes ved meget lave niveauer i 130 menneskelige kræftceller [20]. For nærværende undersøgelse, brugte vi de 3 skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer, BHP18-21v, FRO og WRO, som blev inficeret med 30 MOI af AdTRβ eller AdLacZ. Vi analyserede først TRp proteinekspression i disse celler. Fem hundrede ug helcellelysat protein blev immunpræcipiteret med et monoklonalt antistof, som genkender TR C-terminale region, efterfulgt af Western blot analyse med et antistof mod en N-terminal TRp peptid. Som vist i fig. 1A, TR-ekspression tydeligt i de positive kontroller; intakt thyreoideavæv (bane 1) og HepG2-celler, som udtrykker funktionelle TR [21] (bane 2), og også i AdTRβ-inficerede BHP18-21v, FRO og WRO celler (bane 6-8). Nr TRp protein ekspression blev observeret i AdLacZ-inficerede BHP18-21v, FRO eller WRO celler (bane 3-5) eller i HepG2-celler, der blev immunpræcipiteret med et monoklonalt muse-IgG-antistof som negativ kontrol (bane 9). Tubulin ekspression i proteinet lysat (10 ug) blev også analyseret som en loading kontrol (fig. 1B). Vi analyserede også TRa ekspression i disse cellelysater ved Western blot-analyse af de immunopræcipiterede proteiner med et antistof mod en N-terminal TRa peptid. TRa ekspression blev observeret i de positive kontroller; thyreoideavæv og HepG2 (bane 1 og 2, henholdsvis). Nr TRa protein ekspression blev observeret i BHP18-21v, FRO eller WRO celler, som blev inficeret med AdLacZ (bane 3-5) eller AdTRβ (bane 6-8). Nedregulering af PPAR-ekspression og dets aktivitet anses for at være en mekanisme af skjoldbruskkirtlen carcinogenese [22]. Vi har derfor også analyseret protein udtryk for PPARy i BHP18-21v, FRO eller WRO celler (Fig. 1C). PPARy-ekspression blev reduceret i disse cancerceller sammenlignet med den for intakt thyreoideavæv men infektion med AdTRβ havde ingen virkning på ekspressionen af ​​PPARy i skjoldbruskkirtlen cancerceller. Disse data indikerer, at de tre AdTRβ eller AdLacZ inficerede testede cellelinjer er en god model for analyse af TRp funktion.

A. Western blot af cellelysater (500 ug) fremstillet fra normal thyroid væv, fra positive kontrolprøver HepG2-celler, eller fra skjoldbruskkirtlen cancercellelinier BHP18-21v, FRO og WRO som var inficeret med AdTRβ eller kontrollere AdLacZ virus. Lysater blev immunudfældet (IP) med 5 ug af det monoklonale muse-anti-TR-antistof (C3), der genkender TRp C-terminus, eller med 5 ug af normalt muse-IgG (IgG) som angivet. Blots blev probet med et antistof mod en N-terminal TRp peptid (TR) eller med et antistof mod en N-terminal TRa peptid (TRa). B. tubulin ekspression i totale cellelysater blev anvendt som en loading kontrol. C. Western blotting analyse af ekspressionsniveauet af PPARy-proteinet (øvre panel) i celleekstrakter (20 ug protein lysat). Tubulin blev også slettet som en belastning kontrol (nederste panel).

Vi analyserede næste effekten af ​​T3 behandling af AdTRβ- eller AdLacZ-inficerede kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer på RhoB udtryk (fig. 2A-C ). T3-behandling (30 nM) på AdTRβ-inficeret (bane 1-4), men ikke af AdLacZ-inficerede (bane 5-7) BHP18-21v, FRO og WRO celler til 6, 12 eller 24 timer forbedret betydeligt ekspressionen af ​​RhoB mRNA i en tidsafhængig måde sammenlignet med ikke-behandlede ikke-viralt inficerede celler. Endvidere Western blotting-analyse viste, at T3-behandling i 12 eller 24 timer induceret RhoB proteinekspression i AdTRβ-inficerede BHP18-21v, FRO og WRO celler, men ikke i AdLacZ-inficerede celler (fig. 2D-F, bane 2-4 og banerne 5-7 henholdsvis). Således induktion af RhoB mRNA og proteinekspression er T3 /AdTRβ-afhængig i skjoldbruskkirtlen cancercellelinier.

Ekspressionsniveauer af RhoB mRNA (A-C) eller protein (D-F) i AdTRβ-inficerede, kontrol AdLacZ-inficeret eller ikke-inficeret kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer udsat for 30 nM T3 til 0, 6, 12 eller 24 timer som angivet. (A-C) Ekspressionen af ​​RhoB og 18S mRNA blev bestemt ved hjælp af real-time RT-PCR med 100 ng cDNA. Relativ mRNA-ekspression blev bestemt ved vilkårligt at sætte værdien for kontrol virusinficerede celler inkuberet i T3-frit medium til 1. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. (

n

= 6). *,

s

0,05. (D-F) Western blot-analyse af 20 ug protein lysater af cellerne blev udført under anvendelse af antistoffer mod RhoB (øvre panel) eller tubulin (nederste panel), der blev anvendt som en loading kontrol.

for at klarlægge de mekanismer, hvorigennem ligand bundet TRp forbedrede udtryk for RhoB i AdTRβ-inficerede BHP18-21v, FRO og WRO celler, vi analyserede effekten af ​​T3 behandling af disse cellelinjer på transkriptionelle aktivitet RhoB promotoren. AdTRβ- eller kontrol AdLacZ-inficerede celler blev derfor transient transficeret med RhoB promotor-luciferase-reporterkonstruktion, -726 /+ 86 RhoB-Luc. Luciferaseaktivitet drevet af RhoB promotoren blev signifikant forøget i AdTRβ-inficerede celler, men ikke i AdLacZ-inficerede celler efter T3-behandling (fig. 3A-C).

(A-C) RhoB promotor-luciferase reporter assays. Adenovirus-inficerede BHP18-211v (A), FRO (B), eller WRO (C) -celler blev transficeret med 1 ug af en RhoB promotor-luciferase-reporterplasmid og blev inkuberet i yderligere 24 timer i fravær eller nærvær af 30 nM T3. Relativ promotoraktiviteter (Luciferaseaktivitet) blev bestemt ved vilkårligt at sætte værdien for kontrol virusinficerede celler inkuberet i T3-frit medium til 1. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. (

n

= 6). *,

s

0,05. (D-F) chips under anvendelse AdTRβ-inficerede BHP18-211v (D), FRO (E), eller WRO (F) celler behandlet med eller uden 30 nM T3. Antistoffer, der genkender histone3 (H3), acetylerede H3, HDAC1, HDAC3 eller normalt kanin IgG blev anvendt til immunfældning af kromatin. Indgang indikerer 10% af kromatin. PCR-produkter blev separeret på en 2% agarosegel.

Transkription af RhoB promotoren inhiberes af transkriptionelle repressorer, der rekrutterer histondeacetylaser (HDAC) til fjernelse af acetylering af lysinrester på histones3 (H3) haler [23]. Det er velkendt, at acetyleringen status af halen domæner af histones3 (H3) ændring under transkriptionel aktivering af RhoB promotoren [24]. For at bestemme om induktionen af ​​RhoB genekspression ved ligand-bundne TRp korrelerer med ændringer i acetylering status H3 i promotorregionen af ​​RhoB genet, blev kromatin immunopræcipitation (chip) assays. AdTRβ-inficerede BHP18-21v, FRO eller WRO celler blev inkuberet med eller uden T3 i 24 timer og chip assays blev udført under anvendelse af antistoffer til H3, acetyleret H3, HDAC1 og HDAC3. Som vist i fig. 3D-F, H3 blev fundet i fragmenter af RhoB promotoren (bane 3) i AdTRβ-inficerede celler med eller uden T3-behandling. Imidlertid blev HDAC1 og HDAC3 forbundet med fragmenter af RhoB promotoren, når cellerne blev inkuberet uden T3, og ikke når cellerne blev inkuberet med T3 (HDAC1 /3; bane 5 og 6, henholdsvis). I overensstemmelse med disse resultater, blev der ikke acetyleret H3 forbundet med promotoren i fravær af T3 behandling, hvorimod i nærvær af T3, blev H3, der var forbundet med promotoren stærkt acetyleret (bane 4). Disse resultater indikerede, at ligand-bundne TRp induceret RhoB transkription via ændring af histonacetylering status skjoldbruskkirtlen cancerceller.

Vi analyserede næste virkningen af ​​ligand-bundne TRp på den cellulære lokalisering og funktion af RhoB. Til dette formål anvendte vi agenten FTI. FTI behandling af celler inducerer membranen sammenslutning af RhoB ved modifikation af RhoB gennem tilsætning af lipiddele [4]. Membran sammenslutning af RhoB er vigtig for dets aktivitet. Vi først bestemmes virkningen af ​​5 uM FTI behandling på RhoB proteinekspression i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler, der var behandlet med eller uden T3 (30 nM). Western blotting af helcellelysater af behandlede /ubehandlede AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler med RhoB antistof (fig. 4A) indikerede, at FTI-behandling ikke ændrede T3 induktion af RhoB ekspression (bane 2 og 4) og ikke forbedre RhoB protein udtryk i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler i fravær af T3-behandling (bane 3).

AdTRβ-inficerede BHP18-211v celler blev udsat til 30. nM T3 og /eller 5 uM i farnesyltransferaseinhibitor ( FTI) i 24 timer og blev derefter analyseret som følger. A. Western blotting-analyse af ekspressionsniveauet af RhoB protein (øverste felt) i celleekstrakter (20 ug protein lysat). Tubulin blev også blottet som en loading kontrol (nederste panel). B. Cellelysater blev immunpræcipiteret med Rhotekin RBD-mærkede agaroseperler. GTP-bundet RhoB i præcipitaterne blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af et antistof mod RhoB. C. Western blotting-analyse af RhoB protein i fraktion membranproteinet. GAPDH blev blottet som et membranprotein markør loading kontrol (nederste panel).

Vi analyserede derefter effekten af ​​T3 behandling med /uden FTI co-behandling på RhoB aktivitet. Ligesom andre små GTPaser, RhoB regulerer molekylære begivenheder ved at cykle mellem en inaktiv BNP-bundne form, og en aktiv GTP-bundet formular. I den aktive GTP-bundne form RhoB binder specifikt til Rho-bindende domæne (RBD) af Rhotekin at regulere downstream signalleringskaskader. Vi analyserede derfor den overflod af GTP-bundne RhoB i cellelysater af AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler, der var behandlet med eller uden T3 og /eller FTI ved immunopræcipitation af cellelysater med Rhotekin RBD-mærkede agaroseperler efterfulgt af immunoblotting for RhoB ( fig. 4B). Disse pull-down assays indikerede, at ikke kun den overflod af RhoB men også den overflod af den aktive GTP-bundne form af RhoB i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler blev styrket ved T3-behandling (bane 2) og kraftigt af FTI og T3 co-behandling (bane 4). Nr GTP-bundne RhoB blev detekteret i FTI-behandlede celler uden T3-behandling (bane 3). Disse resultater viste, at ligand-bundne AdTRβ-induceret RhoB protein i BHP18-21v celler var en aktiv kinase, hvis aktivitet blev forbedret ved co-behandling med FTI.

For at afgøre, om T3 og FTI kunne fremkalde membran sammenslutning af RhoB i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler blev celleoverfladeproteiner biotinyleret. Biotinylerede proteiner i cellelysater blev derefter trukket ned med streptavidinkugler og analyseret ved immunoblotting med et anti-RhoB antistof (fig. 4C). T3-behandling inducerede ekspressionen af ​​RhoB på cellemembranen (bane 2), der var betydeligt større, samtidig behandling med FTI (bane 4). FTI-behandling forstærkede ikke RhoB proteinekspression på cellemembranen af ​​AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler i fravær af T3-behandling (bane 3). Disse resultater indikerede, at T3-induceret membran sammenslutning af RhoB som blev styrket ved FTI co-behandling og var i overensstemmelse med T3 induktion af RhoB aktivitet i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler.

cyclin-afhængig kinase (CDK ) inhibitor, p21, er en negativ regulator af cellecyklus-progression og er en af ​​de nedstrøms mål for RhoB. For at bekræfte aktiviteten af ​​RhoB i AdTRβ-inficerede BHP18-21v celler behandlet med T3 og /eller FTI analyserede vi proteinet ekspression af p21 ved Western blot analyse (fig. 5A-C). p21-ekspression blev analyseret i celler transficeret med RhoB målrettet eller kontrol siRNA at bekræfte RhoB afhængighed af p21changes. Tre skjoldbruskkirtlen cancerceller blev for-dyrket i T3-frit medium med strippet serum, som beskrevet i “Materialer og metoder”. FTI-behandling forstærkede ikke p21-protein ekspression i siRNA-kontrol AdTRβ-inficerede celler uden T3-behandling (bane 2). I AdTRβ-inficerede celler, blev ekspressionsniveauet af p21 steg i celler behandlet med T3 (bane 3) og er stærkt forøget ved co-behandling med FTI (bane 4) sammenlignet med ikke-behandlede celler (bane 1). Imidlertid blev p21 ikke induceret af T3 plus FTI behandling af AdTRβ-inficerede celler 24 timer efter transfektion med RhoB målrettet siRNA (bane 5). p21 inhiberer aktiviteterne i CDK’er, hvilket fører til hypo- phosphorylering af retinoblastoma protein (Rb), som igen forårsager celle-cellecyklusstandsnings ved G0 /G1-fasen [25]. Vi analyserede phosphoryleringen af ​​Rb (p-Rb) i AdTRβ-inficerede thyreoideacancer celler behandlet med T3 og /eller FTI [(fig. 5 (A-C)). Rb blev phosphoryleret i AdTRβ-inficerede BHP18-21v, FRO eller WRO celler med eller uden T3-behandling (bane 1 og 3). FTI-behandling alene ikke hæmme phosphorylering af Rb i AdTRβ-inficerede celler (bane 2). Rb-phosphorylering blev signifikant reduceret i AdTRβ-inficerede celler ved co-behandling med T3 og FTI (bane 4). På den anden side blev inhibering af Rb-phosphorylering ikke observeret af T3 plus FTI behandling af AdTRβ-inficerede celler efter transfektion med RhoB målrettet siRNA (bane 5).

(A-C) Western blot-analyse af den ekspressionsniveauet af p21 eller den phosphorylerede Rb protein i AdTRβ-inficerede BHP18-21v (A), FRO (B), eller WRO (C) celler, der blev udsat for 30 nM T3 alene i 12 timer eller 30 nM T3 plus 5 uM FTI i 12 timer med eller uden siRNA knockdown af RhoB som angivet. Tubulin blev blottet som en loading kontrol (nederste paneler). (D-F) Procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1, S eller G

2 /M fase blev beregnet ved anvendelse ModFitLT version 3.1. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. (

n

= 6). *,

s

. 0,05

Vi yderligere studeret cellecyklus faser af disse celler ved hjælp af flowcytometri (fig 5D-F.). I si-kontrol AdTRβ-inficerede celler, behandling med T3 plus FTI inducerede en signifikant stigning i G0 /G1 fasen population sammenlignet med ikke-behandlede eller T3-behandlede celler, mens der i RhoB målrettet siRNA-transficerede celler, T3 + FTI behandling havde ingen effekt på cellepopulationen i G0 /G1-fasen. Endvidere behandling med T3 plus FTI reducerede antallet af celler i G2 /M-fasen i si-styre- men ikke i RhoB målrettede siRNA-AdTRβ-inficerede celler. Disse resultater indikerer, at den forøgede RhoB ekspression i AdTRβ-inficerede kræftceller, der blev behandlet med T3 og FTI, blev ledsaget af forøget ekspression af p21 og inhibering af cellecyklus-progression.

For at bekræfte, at de observerede ændringer i p21-ekspression afspejlede ændringer i celleproliferation, vi næste analyseret virkningerne af TRp på cancercelleproliferation anvendelse af MTT-assayet. Til dette assay blev BHP18-21v, FRO eller WRO celler inficeret med 30 MOI AdTRβ og, efter 12 h inkubation i adenovirus-holdigt medium, blev cellerne dyrket med eller uden T3 (30 nM) og 5 uM FTI for 24 eller 72 timer. Efter 24 og 72 timers inkubation celleantal steget i fravær af T3-behandling, men blev reduceret i nærvær af T3 og var signifikant reduceret i nærvær af T3 plus FTI (fig. 6A-C).

(A-C), Cell proliferationsassay. BHP18-21v (A), blev FRO (B) eller WRO (C) celler inkuberet i T3-udtømte medium i 24 timer og blev derefter inficeret med 30 MOI AdTRβ. Cellerne blev derefter inkuberet i medium med T3 og /eller FTI i yderligere 24 eller 72 timer. Relative celleantal blev bestemt ved vilkårligt at sætte værdien for kontrolkulturer inkuberet i T3-frit medium til 1. Data er udtrykt som middelværdier ± S.D. (

n

= 6). Som vist i fig.