PLoS ONE: miR-345 i metastaserende kolorektal cancer: en ikke-invasiv biomarkør for Klinisk Outcome i ikke-KRAS Mutant Patienter behandlet med 3. Linje Cetuximab og Irinotecan

Abstrakt

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) har vigtige regulatoriske funktioner i cellulære processer og har vist lovende potentiale som prognostiske markører for sygdommen resultat hos patienter med cancer. Formålet med denne undersøgelse var at finde miRNA udtryk profiler i fuldblod, der var prognostiske for samlet overlevelse (OS) i patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC) behandlet med cetuximab og irinotecan.

Metoder

fra 138 patienter med mCRC i 3

rd linje behandling med cetuximab og irinotecan i et prospektivt fase II studie blev 738 forbehandling miRNA isoleret og profileret fra fuldblod ved hjælp af TaqMan MicroRNA Array v2.0. Mutation status

KRAS, BRAF, og PI3KCA

var kendt

Resultater

Efter Bonferroni justering, 6 miRNA:. (MIR-345, mir-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p og miR-324-3p), blev fundet i forbindelse med korte OS. miR-345 var den stærkeste prognostiske miRNA, signifikant i den fulde kohorte og i ikke-

KRAS

mutant befolkning. miR-345, som en kontinuerlig variabel i den fulde kohorte, resulterede i en hazard ratio (HR) på 2,38 pr IQR (CI 95%: 1,8-3,1,

P

værdi = 2.86e-07, Bonferroni justeret, univariable analyse) og en HR = 1,75 pr IQR (CI 95%: 1,24-2,48,

P

-Wald = 1.45e-03) i multivariable analyse justeret for køn, alder, KRAS, PI3KCA og performance status. miR-345 var prognostisk i progressionsfri overlevelse (PFS) med en HR = 1,63 pr IQR (CI 95%: 1,25 til 2,114,

P

-Wald = 2.92e-4) i multivariable analyse. Desuden blev høj miR-345-ekspression er forbundet med manglende respons på behandling med cetuximab og irinotecan.

Konklusion

Vi identificerede miR-345 i fuldblod som en potentiel biomarkør for kliniske resultat. MIR-345 var en enkelt prognostisk biomarkør for både OS og PFS hos alle patienter, og også i den ikke

KRAS

mutant befolkning

Henvisning:. Schou JV, Rossi S, Jensen BV, Nielsen DL, Pfeiffer P, Høgdall E, et al. (2014) miR-345 i metastaserende kolorektal cancer: en ikke-invasiv biomarkør for Klinisk Outcome i ikke-KRAS Mutant Patienter behandlet med 3

rd Linje Cetuximab og Irinotecan. PLoS ONE 9 (6): e99886. doi: 10,1371 /journal.pone.0099886

Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, Frankrig

Modtaget: Februar 3, 2014 Accepteret: 20 maj 2014; Udgivet: 18 juni 2014

Copyright: © 2014 Schou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra forskningsrådet på Herlev Hospital, det danske Indenrigs- og Sundhedsministeriet, Merck-Serono Danmark /Sverige, og den Europæiske Union syvende rammeprogram [FP7 /2007-2013] under tilskudsaftale nr 222.916 (givet til MK). ST er en ledende klinisk investigator for fonden for videnskabelig forskning Flandern og er støttet af den belgiske Kræftplan. ST og SR er også støttet af Fonden Fournier-Majoie, FFMI, Belgien. MD understøttes delvist af den schweiziske National Science Foundation (SNF, https://www.snf.ch/E/; Grant No. 320030_135421); Krebsforschung Schweiz (KFS, https://www.krebsforschung.ch/; Grant No. 02697-08-2010); og af Fondation Medic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. MK ansat på AROS Applied Biotechnology. Virksomheden har ikke nogen økonomisk interesse og patenter, der er involveret i denne publikation. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den 3

rd mest almindelige kræftform i verden. Tyve procent af patienter diagnosticeret med CRC har metastatisk sygdom og yderligere 30-35% vil udvikle metastaser senere i løbet af deres sygdom [1], [2].

Cetuximab, et IgG1 monoklonalt antistof rettet mod den epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), har vist effekt i kombination med kemoterapi i patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC), men ikke hos patienter med

KRAS

mutationer, [3], [4], som ses i omkring 40% af patienterne med CRC. Men kun en delmængde af patienter med

KRAS

vildtype (wt) vil drage fordel af cetuximab. Således er der et stort behov for at identificere nye biomarkører for behandling respons på cetuximab i undergruppen af ​​patienter med mCRC og

KRAS

.

I løbet af de sidste par år, har der været en hastigt voksende interesse i microRNA (miRNA) som potentielle nye biomarkører hos patienter med cancer. MiRNA er små endogene ikke-kodende RNA’er med 19-22 nukleotider regulering af genekspression på posttranskriptionel niveau. Til dato har mere end 2000 menneskelige miRNA sekvenser blevet identificeret, og antallet er stigende [5]. MiRNA har vigtige regulatoriske funktioner i basale cellulære processer og fungerer som onkogener og tumor-suppressor gener [6]. MiRNA er involveret i kræft disposition, udvikling og progression gennem gen deregulering og /eller enkeltnukleotidpolymorfi. MiRNA i en cancer indstilling kan klassificeres på grundlag af deres vigtigste funktioner:. OncomiR, metastamir, apoptomir, hypoxamir og angiomir

Cirkulerende miRNA kan let opsamles og

synes meget stabilt under barske forhold, lang opbevaringstid og efter multiple fryse-tø cykler.

[7]

,

[8]

Desuden

en blodprøve er mere praktisk og mindre invasive for patienterne end en biopsi.

Ud over at have et diagnostisk potentiale, [9], [10], [11] bestemte miRNA har vist sig at være prognostisk. Serum MIR-141 blev foreslået som et prognostisk biomarkør for patienter med CRC [12] og serum MIR-21 som en diagnostisk og prognostisk biomarkør i CRC. [13]

Formålet med den foreliggende prospektive biomarkør undersøgelse var at vurdere, om profiler af

miRNA i fuldblod var prognostisk for samlet overlevelse og klinisk resultat hos patienter med mCRC før 3

rd linje behandling med cetuximab og irinotecan.

Metoder

patienter og behandling

i en prospektiv fase II studie designet til at evaluere effekten af ​​cetuximab og irinotecan som 3

rd line behandling hos patienter med mCRC, forbehandling fuldblod miRNA udtryk blev målt i 143 patienter. Alle patienter var resistente over for 5-FU, oxaliplatin og irinotecan og behandlet med irinotecan (180 mg /m

2) og cetuximab (500 mg /m

2) hver anden uge [14]. Patienterne blev inkluderet fra tre danske sygehuse fra oktober 2006 til oktober 2008 og behandlet indtil sygdomsprogression og fulgt indtil døden eller 1. september 2012.

Etik Statement

Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen blev godkendt af den regionale etiske komité under den danske Komité for Health Research Ethics (VEK ref. KA-20.060.094, www.cvk.sum.dk).

KRAS

,

BRAF

PI3KCA

Mutation status

Fra alle patienter blev formalin fikseret paraffin indlejrede (FFPE) væv blokke, der repræsenterer tumoren valgt. De FFPE væv blev skåret i 3-4 mikrometer sektioner og farvet med hematoxylin og eosin (H Hochberg metode (FDR 5%) blev udført for at bestemme differentielt udtrykte miRNA mellem klasser af prøver (

KRAS, BRAF, PI3KCA

, dobbelt vægt, klinisk fordel, performance status)

Univariable og. multivariable overlevelse analyser blev udført ved hjælp af den proportionale farer Cox regression (pakke “overlevelse” i R). Vi rapporterede single-test og Bonferroni-justeret

P

-værdier baseret på antallet af testede i univariable samlet overlevelse (OS) og progressionsfri overlevelse (PFS) regressionsmodeller miRNA. En bootstrap procedure (150 bootstraps som standard for denne procedure) fra regression modellering strategi blev udført for at validere de monterede miRNA baseret Cox overlevelse modeller (R bibliotek rms), blev konkordanslinier sandsynligheder beregnet ved udarbejdelsen af ​​de standard fejl (blandt andre tilgængelige statistik) mellem re-samplede monteret model og den oprindelige model ved hvert bootstrap skridt. Den konkordans foranstaltning udgør en sandsynlighed, den måler, hvor godt vores model skelner mellem forskellige svar, hvor C = 0,5 underforståede nogen prædiktiv evne. . I vores tilfælde, C 0,5 betyder, at at specifikke miRNA er en god indikator

Multivariabel overlevelse analyse blev udført med følgende variable: miRNA (som kontinuerte variable), køn,

KRAS

,

PI3KCA

og alder (dikotomiseret af median = 63 år).

BRAF

blev udelukket fra multivariabel analyse på grund af det lave antal af muterede patienter med begivenheder (n = 2). Udtrykkene af kontinuerlige miRNA blev dikotomiseret i høj og lav risiko ved medianen af ​​udtrykket værdier for visualisering i Kaplan-Meier plot. Kaplan-Meier tal blev rapporteret for hver monteret overlevelse model med mindst en statistisk signifikant miRNA. De Kaplan-Meier tal viser også Hazard Nøgletal (HR), konfidensintervaller (CI) og ukorrigerede Wald

P

-værdier fra Cox regressionsmodeller for specifikke parvise sammenligninger af interesse. Hazard forhold mellem kontinuerlige variabler præsenteres i interkvartile range (IQR) enheder.

Target og Pathway Analyse

For at identificere molekylære veje potentielt ændret ved ekspression af en enkelt eller flere miRNA, vi brugte Diana -mirPath software, [23] en webbaseret beregningsmæssige værktøj. Softwaren udfører en berigelse analyse af target gener af flere miRNA ved at sammenligne dem til alle Kegg veje.

De databaser, der anvendes var TarBase (www.microrna.gr/tarbase) eller microT-CDS (www.microrna. gr /microT-CDS).

Resultater

kliniske karakteristika og Mutation status for de patienter

Efter kvalitetsvurdering, prøver fra fem patienter blev kasseret. Baseline kliniske karakteristika og distribution af

KRAS, BRAF,

PI3KCA

mutation status af de resterende 138 patienter med mCRC inkluderet i nærværende biomarkør undersøgelsen er anført i tabel 1. Alle patienter blev behandlet uden viden om deres mutationsstatus.

miR-345 var Prognostisk for total overlevelse

Et hundrede og tredive to (95%) patienter var døde på tidspunktet for opfølgning (i september 2012). Median samlet overlevelse af patienterne var 10,6 måneder (95% CI: 2.1-38.2 måneder). blev ikke observeret nogen forskel i OS mellem de 3 centre

Efter justering med Bonferroni-metoden, vi fundet seks prognostiske miRNA:. høj ekspression af miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628- 5p, miR-886-3p og lav ekspression af miR-324-3p var forbundet med kort OS (tabel 2). De Kaplan-Meier grunde til de seks prognostiske miRNA er vist i figur 1.

Patienter blev dikotomiseret af medianen udtryk værdi for miR-345. Lav miRNA ekspression (rød) og høj miRNA ekspression (blå).

P

-værdi refererer til Wald test

En komplet liste over miRNA prognostisk til OS før Bonferroni korrektion i tabel S1 i filen S1 – a. alt 64 miRNA ud af 372 var prognostisk, 50 med højere udtryk forbundet med dårligere prognose og 14 med lavere udtryk forbundet til dårligere prognose, ingen af ​​kontrollerne (U6, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 og RNU6B) var prognostisk. En vulkan plot, der viser Z-score som beregnet af Cox regressionsanalyse og ukorrigeret p-værdi, er vist i figur S5 i fil S1

Multivariable overlevelse analyse udførtes med følgende variable:. MIR-345, miR- 143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p, miR-324-3p, køn,

KRAS, PI3KCA

og alder (dikotomiseret af median = 63 år). Resultaterne er rapporteret i tabel 3.

I OS, MIR-345 og MIR-324-3p var de eneste to miRNA, der var statistisk signifikant i både multivariabel analyse og den univariable analyse. Performance-status og

KRAS

var også betydelige faktorer i multivariable analyse, selv om

KRAS

var borderline signifikant som en univariat faktor (HR = 1,36, CI 95%: 0,94-1,97).

miR-345 som en enkelt miRNA Marker for Klinisk Outcome

mIR-345 var også prædiktiv for PFS, HR ved IQR = 1,7, (CI 95%: 1,31-2,2, justeret Bonferroni

P

-værdi = 0,021). Udover at være signifikant til OS i hele kohorten, miR-345 var statistisk signifikant i alle overlevelse modeller for undergrupper af patienter med vægt på

KRAS

,

BRAF

,

PI3KCA

og dobbelt vægt for kombinationerne,

KRAS

+

BRAF

KRAS

+

PI3KCA,

se tabel S2-6 i filen S1. miR-345 var prognostisk til OS i

BRAF

+

PI3KCA

vægt gruppe og i den tredobbelte vægt gruppe (

BRAF

wt +

KRAS

vægt +

PI3KCA

vægt), men ikke i den i PFS analyser. Vi sammenlignede den tilgængelige mutationsstatus i kombination med MIR-345-ekspression med hensyn til OS (figur 2) og PFS (figur 3).

(A) Patienter blev dikotomiseret af

KRAS

mutation status og mIR-345. (B) Patienter blev dikotomiseret af

BRAF

wt mutationer status og miR-345. (C) Patienter blev dikotomiseret af

PI3KCA

mutation status og miR-345. (D) Patienter blev dikotomiseret ved at dobbeltklikke vægt mutation status og miR-345.

P

-værdi refererer til Wald test.

Patienter blev dikotomiseret ved lav miR-345-ekspression (rød) og høj miR-345-ekspression (blå). (A) Patienter blev dikotomiseret af medianen udtryk værdi for miR-345. (B) Patienter blev dikotomiseret af

KRAS

mutationer status og miR-345. (C) Patienter blev dikotomiseret af

BRAF

WT mutationer status og miR-345. (D) Patienter blev dikotomiseret af

PI3KCA

mutationer status og miR-345. (E) Patienter blev dikotomiseret ved at dobbeltklikke vægt mutation status og miR-345.

P

-værdi refererer til Wald test.

monteret Cox modeller blev valideret af resampling procedure. Modellen er monteret på miR-345 og OS viste god overensstemmelse, højere end alle andre analyserede miRNA i OS (Figur S6 i filen S1).

Vi kontrolleres også, om miR-345-ekspression var forbundet med respons på behandling og klinisk fordel. Vi kunne se, at højere ekspression var forbundet med manglende respons (figur 4). For at analysere dette yderligere, vi begrænset vores sæt patienter til dem med et partielt respons (n ​​= 24) og progressiv sygdom (n = 37) i bedste samlede respons. Vi sammenlignede derefter antallet af patienter med en lavere og højere miR-345-ekspression ifølge medianen udtryk for miR-345 og opnåede en signifikant sammenhæng mellem miR-345 udtryk og respons på behandling med en odds ratio på 5,37 (

P

værdi = 0,004; 95% CI: 1,56-20,94)

Hvis vi begrænser vores sæt patienter til dem med delvis respons (n ​​= 24) og progressiv sygdom (n = 37), a. signifikant sammenhæng mellem miR-345 udtryk og respons på behandlingen blev opnået med en odds ratio på 5,37, (

P

-værdi = 0,004 og 95% CI: 1,56-20,94).

Pathway og Target Analysis

for at identificere molekylære veje forbundet til ekspression af de seks miRNA prognostiske til OS (miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886- 3p, mIR-324-3p), testede vi Kegg pathways. Blandt de statistisk signifikante dem, kolorektal cancer (Kegg pathway hsa05210) var til stede på grund af de forudsete vekselvirkninger mellem disse miRNA og følgende målgener:. TCF4, APC, Smad4, MAPK8, PIK3CG, PIK3CD, DCC, PIK3CG, PIK3CA og MAPK1

diskussion

i første og senere linjer af behandling af patienter med mCRC tillæg af cetuximab til kemoterapi kan være gavnligt hos patienter uden mutationer i

KRAS

BRAF

[24], [25], [26]. Men nyere undersøgelser der undersøger cetuximab i første linje mCRC, kunne ikke bekræfte en fordel i PFS og OS i

KRAS

wt patienter. [27], [28]. Der er behov for mere præcise biomarkører eller paneler af biomarkører. Den foreliggende prospektive biomarkør undersøgelse blev udført for at identificere prognostiske miRNA i fuldblod fra patienter med mCRC behandlet med 3

rd line cetuximab og irinotecan.

Vores undersøgelse tyder på en potentiel rolle af cirkulerende miRNA at tjene som biomarkører for kliniske resultat hos patienter med mCRC. Vi fandt, at miR-345 var prognostisk til OS i alle vores patienter med mCRC og i

KRAS

wt patienter, med høj ekspression forbundet med kortere overlevelse. Multivariable analyse viste, at miR-345 var en stærk faktor, der føjes prognostiske oplysninger til de andre tilgængelige clinicopathologic og mutation variabler. Tumorbyrde er en kombination af tumorstørrelse og antallet af metastatiske steder. Data om tumor størrelse var ikke tilgængelige for os, og derfor tumorbyrde kunne ikke indgå i den multivariable analyse. Vi har dog omfatte en repræsentativ liste over kovariater, der betragtes som prognostiske faktorer for patienter med mCRC behandlet med cetuximab.

MIR-345 var statistisk signifikant for alle wt undergrupper analyseres. Eftersom alle patienter blev behandlet med cetuximab, kan vi ikke udlede, om MIR-345 var en prognostisk biomarkør (uafhængig af behandling modtaget patienterne) eller en biomarkør forudsige følsomhed over for behandling med cetuximab og irinotecan, men vi fandt, at dens højere ekspression blev forbundet med manglende af respons på behandlingen. I den isolerede gruppe af respondenter versus ikke-respondenter, blev en høj miR-345-ekspression signifikant associeret med en 5 gange risiko for progressiv sygdom som bedste samlede respons. Disse resultater er hidtil ukendte fund og foreslå, at dette miRNA er prognostisk og kan være en potentiel biomarkør for respons hos patienter med mCRC behandlet med cetuximab og irinotecan.

Cirkulerende MIR-345 har så vidt vides, ikke tidligere blevet beskrevet i forbindelse med CRC, men Tang og kolleger rapporterede, at et lavt niveau af mIR-345 i CRC væv er forbundet med lymfeknudemetastaser, værre histologisk type og opreguleres i kolorektale cancercellelinjer efter behandling med 5-aza-dc [29 ]. Endvidere DNA-methylering niveauer i promotorregionen af ​​MIR-345 er højere i CRC væv sammenlignet med normal colon væv og tilsvarende ikke-cancervæv, antyder, at denne miRNA er en methylering følsom tumor suppressor [29].

i vævsprøver, mIR-345 er prognostisk hos patienter med brystcancer [30]. Selvom validering i eksterne kohorter ikke var statistisk signifikant, miR-345 var den eneste miRNA at forblive prognostisk i en multivariable model, der tegner sig for de vigtigste kliniske parametre [30].

Det vides ikke, hvorfor der er en uoverensstemmelse mellem miRNA ekspression i væv og blod fra patienter med CRC. Kun få studier har sammenlignet miRNA udtryk i tilsvarende vævs- og blodprøver. Begrænset overlapning ses mellem miRNA differentierende lungekræft prøver fra normale lunge vævsprøver og plasma miRNA differentierende patienter med aggressiv vs. ikke-aggressiv lungekræft. [31] MIR-345 blev fundet faldt i CRC væv i et relativt lille undersøgelse af 26 CRC vævsprøver, hvor kun 5 patienter havde metastatisk sygdom. [29] En lav koncentration MIR-345 i overvejende lokaliseret CRC væv kan ikke være sammenlignelig med høj koncentration af cirkulerende MIR-345 i metastaserende CRC. Det samme miRNA kan være tumor-relaterede på forskellige måder, afhængigt af, hvis det er fundet i tumoren eller som et cirkulerende miRNA.

MIR-143 er ned- reguleret i CRC tumorprøver i sammenligning med normalt væv . [32], [33], [34]

KRAS

kan være et mål for miR-143 [35], og niveauer af miR-143-ekspression i CRC tumorprøver er en prognostisk biomarkør i

KRAS

wt patienter, men ikke en prædiktiv markør for anti-EGFR behandling. [36] Cirkulerende mIR-143 er blevet testet som diagnostisk markør i CRC patienter, men er ikke signifikant dereguleret sammenlignet med normale kontroller. [37] mIR-324- 3p er ikke blevet beskrevet i CRC, men er forskelligt udtrykt i plasma fra patienter med brystkræft sammenlignet med raske kontroller. [38].

styrken i vores undersøgelse var den relativt store stikprøvestørrelse, bootstrap procedure (resampling validering af Cox regression model), og en streng statistisk metode kun bruger miRNA justeret i overensstemmelse med Bonferroni korrektion. Det næste skridt bliver at validere disse betydelige miRNA i fuldblod fra en anden kohorte af patienter med mCRC behandlet med cetuximab og irinotecan. På nuværende er tilgængelige fra afsluttede fase III studier ikke sådanne prøver.

Ingen studier har undersøgt, om miRNA udtryk i fuldblod har et potentiale som prognostiske eller prædiktive biomarkører hos patienter med mCRC behandlet med cetuximab og irinotecan. De fleste studier, der undersøger cirkulerende miRNA har brugt plasma eller serum. [39], [40] miRNA udtryk profiler i fuldblod indsamlet i PAXgene RNA rør er beskrevet i patienter med hæmatologiske sygdomme, pankreatisk og lungecancer [41], [42] og har fordele i forhold til miRNA i serum /plasma på grund af højere udbytte [43] af miRNA og færre metodologiske problemer [44]. MiRNA fundet i perifert fuldblod kan stamme fra kræftceller, men også fra ikke-kræft celle såsom leukocytter, trombocytter og monocytter. De kan være i blodet bundet til proteiner som AGO [45] og HDL [46] eller pakket i exosomer. [47] De prognostiske miRNA, der findes i vores gruppe patienter, kan skyldes tumorprogression, en inflammatorisk respons eller som en reaktion på organsvigt.

for nylig Shen og kolleger rapporteret, var, at EGFR involveret i undertrykkelsen af ​​specifikke miRNA modning i afhængighed hypoxisk stress. [48] den foreslåede mekanisme var at en EGFR gennem phosphorylering af AGO2, forårsagede en reduktion af DICER /AGO2 bindende [48] herved hæmme modningen af ​​pre-miRNA med lange loop konfiguration. Hæmning af EGFR kan også forårsage intracellulær miRNA regulering og transportere nogle af de ændrede miRNA i blodet, og derved fungere som et cirkulerende respons på EGFR handlinger.

Konklusion

Vi identificerede seks cirkulerende miRNA i fuldblod som prognostiske markører til OS. miR-345 var en enkelt biomarkør til OS hos alle patienter og i undergrupper af patienter med

KRAS

wt og

KRAS + BRAF

dobbelt vægt. Endvidere blev miR-345 signifikant associeret med PFS og bedste samlede respons og kan være en potentiel biomarkør for kliniske resultat hos patienter med mCRC behandlet med 3

rd line cetuximab og irinotecan.

Støtte oplysninger

fil S1.

indeholder følgende filer:. Figur S1, figur S2, figur S3, figur S4, tabel S1, tabel S2, tabel S3, Bord S4, tabel S5, tabel S6, figur S5, figur S6

doi: 10,1371 /journal.pone.0099886.s001 Hotel (DOCX)

tak

Vi takker Nina Dahl Kjersgaard og Beata Gregersen, Herlev Hospital for fremragende teknisk bistand. Birgitte Christiansen, Trine S. Rasmussen og sygeplejerskerne og teknikere på Klinisk Forskningsenhed og Enhed for Eksperimentel behandling på Herlev Hospital, Odense Sygehus og Aalborg Sygehus takkes for fremragende assistance. Dansk Cancer Biobank på Herlev Hospital er takkede til håndtering af vævsprøver.