PLoS ONE: Humane oment-afledte Adipøst Stamceller Forøg kræft i æggestokkene spredning, Migration, og Chemoresistance

Abstrakt

Mål

Fedtvæv indeholder en population af multipotente adipøst stamceller (ASC), som dannelse tumor stroma og kan fremme tumorprogression. På grund af den høje ovariecancer metastaser til oment fedt, vi hypotese, at oment-afledte ASC kan bidrage til æggestokkene vækst kræft og formidling.

Materialer og metoder

Vi isoleret ASC’er fra omentum af tre patienter med kræft i æggestokkene, med (O-ASC4, O-ASC5) og uden (O-ASC1) oment metastaser. BM-MSC’er, SQ-ASC’er, O-ASC’er blev karakteriseret med genekspression arrays og metaboliske analyser. Stromaceller virkninger på ovariecancerceller proliferation, kemoresistens og strålingsmodstand blev vurderet ved anvendelse co-kultur assays med luciferase-mærkede humane ovarie cancercellelinier. Transwell migration assays blev udført med konditionerede medier fra O-ASC’er og kontrol-cellelinier. SKOV3 celler blev intraperitionally injiceret med eller uden O-ASC1 at spore

in vivo

transplantation.

Resultater

O-ASC’er væsentligt fremmet

i

vitro

proliferation, migration kemoterapi og strålebehandling reaktion på kræft i æggestokkene cellelinjer. O-ASC4 havde mere markant effekt på migration og kemoterapi reaktion på OVCA 429 og OVCA 433 celler end O-ASC1. Analyse af microarray data viste, at O-ASC4 og O-ASC5 har lignende genekspressionsprofiler i modsætning til O-ASC1, som var mere ligner BM-MSC’er og subkutane ASC’er i hierarkisk klyngedannelse. Humane O-ASC’er blev påvist i stroma af humane ovariecancer murine xenotransplantater, men ikke ikke-involverede æggestokke.

Konklusioner

ASC’er fra det menneskelige omentum kan fremme kræft i æggestokkene proliferation, migration, kemoresistens og stråling modstand

in vitro

. Desuden klinisk O-ASC’er isolerer demonstrere heterogene effekter på kræft i æggestokkene

in vitro

Henvisning:. Nowicka A, Marini FC, Solley TN, Elizondo PB, Zhang Y, Sharp HJ, et al. (2013) Humant oment-afledte fedt-stamceller Stigning kræft i æggestokkene spredning, Migration, og kemoresistens. PLoS ONE 8 (12): e81859. doi: 10,1371 /journal.pone.0081859

Redaktør: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, USA

Modtaget: August 9, 2013; Accepteret: 16 Oktober 2013; Udgivet: December 2, 2013 |

Copyright: © 2013 Nowicka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra The University of Texas MDAnderson Cancer center NIC Specialized programmer for forskning Excellence (SPORE) i kræft i æggestokkene Developmental Research Award (DRP) (Grant nr CA83639) [https://www.mdanderson.org/Departments/ovarianspore /] og tilskud R01CA133057 fra National Institutes of Health [www.nih.gov]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Bemærk, at en medforfatter, PBE, er i øjeblikket ansat på Asuragen Inc. i Austin, Texas. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske malignitet, hvilket resulterer i 16.000 dødsfald om året i USA [1]. Den sygelighed og dødelighed af kræft i æggestokkene skyldes en høj grad af intraperitoneal udbredelse og udvikling af kemoterapi-resistente tumorer trods oprindeligt chemoresponsive sygdom.

Intraperitoneal udbredelse af ovariecancer ofte resulterer i dannelsen af ​​metastaser i omentum, well-vaskulariserede og innerverede fedtvæv, der ligger over tarmen. Grunden omentum er den foretrukne “jord” for metastatiske ovariecancerceller fortsat ukendt. Svaret af ovariecancer metastaser i omentum til kemoterapi er en uafhængig prædiktor for død af kræft i æggestokkene, hvilket tyder på, at interaktioner mellem kræft i æggestokkene og oment mikromiljø er en vigtig drivkraft for kliniske resultater [2].

Vi hypotese at omentum er et gæstfrit miljø for dannelsen af ​​ovariecancer metastase som følge af en population af tumor tropiske mesenchymstamceller i oment adipose. For nylig, kendetegnet vi en population af multipotente adipøst afledte mesenchymstamceller fra omentum (O-ASC’er) af to patienter med oment sygdom og en uden. Hver isolat blev bekræftet at have multi-potent differentiering potentiale som forventet fra MSC. ASC’er ligne knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller (BM-MSC’er), der har kapacitet til at migrere ind tumorer og kan har vist sig at fremme tumorinitiering, vækst, vaskularisering, metastase, og resistens mod kemoterapi i mange tumormodeller [3-6 ]. Vi undersøgte effekten af ​​O-ASC’er fra patienter med og uden oment metastase på æggestokkene kræftceller.

Materialer og metoder

Cellelinjer

De humane ovariecancer cellelinjer OVCA 429, OVCA 433, og A2780 blev opnået fra Dr. Samuel C. Mok (The University of Texas MD Anderson center, Houston, TX). OVCA 429 og OVCA 433 cellelinjer blev etableret cellelinjer afledt fra patienter med sen-fase serøse æggestokkene adenokarcinomer, som beskrevet af Bast et al [7]. De humane ovarie carcinom-cellelinier SKOV3 og A2780 og human BM-MSC’er opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinier blev opretholdt i DMEM (Mediatech, Inc., Manassas, VA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT) og 1% penicillin og streptomycin (Mediatech, Manassas, VA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.

Menneskelig O-ASC’er og SQ-ASC’er isolation

Under The MD Anderson Institutional Review Board-godkendt protokol, groft normalt udseende menneskelige omentum og subkutane fedtvæv blev opnået i løbet af de mellemstationer procedurer patienter med ovariecancer. Informeret samtykke til væv bank blev opnået fra hver patient. Alle kliniske undersøgelser er blevet udført gennem hovedpersonerne udtryk i erklæringen Helinski. Skriftligt samtykke blev opnået fra hver patient. O-ASC’er og SQ-ASC’er blev isoleret ifølge tidligere offentliggjorte protokoller [8]. O-ASC1 blev isoleret fra en patient (body mass index (BMI) = 25,2 kg /m

2) med tilbagevendende endometriod adenokarcinom i endometriet og ovarie uden oment metastase. O-ASC4 og O-ASC5 blev isoleret fra fra patienter med høj kvalitet serøs æggestokkræft med oment engagement. BMI for patienter fra hvem O-ASC4 og 5 blev afledt var 32,4 kg /m

2 og 22 kg /m

2. O-ASC5 blev anvendt til genekspression array og celleoverflademarkør ekspression men blev tabt efter seriepassage

in vitro

og kunne således ikke anvendes i funktionelle assays. Det isolerede O-ASC’er og SQ-ASC’er blev dyrket i α-MEM-medium (Mediatech, Manassas, VA) med 20% FBS (HyClone, Logan, UT) og 1% penicillin streptomycin og L-glutamin (Mediatech, Manassas, VA ).

O-ASC’er line karakterisering

Efter isolation blev cellerne ekspanderet

in vitro

i α-MEM medium (Mediatech, Manassas, VA). Celleoverflademarkør ekspression blev karakteriseret ved flowcytometri analyse. O-ASC’er blev karakteriseret ved tidlig passage (max 5) ved hjælp af antistoffer specifikke for følgende markører: CD11b, CD29, CD34, CD44, CD45, CD 90, EpCam (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), og CD105 (BioLegend, San Diego, CA).

For at bekræfte adipogeniske potentiale O-ASC’er og BM-MSC, vi inkuberes 10

5 celler i adipogenisk induktion medier (DMEM medium med 10% FBS, 45 g /L glucose, L-glutamin, 1% penicillin og streptomycin, 10 ug /ml insulin, 500 pM 3-isobutyl-1-methylxanthin, 1 pM dexamethason og 200 uM indomethacin). Efter 72 timer vedligeholdelsesmedium (DMEM Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS, 45 g /l glucose, L-glutamin, 10 pg /ml insulin, 1% penicillin og streptomycin) blev sat til cellerne. Vedligeholdelsen Mediet blev skiftet 2 gange om ugen i løbet af 10 dages inkubation. På de angivne tidspunkter, udførte vi olie rød O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) histokemisk farvning af cytoplasmatiske indeslutninger af neutrale lipider af funktionelle adipocyter.

Osteoblastiske differentierings- O-ASC’er og BM-MSC’er var udført under anvendelse af 5 x10

4-celler. Efter 3 uger inkubering i osteoblast induktion medium (NH OsteoDiff medium, Bergisch Gladbach, Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland), blev ekstracellulære kalkaflejringer farvet ved anvendelse alizarinrødt S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Vi bekræftede celler chondrogene potentiale ved anvendelse af 10

6 celler, som blev inkuberet i 2 ml chondrogent medium (DMEM-medium med 45 g /l glucose, L-glutamin, 1% penicillin og streptomycin, 50 ug /ml ascorbinsyre, 100 nM dexamethason, og 10 ng /ml transformerende vækstfaktor β). Mediet blev skiftet tre gange om ugen. Efter 21 dage blev cellerne høstet, indlejret i paraffin og farvet med 1% Alcian blå (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 5% eddikesyre. Den blå farve i billedet repræsenterer sulfaterede proteoglycan indskud, der er betegnende for funktionelle chondrocytter.

NimbleGen menneskelige udtryk assay HG18

mRNA udtræk til O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, subkutan ASC’er (SQ-ASC) og BM-MSC’er blev udført under anvendelse af Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. NimbleGen (Madison, WI) HG18 72 k mikroarrays indeholdende 72.000 lange oligonukleotider (60-mer), som flise det humane genom blev anvendt til genekspression matrix profilering. Genekspressionsprofilering blev udført mindst to gange for hver cellelinier. Microarray billeder blev behandlet i NimbleScan v2.3 (NimbleGen, Madison, WI). Normalisering blev udført ved den robuste multi-array analyse algoritme med standardindstillinger.

Expression analyse software

For at udføre klyngeanalyse af prøve og udtryk profilering analyse af gener, det BRB Array Værktøjer Version 4.2. 1 (Richard Simon og Amy Peng Lam, National Cancer Institute, Bethesda, MD) blev anvendt. Prøverne blev grupperet hjælp uovervåget hierarkisk clustering med standardindstillinger. Klasse sammenligninger ved hjælp af en univariate

t

-test med en tilfældig varians model på RMA (Robust Multi array Gennemsnitlige) normaliserede data blev brugt til at identificere gener, der blev væsentligt differentielt udtrykte. Et signifikansniveau på p = 0,001 blev udpeget for hver univariat test. Salg

Metaboliske assays

Celler blev udpladet ved 50.000 celler per brønd i 12-brønds plader i 48 timer. Supernatanter blev opsamlet for ekstracellulære metaboliske analyse og cellepellets lyseredes med RIPA-buffer til proteinanalyse. Glucoseforbrug blev vurderet ved Wako glucose kit og assayene blev foretaget i overensstemmelse med producentens protokol. Cellesupernatanter blev tilsat til en plade med 96 brønde fyldt med rekonstitueret Wako Glucose reagens (Wako Chemicals, Richmond, VA). Dernæst blev pladen inkuberet ved 37 ° C og blev rystet samtidigt. Absorbansen blev detekteret ved 505 nm og 600 nm ved spektrofotometer (SpectraMax

® M5 Molecular Devices) for at måle glucose indholdet i prøverne. Resultaterne blev udtrykt i pmol /mg protein [9].

lactatet indholdet af prøverne blev målt ved Trinity lactat Kit ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev celler supernatant fortyndet 1:10 i PBS og derefter fortyndede prøver blev tilsat til 96-brønds plade fyldt med rekonstitueret Trinity lactat reagens. Den fremstillede plade med 96 brønde blev beskyttet mod lys og inkuberet ved 37 ° C i en time. Absorbansen blev detekteret ved 540 nm ved spektrofotometer (SpectraMax

® M5 Molecular Devices) til måling lactat indholdet af prøverne. Pyruvat assay involverede kolorimetrisk nikotinamidadenindinucleotid (NADH) kvantificering. Laktat dehydrogenase (LDH) katalyserer omdannelsen af ​​pyruvat til lactat med bekostning af NADH. Kort fortalt blev NADH opløsning fremstillet ved opløsning NADH (Sigma Aldrich) i Tris-opløsning (pH = 7,0). Lactatdehydrogenase (LDH) blev rekonstitueret i 50% glycerol og fortyndet i Tris-opløsning (pH = 7,0). NADH opløsning blev tilsat til 96-brønds plade inden tilsætningen af ​​cellesupernatant. Den fremstillede plade blev inkuberet ved 37 ° C i fem minutter og blev rystet. Absorbansen blev aflæst ved 340 nm ved spektrofotometer (SpectraMax

® M5 Molecular Devices) til at scanne de basale niveauer af NADH. Dernæst LDH blev tilsat, og pladen blev beskyttet mod lys og blev inkuberet ved 37 ° C i en time. De endelige niveauer af NADH blev målt ved den samme bølgelængde. Tab af NADH absorbans svarer til pyruvat i prøver. Intracellulære ATP indhold blev målt for de forskellige celletyper under anvendelse af Cell Titer-Glo Luminescent celleviabilitetstest (Promega). Cellerne blev podet i 96-brønds plader (hvide) på 8.000 celler per brønd i 24 timer. Fireogtyve timer senere blev celler inkuberet i 2 timer i enten nærvær af oligomycin (2,5 ug /ml) eller 2-deoxyglucose (100 mM). ATP-indhold blev påvist i overensstemmelse med producentens anvisninger, med et spektrofotometer (SpectraMax

® M5, Molecular Devices).

spredning assay

OVCA 429, OVCA 433 celler, A2780, og SKOV3-celler blev stabilt transficeret med ildflue-luciferasegenet under anvendelse af en lentiviral fremgangsmåde og udpladet med 5000 celler /brønd i en BD Falcon 96-brønds plade, alene eller i 1: 1 co-kultur med O-ASC1 eller O-ASC4. Co-kulturer blev udført i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin. Efter 24 timer blev 0,15 mg /ml D-luciferin tilsat og inkuberet i 1 time. Luminescens blev målt med et luminometer (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Medierne blev udskiftet, og målingerne blev gentaget i op til 11 dages kultur.

Migration assay

Cell migration blev analyseret ved hjælp af konditioneret medium (CM), der genereres fra O-ASC1 og O-ASC4 . O-ASC’er blev dyrket på en 6-brønds plade til konfluens i α-MEM-medium (Mediatech, Manassas, VA) med 20% FBS (HyClone) og 1% penicillin, streptomycin og L-glutamin (Mediatech, Manassas, VA). Efter vask med PBS, serum-frit DMEM, med 1% penicillin og streptomycin (Mediatech, Manassas, VA) blev tilsat til hver brønd. Efter 36 timer blev O-ASC CM indsamlet. Ovariecancer cellelinier af interesse blev udpladet (i serumfrit medie) i den øvre del af en 24-brønds transwell plade med 8 um porer (Corning, Inc., Corning, NY) med 500 pi O-ASC CM tilsat til bunden af ​​hver brønd. Alle prøver blev analyseret in duplo eller triplo. Efter 24 timer blev de migrerede celler farvet ved anvendelse Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Optisk densitet blev aflæst direkte fra 96-brønds plade ved 590 nm fra et enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) pladelæser (Biotek Instruments, Winooski, VT).

radiosensitivitet assay

Luciferase -mærkede A2780 celler blev udpladet (ved en tæthed på 10.000 celler /brønd) i en BD Falcon 96-brønds plade, alene eller i 1: 1 eller 1:19 co-kultur med O-ASC1 eller O-ASC4. Co-kulturer blev udført i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS, 250 pg /ml G418, 1% penicillin og streptomycin. Efter 24 timer blev cellerne bestrålet ved 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy og 8 Gy via cæsium 137 ekstern strålebehandling. Luciferase-ekspression blev målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Efter 1 times inkubation ved 37 ° C blev luminescensen målt med et spektrofotometer (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Medier blev derefter erstattet med nye medier, som indeholder G418, og målingerne blev gentaget hver anden dag, indtil cellerne nåede sammenløb.

paclitaxel og carboplatin analyser

Luciferase-mærket OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3-celler blev udpladet (ved en tæthed på 10.000 celler /brønd) i en BD Falcon 96-brønds plade, alene eller i 1: 1 co-kultur med O-ASC1 og O-ASC4. Co-kulturer blev udført i DMEM (Meditech, Manassas, VA). Efter 24 timer OVCA 429 til 0,5 uM paclitaxel 200 pM carboplatin, OVCA 433 til 1 um paclitaxel og 100 uM carboplatin, A2780 til 20 pM paclitaxel 200 uM carboplatin og SKOV3 til 50 pM paclitaxel og 100 uM carboplatin blev udsat. Luciferase-ekspression blev målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Efter 1 times inkubation ved 37 ° C blev luminescensen målt med et luminometer (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Medierne blev derefter erstattet med nye medier, der indeholder den udpegede koncentration af paclitaxel og carboplatin og måling blev gentaget over 9 dage.

O-ASC’er

in vivo

transplantation

Til bestemme, om O-ASC’er indpode i ovariecancer stroma blev 5 nøgne mus injiceret intraperitonealt (IP) med 5 x 10

6 luciferase udtrykker SKOV-3-tumorceller med eller uden samme antal RFP-mærket O-ASC1. Kontrolgruppen bestod af mus injiceret med kun O-ASC1. Tumorvækst blev overvåget med

in vivo

bioluminescerende billeddannelse. Mus blev aflivet efter 53 dage. Alle mus blev aflivet ved protokol godkendt af MD Andersons Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Tumor og ovarier blev fikseret og paraffinindlejret til histologisk analyse. Immunofluorescens blev udført på æggestokkene for at detektere RFP udtrykkende O-ASC i alle mus. Alt dyr arbejde er udført i overensstemmelse den godkendte muse-protokol ved MD Anderson Cancer Center. Mus protokollen blev godkendt af MD Andersons Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Hematoxylin og eosin (H 0.05 .. Alle grafer viser middelværdi ± SEM.

Resultater

Karakterisering af O-ASC’er

O-ASC’er blev isoleret fra tre patienter med kræft i æggestokkene. O-ASC1 blev opnået fra oment fedtvæv hos en patient med endometrial og æggestokkene adenocarcinom uden oment metastase. O-ASC4 og O-ASC5 blev isoleret fra groft normalt udseende omentum opnået fra en patient med serøs ovariecancer med oment metastase. Differentieringsfaktorer assays viste, at O-ASC’er, som BM-MSC’er, differentierer til adipogenisk, chondrogene og osteogene mesenchymale slægter (Figur S1). Celleoverflademarkører blev karakteriseret med flowcytometri (fig S2). O-ASC1 og O-ASC4, svarende til BM-MSC’er udtrykte CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105. De havde ikke udtrykke CD11, CD34, CD45, eller EpCam. Overfladen markør CD34 (transmembrane glycoprotein udtrykt i begyndelsen hæmatopoietisk og karvæv) blev udtrykt med 10% af O-ASC1s sammenlignet med 0,2% af BM-MSC og 1,42% af O-ASC4. Endoglin (CD105) og CD44 blev næsten universelt udtrykt i BM-MSC’er (99,34% og 100% af celler, henholdsvis), men blev udtrykt i lavere niveauer på O-ASC1 (87,24% og 46,1% af celler, henholdsvis), eller O- ASC4 (7,98% og 30% af celler, henholdsvis). Andre markører blev udtrykt på samme niveau i alle cellelinjer.

Genekspression

genekspression af O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5 til sammenligning med SQ-ASC og BM-MSC blev undersøgt med NimbleGen arrays. En hierarkisk clustering algoritme blev anvendt til at gruppere prøver på grundlag af lighed i ekspressionen af ​​alle 24.000 gener. Dendrogrammer baseret på ukontrollerede klyngedannelse adskilt prøver i to hovedgrene; 1) O-ASC4 og O-ASC5, der blev isoleret fra patienter med metastase i omentum, og 2) SQ-ASC’er og O-ASC1) og BM-MSC’er (Figur 1A).

Unsupervised klyngedannelse blev udført for at fremskaffe et dendrogram ved anvendelse center korrelation og gennemsnitlig binding (A) (O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, BM-MSC: n = 2; SC-ASC: n = 4). IPA-analyse afslørede veje med signifikant forskellig ekspression mellem O-ASC1 og O-ASC4 (B). Funktionerne vises fra de fleste betydelige (højere søjler) til mindst betydende (lavere søjler), og den vinkelrette gule linje angiver tærsklen for signifikans (P = 0,05).

Ved hjælp af en pakke af statistiske værktøjer, vi identificeret 415 markant differentielt udtrykte gener mellem O-ASC1 og O-ASC4. Fifty-seks procent af overudtrykte gener (minimum 10x-fold ændring) i O-ASC4 forhold til O-ASC1 kodet for produkter, hvis endelige lokalisering er i plasmamembranen eller ekstracellulære rum. Opfindsomhed Pathways Analysis (IPA) analyse viste, at de fleste af disse gener er involveret i cellulær bevægelse, vækst og proliferation og kræft eller lille molekyle metabolisme (figur 1B). Tabel 1 viser de 25 gener (fold ændring cut-off af 4 og p-værdi 0,001), hvis udtryk var væsentligt forskellige mellem OSC4 og OSC1.

Symbol

tiltrædelse nummer

Entrez gen navn

Beliggenhed

Skriv

Fold ændring

Parametric p-værdi

ACANNM_001135, NM_013227AggrecanExtracellular spaceOther116.511.20E-06VNN1NM_004666Vanin 1Plasma membraneEnzyme0. 0327.20E-06GPR116NM_015234G protein-koblet receptor 116Plasma membraneG-protein koblede receptor23.811.02E-05GRIK2NM_021956, NM_175768Glutamate receptor, ionotropiske, kainat 2Plasma membraneIon channel21.191.02E-05NRCAMNM_001037132Neuronal celleadhæsion moleculePlasma membraneOther0.0331.13E-05C1QL3NM_001010908Complement komponent 1, q underkomponent-lignende 3Extracellular spaceOther0.0421.24E-05ITGA8NM_003638Integrin, alfa 8Plasma membraneOther51.011.35E-05CADM3NM_021189Cell adhæsionsmolekyle 3Plasma membraneOther0.0491.51E-05NEBLNM_006393NebulettePlasma membraneOther0.0582.17E-05GJA5NM_005266Gap krydset protein, alpha 5, 40 kDaPlasma membraneTransporter24.452.27E-05NPTX1NM_002522Neuronal pentraxin IExtracellular spaceOther35.62.51 E-05AIF1LNM_001002260Allograft inflammatorisk faktor 1-likePlasma membraneOther12.842.73E-05F11RNM_016946F11 receptorPlasma membraneOther0.0983.18E-05PF4NM_002619Platelet faktor 4Extracellular spaceCytokine0.0973.39E-05OXTRNM_000916Oxytocin receptorPlasma membraneG-protein koblede receptor14.553.63E-05PCDH10NM_032961Protocadherin 10Plasma membraneOther57.293.83E-05SGCANM_000023Sarcoglycan, alfa ( 50 kDa dystrofin-associeret glycoprotein) Plasma membraneOther10.434.00E-05SORBS1NM_001034954Sorbin og SH3 domæne indeholdende 1Plasma membraneOther30.084.00E-05CXCL5NM_002994Chemokine (CXC motiv) ligand 5Extracellular spaceCytokine0.124.15E-05ESM1NM_007036Endothelial celle-specifikke molekyle 1Extracellular spaceGrowth factor20.674.34E-05CCBP2NM_001296Chemokine binding protein 2Plasma membraneG-protein-koblet receptor0.134.39E-05IL13RA2NM_000640interleukin 13 receptor, alfa 2Plasma membraneTransmembrane receptor0.0684.60E-05MMP7NM_002423Matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, livmoder) Ekstracellulær spacePeptidase0.14.68E-05WFDC1NM_021197WAP fire-disulfid kernedomæne 1Extracellular spaceOther19.454.75E-05Table 1. Liste over 25 gener, hvis udtryk var statistisk signifikant forskellig mellem O-ASC4 vs. O-ASC1.

for at beregne den statistiske signifikans, brugte vi Students

t

-test. CSV Hent CSV

Metaboliske analyser

Stroma har vist sig at fremme malign progression ved at ændre kræft cellens stofskifte. Ifølge “reverse Warburg-effekten”, stromale celler opregulerer glycolyse, øget lactat produktion, der secerneres og forbruges af hosliggende cancerceller til brændstof oxidative phosphorylering (OXPHOS) [10]. Vi antager, at der kan tegnede de pro-proliferative og migrerende virkninger af OSC for ved metaboliske forskelle i stromale isolater. SQ-ASC havde det højeste niveau af glukoseoptagelse og lactat sekretion sammenlignet med BM-MSC og O-ASC’er (figur 2A og 2B). Blandt O-ASC’er isolater O-ASC4 havde signifikant højere glykolyse og laktat sekretion end O-ASC1 (figur 2A og 2B). O-ASC4 havde højere pyruvat optagelse end O-ASC1 som sandsynligvis omdannes til lactat da have en højere glykolytisk aktivitet i O-ASC4 (Figur 2C). Steady state ATP produktionen var højere i O-ASC4 end O-ASC1 (Figur 2E-F). ATP produktion tilskrives glycolyse blev bestemt ved at hæmme F1F0-ATP syntase med oligomycin mens ATP mod oxidativ phosphorylering (OXPHOS) blev målt ved at hæmme glycolyse pathway med 2-deoxyglucose (2DG). Disse resultater viste, at O-ASC4 fremstillet ATP fortrinsvis fra glycolyse mens O-ASC1 fremstillet ATP fra OXPHOS (figur 2 E og F).

Metabolisk analyse blev udført på BM-MSC, SC-ASC og O-ASC1 og 4, herunder glukoseoptagelse (A), lactat sekretion (B), pyruvat optagelse (C), endogen ATP-produktion (D), ATP afledt af glycolyse (E) og ATP afledt fra oxidativ phosphorylering (OXPHOS) (F). Data er præsenteret som gennemsnit ± S.E.M. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p 0,001 for uparret 2-tailed t-test (n = 8).

O-ASC virkninger på kræft i æggestokkene celledeling

I betragtning af sondringen mellem O-ASC1 og O-ASC4 med hensyn til genekspression analyse og metaboliske analyser, vi hypotese, at disse isolater kan have forskellige virkninger på ovariecancer biologi. For at teste dette, blev virkningerne af O-ASC1 og O-ASC4 på æggestokkræft celleproliferation, migration og chemsensitivity sammenlignet. Først, for at bestemme om O-ASC’er påvirke ovariecancer cellemetabolisme, umærkede O-ASC’er og luciferase-udtrykkende æggestokkene cancercellelinier (OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3) blev co-dyrket i et 1: 1 forhold indtil celle blev konfluent 11 dage efter udpladning. OVCA 429 og OVCA 433 celler proliferation var signifikant forøget ved 7 (p 0,001 og p 0,5 henholdsvis), 9 (p 0,0001 for begge cellelinier) og 11 dage (p 0,0001 og p 0,001), når co-kultiveret med O-ASC1 sammenlignet med kontrol. Væsentlige pro-proliferative virkninger af O-ASC4 blev set i OVCA 429 celler efter 9 dage (p 0,01) og OVCA 433 celler på 11 dage af co-kultur (p 0,001). O-ASC4 øget proliferation af SKOV3-celler ved 7 (p 0,001), 9 (p 0,01) og 11. dag (p 0,01). Interessant, O-ASC1 og O-ASC4 undertrykte proliferationen af ​​A2780 humane ovarie carcinomaceller (P lt; 0,01 på dag 7, 9 og 11) (figur 3). For at vurdere effekten af ​​en lavere andel af ASC celler, vi udførte proliferationsassays med en 01:19 O-ASC’er: cancer celler ratio (Figur S3). Der var ingen signifikant forskel i spredning sats for OVCA 429, OVCA 433, A2780 og SKOV3 cellelinjer når co-dyrket med O-ASC’er på dette forhold.

Luciferase udtrykkende ovarian cancer cellelinjer blev dyrket alene eller i en 1: 1-forhold med umærkede O-ASC’er. Signifikant forskel mellem kontrol (kræftceller dyrket alene) og cancerceller co-dyrket med O-ASC’er vises: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0,0001 (n = 5). ANOVA med en Bonfferoni flere sammenligninger test.

O-ASC virkninger på kræft i æggestokkene celle migration

For at undersøge effekten af ​​O-ASC’er på kræft i æggestokkene celle migration, modificeret Boyden kammer assays blev udført med konditionerede medier (CM) fra O-ASC’er. Antallet af migrerede cancerceller (OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3) signifikant forøget efter inkubation med CM fra både O-ASC1 og 4. O-ASC4 CM signifikant øget migration af OVCA 429, 433 og A2780 celler i forhold til O-ASC1. (Figur 4, Figur S4).

Æggestokkræftceller migreret gennem en 8 pm pore i nærvær af kontrol med O-ASC konditionerede medier. Absorbansen ved 590 nm afspejler antallet af celler, der passerede gennem transwell membran. Signifikante forskelle er vist som følger: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 for uparret 2-tailed t-test (n = 3).

O-ASC’er effekt på kræft i æggestokkene celle respons på kemoterapi og strålebehandling

For at bestemme, om tilstedeværelsen af O-ASC indvirkning ovariecancerceller respons på kemoterapi, vi behandlede celler alene og co-dyrket med O-ASC’er med paclitaxel eller carboplatin. OVCA 429 celler havde signifikant større overlevelse efter behandling med carboplatin eller taxol ved samtidig dyrket med O-ASC4. OVCA 433 og SKOV-3 overlevelse efter behandling af carboplatin og taxol steget med co-kultur af både O-ASC1 og O-ASC4. A2780 overlevelse blev ikke påvirket af O-ASC co-kultur (figur 5A). Til bestemmelse O-ASC’er effekt på strålefølsomhed, A2780-celler blev co-dyrket 1: 1 i 7 dage med O-ASC1 eller O-ASC4. Efter inkubation blev cellerne bestrålet ved 2, 4, 6, og 8 Gy. Vi observerede en signifikant stigning i overlevelse efter 4, 6 og 8 Gy i A2780 celler co-dyrket med O-ASC1 (p 0,05, s 0,0001 og p 0,01, henholdsvis) og O-ASC4 (p 0,01, s 0,01) sammenlignet med kontrollen (figur 5B). Radioen-beskyttende rolle af adipose stamceller blev ikke tydeligt er vist i et lignende forsøg udført med 1:19 forhold af O-ASC celler til. cancerceller (fig S5).

Æggestokkræftceller blev dyrket med eller uden et tilsvarende antal O-ASC og behandlet med doser af paclitaxel og carboplatin (n = 5) (A) eller stråling (n = 4) 0-8 Gray (B) som vist. Signifikante forskelle er vist som følger: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0,0001 for uparret 2-tailed t-test.

O-ASC transplantation

Dernæst vi havde til formål at afgøre, om O-ASC’er indpode i ovariecancer stroma og normale væv, herunder æggestok. Nøgne mus blev injiceret intraperitonealt med luciferase udtrykker SKOV-3-tumorceller med eller uden et tilsvarende antal RFP-mærket O-ASC1. Tumorvækst blev overvåget med

in vivo

bioluminescerende billeddannelse. Efter 7 dage luciferaseaktivitet var signifikant højere hos mus behandlet med O-ASC’er men efterfølgende faldt (figur S6). O-ASC’er blev re-injiceret på dag 25. Immunofluorescens blev udført 7 dage senere at opdage RFP udtrykke O-ASC’er inden ovariecancer og uengagerede æggestok. blev påvist RFP udtrykker O-ASC’er i stroma af æggestokkene xenotransplantater men ikke inden uengagerede æggestokkene (figur 6A, 6B), hvilket viser tumorspecifik indpodning, som det er blevet rapporteret med MSC fra andre kilder.

(A) Immunoflouresence blev udført for at detektere O-ASC i æggestokkene SKOV3 xenotransplantater og groft normalt ovarie. O-ASC detekteres som røde celler i stroma af ovarietumorer hos mus injiceret med RFP udtrykker O-ASC. (B) H . E væv farvning (20x forstørrelse)

Diskussion

Ud over adipocytter indeholder omentum blod og lymfekar samt en rig inflammatorisk infiltrat, som gør det adskiller sig fra subkutane fedtvæv.