PLoS ONE: Livmoderhalskræft Celler med Positiv Sox2 Expression Exhibit Egenskaber for Cancer Stem Cells

Abstrakt

Baggrund

Selvom Sox2 udtryk er blevet fundet i flere typer af kræft, har det endnu ikke blevet anvendt til at identificere eller isolere CSCS i somatisk carcinom.

Metoder

SiHa og C33A celler stabilt transficeret med et plasmid indeholdende human Sox2 transkriptionelle elementer køre det forstærkede grøn fluorescensprotein (EGFP) reporter blev sorteret ind i Sox2-positive og de Sox2-negative populationer ved FACS, og Sox2 ekspression blev påvist ved western blot og immunohistokemi. Differentieringen, selvfornyelse og tumor dannelse evner, samt udtryk for stemness og EMT gener af Sox2-positive og Sox2-negative livmoderhalskræft celler blev karakteriseret

in vitro

in vivo

.

Resultater

En pSox2 /EGFP system blev anvendt til at adskille Sox2-positive og Sox2-negative celler fra livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa og C33A celler. Sammenlignet med Sox2-negative celler, Sox2-positive SiHa og C33A celler udviste større kapacitet til selv-fornyelse, differentiering og tumordannelse. Endvidere Sox2-positive SiHa og C33A celler udtrykte højere niveauer af stemness-relaterede gener, såsom Sox2 /Bmi-1 /Oct4 /ALDH1, og EMT-relaterede gener, såsom vimentin /snegl /β-catenin. Tilsammen alle disse resultater viste, at celler, der udtrykker endogene Sox2 er CSCS i cervikale karcinomer.

Konklusion

Denne undersøgelse er den første til at etablere en funktionel forbindelse mellem endogen Sox2 udtryk og CSCS i cervikale carcinomer . Desuden er denne undersøgelse viste, at det er muligt at udvikle et værktøj til at isolere CSCS fra somatiske tumorer baseret på ekspressionen af ​​det endogene protein Sox2 stedet for celleoverflademarkører nukleare

Henvisning:. Liu XF, Yang WT, Xu R, Liu JT, Zheng PS (2014) livmoderhalskræft Celler med Positiv Sox2 Expression Exhibit Egenskaber cancerstamceller. PLoS ONE 9 (1): e87092. doi: 10,1371 /journal.pone.0087092

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, Canada

Modtaget: 23, 2013; Accepteret: 18. december 2013; Udgivet: 28 Januar 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en generel bevilling fra National Natural Science Foundation of China til professor Peng-Sheng Zheng (nr 30.571.951), en særlig videnskabelig Distinguished Unge Forskere Fund tilskud (nr 30.725.043). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancer stamceller (CSC) hypotese antyder, at tumorer kan opstå fra en enkelt kræftcelle med stamceller-lignende egenskaber. Disse CSCS er postuleret at have kapacitet selvfornyelse og differentiering, og de kan regenerere tumor masse og alle tumor celletyper findes inden. Eksperimentel beviser til støtte for hypotese blev først dannet i 1997 af Dick gruppe, der viste, at den menneskelige leukæmi er drevet af en lille population af leukæmiske stamceller stand til at overføre sygdommen til NOD /SCID-mus [1]. Dette koncept blev udvidet til solide tumorer ved Clarke og Wicha, som påviste, at human brystcancer indeholder en subpopulation af celler med stamceller-lignende egenskaber bærer overflademarkører CD44

+ /CD24

– /lin

– [ ,,,0],2]. Efterfølgende er CSCS blevet identificeret og fremadrettet isoleret fra en række af maligniteter, herunder hjerne cancere [3], prostatacancer [4], melanom [5], myelomatose [6], tyktarmskræft [7], [8], pancreas kræft [9] og hoved og hals kræft [10]. Imidlertid har CSCS ikke blevet identificeret i cervikale carcinomer.

De fleste cancer stamceller celleassays har hidtil afhang en række forskellige celleoverflademarkører, herunder CD133, CD44, CD166, og CD24. Ved hjælp af disse overflademarkører kan CSCS fra primære tumorvæv blive beriget under anvendelse af FACS-teknologi, og deres formering kan testes i immunsvækkede mus. Imidlertid kan overflademarkører kun anvendes til at isolere de mest almindelige CSCS, og disse markører er ofte ustabile i mange somatiske cancere [11]. CSCS beriget fra primære kulturer baseret på seriel xenograft passage

in vivo

er blevet rapporteret til at indeholde en inkonsistent delpopulation efter isolering ved hjælp af overflademarkører CD133 og CD44 [12]. Derudover opnået med CSCS isoleret under anvendelse af samme overflademarkør resultater ikke er i overensstemmelse blandt laboratorier. Således bliver det nødvendigt at søge efter cytoplasmatiske eller nukleare makers, der kan anvendes til isolering af CSCS [13].

I en tidligere undersøgelse, der er konstateret vi ekspressionen af ​​den embryoniske stamcelle-specifikke transkriptionsfaktor Sox2 i primære livmoderhalskræft væv og tumorspheres dannet af primære cervikale carcinomceller, og vi fandt, at Sox2 fungerer som et onkogen i cervikal carcinogenese ved at fremme cellevækst og tumorgenicitet [14], [15]. Vores resultater antyder, at Sox2 kan være en potentiel markør for cervikal CSCS. Derudover Sox2 styrer pluripotens, selv-fornyelse og spredning af embryonale stamceller. Det er blevet vist, at murine og humane embryonale stamceller og neurale stamceller har høj Sox2 aktivitet [16], [17], [18], og øget Sox2 udtryk er også blevet fundet i bryst og glioblastom CSC befolkningsgrupper [19], [ ,,,0],20]. Tilsammen disse data indebærer, at Sox2 er en kandidat nuklear markør for CSCS.

I den foreliggende undersøgelse, vi stabilt transficeret to livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa og C33A, med et plasmid indeholdende de menneskelige Sox2 transkriptionelle elementer kørsel EGFP ekspression. Vi viste, at Sox2-positive livmoderhalskræft celler delt alle de egenskaber, CSCS.

Materialer og metoder

cellelinier og dyrkningsbetingelser

menneskelige livmoderhalskræft cellelinjer SiHa, HeLa, C33A, og CaSki blev alle anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). SiHa, HeLa, og C33A celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). CaSki-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium (Sigma-Aldrich) med 10% FBS.

Konstruktion af pSox2 /EGFP

~11.5 kb human Sox2 promotoren blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR ) fra SiHa genomisk DNA med de følgende primere: forward, 5′-gctagcgaccacatctggctgcttgtatatttaac-‘3 og revers, 5’-catgcggggcgctgtgcgcg-‘3. Derudover blev den 3′-utranslaterede region (3’UTR), poly (A) hale, og 3’forstærker af Sox2 også amplificeret ved PCR med de følgende primere: forward, 5’-tgagggccggacagcgaac-‘3 og omvendt, 5’- gtcgacatgagaggtgagtgcagtgcaattac-‘3. Vektoren sekvensen af ​​interesse, herunder den uafhængige SV40-promotor-drevet neomycinresistens kassette, og EGFP-sekvensen blev også amplificeret fra pIRES2-EGFP-vektoren (Invitrogen). Efterfølgende blev disse fragmenter klonet i TOPO-vektorer (Invitrogen), og nøjagtigheden af ​​DNA-sekvensen blev bekræftet ved sekventering. Den korrekte humane Sox2 promotor, UTR /enhancer, EGFP, og vektoren blev efterfølgende klonet ved anvendelse af en In-Fusion PCR Cloning Kit, og den resulterende vektor blev betegnet phSox2 /EGFP (Takara Bio Inc., Dalian, Kina).

Immunhistokemi og Immuncytokemi

Immunhistokemi blev udført på 4-um sektioner af paraffinindlejrede væv. Tumor vævssnit blev successivt afparaffiniseret og rehydreret før forbehandling med 10 mM natriumcitrat antigen hentning puffer (pH 6,0) i en damp trykkoger. Efter behandling med 3% H

2O

2, følgende antistoffer blev inkuberet med snittene natten over ved 4 ° C: anti-Sox2 (1:100), anti-Ki67 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:50), anti-Bmi1 (1:100), anti-Oct4 (1:100), anti-Nanog (1:100), anti-Ki67 (1:80), anti-vimentin (1 :200), anti-snegl (1:150), anti-β-catenin (1:250), og anti-E-cadherin (1:200). Alle antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), medmindre andet er angivet. Vævssnittene blev derefter inkuberet med biotinyleret immunglobulin G (IgG) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask blev sektionerne inkuberet i streptavidin-peroxidase-kompleks i 30 minutter, og immunfarvning blev udført under anvendelse 0,05% 3′-diaminobenzidin efterfulgt af modfarvning med hematoxylin. Sera fra ikke-immuniserede geder eller mus blev anvendt som negative kontroller.

Derudover blev celler dyrket på dækglas i 48 timer, fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, og permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter ved stuetemperatur. Ekspressionsniveauerne for de forskellige proteiner i disse celler blev bestemt ved immuncytokemi som beskrevet ovenfor.

TUNEL Assay

paraffinindlejrede væv objektglas blev fremstillet ud fra xenotransplantattumorer. TUNEL-farvning blev detekteret ved TUNEL-assay kit (Roche) ifølge producentens anvisninger. Apoptotiske kerner blev analyseret ved at tælle det samlede antal TUNEL-positive kerner, eksklusive celler undergår mitose i 10 tilfældige felter.

Western Blotting

Cellelysater blev separeret ved 10% natriumdodecylsulfat (SDS ) polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinyliden (PVDF) membraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand blev følgende antistoffer anvendes til western blotting: anti-Sox2 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:500), anti-Bmi1 (1 :500), anti-Oct4 (1:500), anti-Nanog (1:500), anti-vimentin (1:500), anti-snegl (1:500), anti-β-catenin (1:500) , anti-E-cadherin (1:500), og anti-β-actin (1:1000) natten over ved 4 ° C. Alle antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, medmindre andet er angivet. Efter vask blev de bundne antistoffer visualiseret under anvendelse af peberrodsperoxidase-konjugeret anti-ged, ant-kanin eller anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific Inc., New York, NY) og Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) og efterfølgende visualiseret på X-ray film [21]

flowcytometri og Adskillelse af EGFP

+ og EGFP

-. Befolkninger ved FACS

livmoderhalskræft cellelinjer var dyrket i 48 timer efter transfektion med pSox2 /EGFP. Cellerne blev fordøjet og resuspenderet i PBS suppleret med 2% FBS, og procentdelen af ​​EGFP

+ -celler blev bestemt ved anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af FACS ifølge fabrikantens protokol. Cellerne blev høstet og fikseret i 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Tredive minutter før FACS-analyse, blev cellerne behandlet med RNaseA og efterfølgende farvet med propidiumiodid (PI, Sigma-Aldrich). Cellecyklusfordeling blev analyseret med en FACSCalibur flowcytometer bruge Mod-Fit LT software

For at opnå den EGFP

+ og EGFP

-. Befolkninger, SiHa og C33A celler blev transficeret med pSox2 /EGFP plasmid under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Selektion blev udført ved anvendelse af standard dyrkningsmedium med 1 mg /ml G418. Frembringelsen af ​​enkelt celleafledte kulturer blev udført under anvendelse af en FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). De sortering porte blev etableret som den højeste og laveste 10% af EGFP-udtrykkende celler. Cellerne blev dyrket i DMEM /F12 med 1x B-27 serumfrit supplement (Invitrogen), 20 ng /mL epidermisvækstfaktor [22], og basisk fibroblastvækstfaktor (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ).

Tumorsphere Formation Assay

De sorterede celler blev holdt i stamcelle medier bestående af DMEM /F12 basale medier, N2 og B27 kosttilskud (Invitrogen), 20 ng /ml humant rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) og 20 ng /ml basisk fibroblastisk vækstfaktor (bFGF; PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ)

i den tumorsphere dannelse assayet blev celler udpladet ved en densitet på 200 celler /brønd i 24-brønds ultra. -Lav vedhæftede plader eller ved en densitet på 1 celle /brønd i plader med 96 brønde og bibeholdt i stamcelle medier. Tumorspheres der opstod i løbet af 2 uger blev registreret. For serielle tumorsphere dannelse analyser blev sfærer høstet, opdelt med 0,25% trypsin /EDTA, filtreret gennem et 40 um mesh og re-belagte, som beskrevet ovenfor.

Real-time PCR

I alt RNA blev ekstraheret fra det laveste og højeste 10% af EGFP-udtrykkende celler med TRIzol-reagens (Invitrogen). RNA-koncentrationen blev bestemt, og total cDNA blev anvendt som en skabelon til PCR-amplifikation. Real-time kvantitativ PCR blev udført tre gange for hvert primersæt under anvendelse af en iQ5 Flerfarvet Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA). Protokollen for real-time PCR var 1 cyklus ved 95 ° C i 30 sekunder efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder med en efterfølgende dissociation fase. Tærsklen cyklus værdi blev bestemt som det punkt, hvor fluorescensen overskred en forudindstillet grænse bestemmes af instrumentets software.

Tumor xenograft Assay

Seks uger gammel kvinde NOD /SCID mus blev anvendt at vurdere stamceller egenskaber

in vivo

. Celler blev injiceret i underhuden på dorsum med en blanding af 01:01 Matrigel. Tumorvolumen (V) blev bestemt ved længden (a) og bredde (b) som V = ab

2/2. De eksperimentelle protokoller blev evalueret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Medical School of Xi’an Jiaotong Universitet.

cellevækst og cellernes levedygtighed assays

Celler (2 × 10

4) blev dyrket i tre eksemplarer på 35 mm dyrkningsskåle i 7 dage. Cellerne blev høstet langs og talt ved anvendelse af et hæmocytometer og et lysmikroskop. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich) farvestof ifølge en standardprotokol. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved måling af absorbansen ved 490 nm.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført med SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Den tosidede chi-square test blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem kovariater. Students t-test blev anvendt til bestemmelse statistiske signifikans, når to grupper blev sammenlignet. At undersøge forholdet mellem to kvantitative variable, udførtes Pearsons lineære regressionsanalyse. I alle tests, p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Udvikling af EGFP-udtrykkende plasmid Drevet af menneskelige Sox2 Transcriptional Elements

For at isolere den særskilte endogene Sox2. udtrykkende subpopulation og afgøre, om det har karakter af CSCS konstruerede vi plasmid pSox2 /EGFP, som indeholder 11,5 kb af den humane Sox2 promotorsekvens placeret opstrøms for EGFP reporter. Dette plasmid indeholder også det humane Sox2 3’UTR, 3 ‘poly (A) hale, og 3’ enhancer placeret nedstrøms for EGFP reporter. Desuden blev en uafhængig SV40-promotor-drevet neomycin resistent kassette anvendes til at give mulighed for positiv selektion af celler, som erhvervede plasmidet uanset deres evne til at aktivere Sox2 promotoren (fig. 1).

Skematisk af pSox2 /EGFP reporter system. Den hSox2 promotor og transkriptionelle elementer, herunder 3’UTR, poly (A) hale, og 3 ‘enhancer blev klonet ind i pEGFP-vektoren.

Sortering Living Endogen Sox2-udtrykkende livmoderhalskræft celler ved anvendelse af pSox2 /EGFP System

Sox2 ekspression blev karakteriseret i fire humane cervikale cancercellelinier (HeLa, SiHa, CaSki, og C33A) ved hjælp af pSox /EGFP system samt western blot og immuncytokemisk analyse (fig. 2A). Sox2 var synlig som nuklear farvning ved immunokemi i enkelte eller grupperet SiHa og C33A celler (Fig. 2B). Men Sox2 var ikke påviselig i HeLa eller CaSki-celler ved Western blot eller immunokemisk analyse (fig. 2A og 2B). Når pSox2 /EGFP blev transient transficeret i fire humane cervikale cancercellelinier, 6,31% og 4,10% af EGFP-positive celler kunne påvises ved FACS i de transficerede SiHa og C33A celler, (fig. 2C). Dog kun 0,84% og 0,69% af EGFP-positive celler var observerbare i de transficerede HeLa og CaSki-celler, (fig. 2C). EGFP-positive celler omfattede mindre end 0,2% af hver utransficerede kontrol livmoderhalskræft cellelinie (fig. 2C), hvilket indebærer, at de fleste EGFP-positive celler i pSox2 /EGFP-transficerede livmoderhalskræft celler endogene Sox-udtrykkende celler. Samlet set opnået under anvendelse af pSox2 /EGFP systemet resultaterne var i overensstemmelse med de Sox2 ekspression resulterer fra western blot og immuncytokemisk analyse i alle fire cervikale cancercellelinier. Disse resultater antyder, at pSox2 /EGFP plasmid er egnet til isolering af endogene Sox2-udtrykkende cervicale cancerceller. Desuden, fordi flere SiHa og C33A celler endogent udtrykt Sox2 sammenlignet med HeLa og CaSki-celler blev SiHa og C33A cellelinier valgt til at vurdere, om endogene Sox2-udtrykkende celler er CSCS i cervikale carcinomer.

Sox2 protein ekspression var påvises ved western blot (A) og immunhistokemi (B) i de cervikale kræftceller HeLa, SiHa, CaSki, og C33A. (C) Den overflod af EGFP-positive tumorceller i livmoderhalskræft cellelinjer transficeret med pSox2 /EGFP reporter. (D) immunhistokemisk analyse af EGFP

+ og EGFP

– celler. (E) Sox2 proteinekspression i et monolag, tumorsphere celler, og sorteret EGFP

+ og EGFP

– celler

For at opnå levende Sox2-udtrykkende celler, SiHa og C33A celler. transficeret med pSox2 /EGFP plasmid. Efter selektion i kultur med 1000 ug /ml G418 i to uger blev alle G418-resistente celler indsamlet og sorteret under anvendelse af en FACSAria I; de celler, der faldt ind i 10

th og 90

th percentiler af EGFP udtryk blev sorteret og indsamlet i to separate rør. Det første rør, som indeholdt cellerne med den højeste EGFP ekspression, viste sig at indeholde mere end 90% af alle EGFP-udtrykkende celler og blev benævnt EGFP-positive population. Det andet rør, som indeholdt cellerne i den laveste 10% af EGFP-ekspression, indeholdt kun EGFP-ikke-udtrykkende celler og blev benævnt EGFP-negative population (fig. 2D). Endvidere western blot og immuncytokemisk analyse afslørede, at kun EGFP

+ SiHa og EGFP

+ C33A celler udtrykte Sox2 protein; EGFP

– SiHa og EGFP

– C33A celler indeholdt ingen påviselig Sox2 protein (figur 2E.). Disse resultater indikerer, at pSox2 /EGFP system kan anvendes med succes sortere levende celler, som endogent udtrykker Sox2 fra cervikale cancercellelinier.

EGFP-positive celler har en større kapacitet for Tumorigenicitet end EGFP-negative celler

En af de vigtigste kendetegn ved CSCS er deres stærke evne til at danne tumorer. For at teste tumordannelse evne EGFP + livmoderhalskræft celler blev EGFP-positive og EGFP- cellepopulationer sorteret fra både SiHa og C33A cellelinier subkutant injiceret i NOD /SCID-mus. Når 10

5-celler blev inokuleret i NOD /SCID-mus, både EGFP + og EGFP- populationer af SiHa og C33A celler dannede tumorer. Imidlertid er de dannet ved SiHa-EGFP

+ -celler tumorer voksede meget hurtigere (fig 3A.) Og var meget større (figur 3B og 3C.) End dem dannet af SiHa-EGFP

– celler (fig. 3A, B og C; p 0,05). Tilsvarende C33A-EGFP

+ -celler dannes tumorer, som voksede meget hurtigere og var meget større end dem, der dannes af C33A-EGFP

– celler (fig 3D, E og F; p. 0,05). Tumordannelse som en funktion af podning forskellige fortyndinger af EGFP

+ og EGFP

– SiHa og C33A celler er opsummeret i tabel 1. tumorfremkaldende frekvensen af ​​SiHa-EGFP

+ celler var 1/402 , hvilket var 17,7 gange højere end de SiHa-EGFP

– celler (1/7114; p 0,001). Den tumorfremkaldende frekvensen af ​​C33A-EGFP

+ -celler var 1/3058, som var 23,8 gange højere end de C33A-EFGP

– celler (1 /72.860; p 0,001), hvilket antyder, at EGFP-positive SiHa og C33A population indeholdt flere CSCS end EGFP-negative population. Endvidere blev apoptose /proliferation cellerate evalueret i xenograft (TUNEL /Ki67-farvning) for at udelukke, at nedsat tumorvækst med EGFP- celler skyldes en mindre cellelevedygtighed, TUNEL og Ki67 farvningsresultater i xenograft væv ved SiHa og C33A celler blev vist i figur 3G og sammenfattet i fig. 3H. Der er ikke nogen forskel i TUNEL og Ki67 positiv celle sats i xenograft væv dannet af Sox2-positive og negative SiHa og C33A celler, hvilket tyder på nedsat tumorvækst med EGFP- cellen var ikke på grund af den mindre cellelevedygtighed. Tilsammen alle disse resultater, at endogene Sox2-udtrykkende cervicale cancerceller væsentligt har forbedret tumordannelse evne fordi EGFP + SiHa og C33A celler indeholdt flere CSCS end EGFP- celler.

Tumor vækstkurver (A) og tumor vægte (B, C) af NOD /SCID-mus podet med SiHa-EGFP

+ og SiHa-EGFP

– celler (1 x 10

5 celler). Tumor vækstkurver (D) og tumor vægte (E, F) af NOD /SCID-mus podet med C33A-EGFP

+ og C33A-EGFP

– celler (1 x 10

5 celler). Den apoptose /proliferation cellerate blev bedømt ved Tunel assays og Ki67-farvning i xenograft (G og H) af EGFP + og EGFP- celler. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p . 0,05

EGFP-positive celler udviser en højere kapacitet for Self-fornyelse og differentiering end EGFP-negative celler

Udover tumordannelse evne, CSCS deler to kritiske egenskaber med stamceller: selvfornyelse og differentiering. Den tumorsphere dannelse analysen er anerkendt som en klassisk assay til selv-fornyelse. EGFP-positive og EGFP-negative SiHa og C33A cervicale cancerceller blev dyrket i serum-frit medium under betingelser, der var optimale til dyrkning tumorspheres. Som vist i fig. 4A, EGFP-positive celler isoleret fra SiHa og C33A cellelinjer genereret klassiske tumorspheres, mens EGFP-negative celler dannede nogle celle aggregater, men ikke danne tumorspheres. At udelukke virkningerne af celleaggregering, som kan forekomme i lav densitet kulturer blev cellerne dyrket ved en densitet på 1 celle /brønd efter en enkelt cellesortering ved FACS for at teste deres evne til tumorsphere dannelse i plader med 96 brønde. Ca. 6% af EGFP-positive SiHa celler dannede tumorspheres, hvilket var betydeligt højere end den procentdel af EGFP-negative SiHa celler, der dannede tumorspheres (ca. 1,6% tumorsphere dannelse; p 0,05). Tilsvarende flere EGFP-positive C33A celler dannede tumorspheres (ca. 12%) sammenlignet med EGFP-negative C33A celler (ca. 3%) (fig 4B; p. 0,05). Endvidere begge EGFP-positive SiHa og C33A celler var i stand til at danne tumorspheres i tre på hinanden følgende passager af tumorsphere kulturer, og disse celler dannet mange flere tumorspheres end EGFP-negative celler i hver kultur passage (figur 4C; p. 0,05). Endvidere blev apoptose /spredning celle sats evalueret i tumorsphere (TUNEL /Ki67 farvning) for at udelukke muligheden for, at nedsat tumorvækst ved EGFP- celler er på grund af mindre cellelevedygtighed. TUNEL og Ki67 farvningsresultater i tumorspheres ved SiHa og C33A celler blev vist i figur 4D og sammenfattet i fig. 4E, hvor der ikke er nogen forskel i TUNEL og Ki67 positiv celle sats i tumorspheres mellem Sox2-positive og negative SiHa og C33A celler, hvilket antyder, at den formindskede tumorsphere dannelse kapacitet af EGFP- celler skyldtes ikke den mindre cellelevedygtighed . Tilsammen disse resultater viser, at endogene Sox2 udtrykker SiHa og C33A celler muligvis indeholde flere celler, der har selvfornyelse evne.

(A, B) Tumorsphere dannelse assay billeder og antallet af tumorspheres dannet af SiHa og C33A celler i low-density kulturer. (C) Tumorsphere dannelse assay af EGFP

+ celler under passerede kultur efter enkelt-celle sortering ved FACS. Den apoptose /proliferation cellerate blev bedømt ved Tunel assays og Ki67-farvning i xenograft (D og E) af EGFP + og EGFP- celler. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p 0,05

For at identificere den selvfornyelse evne

in vivo

, den serielle transplantation analysen blev udført med 10

2 i Sox2 positive og. negative SiHa og C33A celler. De Sox2-positive SiHa og C33A celler kunne danne tumorer i serielle tre passager af transplantation eksperimenter. Imidlertid kunne 10

2 af de Sox2 negative celler ikke danner nogen tumor i første transplantation eksperimentet. Derfor Sox2 positive SiHa og C33A celler har mere selvfornyelse evne end de negative celler

in vivo

. Endvidere blev Sox2 protein påvist ved immunohistokemisk farvning i tumor xenograft væv dannet af EGFP-positive og EGFP-negative SiHa og C33A celler (Fig 5A). Både Sox2-positive og Sox2-negative celler blev fundet i tumorxenotransplantater dannet af EGFP-positive celler. Imidlertid kunne kun påvises Sox2-negative celler i tumorvæv dannes af Sox2-negative cervikale cancerceller. Disse resultater understøttes endvidere, at Sox2-positive SiHa og C33A celler ikke kun have selvfornyelse evne til at reproducere de Sox2-positive celler, men også have differentiering evne til at producere de Sox2-negative celler

in vivo

.

(A) Sox2 ekspression blev påvist ved IHC i xenograft væv dannet af SiHa-EGFP +, SiHa-EGFP-, C33A-EGFP + og C33A-EGFP- celler. (B) De procentdele af EGFP + celler i den første, anden og tredje passager i differentiering medium. Bars = SE. *, P. 0,05

Når EGFP-positive SiHa og C33A celler blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS, procentdelen af ​​EGFP-positive SiHa-celler faldt fra 95,78% i den første passage til 77,16% i den anden passage og 34.82% i tredje passage. Tilsvarende er andelen af ​​EGFP-positive C33A celler faldt fra 90,32% i den første passage til 44.56% og 12.01% i det andet og tredje passager i differentiering medier, (fig. 5B). Derudover kunne EGFP-negative SiHa og C33A celler kun generere EGFP-negative celler og kunne ikke have nogen EGFP-positive celler (Fig. 5B). Disse resultater indikerer, at kun endogene Sox2 udtrykkende livmoderhalskræft celler har differentiering evne in vitro.

EGFP-positive livmoderhalskræft celler udtrykker Mere stamcelle-relaterede proteiner end EGFP-negative celler

Sox2, OCT4, Bmi1, og Nanog indregnes som stamcelle selvfornyelse-relaterede nuklear transkriptionsfaktorer. Vi sammenlignede ekspressionen af ​​disse transkriptionsfaktorer i EGFP-positive celler, EGFP-negative celler og tumorxenoplantater. Som vist i figur 6, real-time PCR (fig. 6A), western blot-analyse (fig. 6B og C), og immunhistokemisk analyse (fig. 6D) afslørede, at EGFP-positive SiHa-celler og tumorerne dannet af disse celler udtrykte højere niveauer af de Bmi1, Oct4, og Sox2 proteiner end EGFP-negative SiHa-celler på både det transkriptionelle niveau (fig. 6a) og den translationelle niveau (fig. 6B, C og D). Men Nanog proteinekspression var uændret

(A) Differentiel udtryk for flere stamcelle-relaterede gener i SiHa-EGFP

+ og SiHa-EGFP

-. Fraktioner valideret af qPCR. (B) Påvisning af stamcelle-relaterede faktorer i sorteres SiHa-EGFP

+ og SiHa-EGFP

– celler ved Western blot. (C) Semi-kvantitativ analyse af stamcelle-relaterede faktorer i forhold til p-actin. (D) Stamcelle-relateret genekspression i tumorxenotransplantater blev påvist ved immunhistokemi. ALDH1 blev påvist ved immunhistokemi (E), western blot (F), og semi-kvantitativ analyse (G) i SiHa-EGFP

+ og SiHa-EGFP

– tumorer. β-actin blev anvendt som loading kontrol for RT-PCR og western blotting. Fejl- søjler repræsenterer S.D. (N = 3). * P. 0,05

desuden i de senere år har et stigende antal undersøgelser vist, at ALDH-positive celler repræsenterer CSCS i mange somatiske tumorer [23]. I den foreliggende undersøgelse immunokemisk farvning (fig. 6E, venstre) og Western blot assays (fig. 6F og G) viste, at EGFP-positive celler udtrykte ALDH, hvorimod EGFP-negative celler ikke gjorde. Immunohistokemisk analyse afslørede også, at tumorvæv dannes af EGFP-positive SiHa-celler, ikke de, der dannes ved EGFP-negative SiHa-celler, blev farvet ved ALDH1 antistof (fig. 6E, højre). I C33A celler blev stamcelle relaterede gener Bmi1, Oct4 og NANOG også opdaget af western blot. Resultatet viste, at C33A-EGFP + subpopulation celler udtrykte meget stærkere end C33A-EGFP- celler, forventer Nanog, som var magen til SiHa-celler (figur S1, A og B). Derudover ALDH1 kunne påvises i EGFP + celler, men ikke i EGFP- celler ved Western blot og IHC (fig S1, A-C). Tilsammen disse resultater tyder på, at EGFP-positive livmoderhalskræft celler også udtrykker nogle stamcelle-relaterede faktorer, såsom OCT4, Bmi1, og ALDH1.

EGFP-positive livmoderhalskræft celler udviste Flere EMT funktioner end EGFP- negative celler Salg

EMT induktion er blevet rapporteret at frembringe celler med stamceller-lignende egenskaber [24], og CSCS deler nogle egenskaber med celler, der undergår EMT [25], [26]. Her vurderede vi status EMT markører i Sox2-positive celler, Sox2-negative celler og tumorvæv dannes af disse celler (fig. 7). I SiHa-EGFP

+ -celler og tumorvæv realtids-PCR demonstrerede, at mesenchym proteiner, såsom vimentin, sneglen, og β-catenin markant blev opreguleret på mRNA-niveauet (fig. 7A). Tilsvarende Western blot (fig. 7B), immuncytokemiske (fig. 7C), og immunohistokemiske analyser (fig. 7D) viste, at de også blev opreguleret på proteinniveau. I modsætning hertil blev E-cadherin, en velkendt epithelial markering, nedreguleret i EGFP-positive SiHa-celler og opreguleres i EGFP-negative celler og tumorxenotransplantater (fig. 7A-D). Vi fandt også, at EMT-relaterede gener, vimentin og β-catenin, blev udtrykt på et højere niveau i EGFP-positive C33A celler end i EGFP-negative celler ved Western blot og immuncytokemisk farvning. Epitel markør E-cadherin var påviselig i C33A-EGFP- celler, men ikke i C33A-EGFP + celler. Imidlertid blev sneglen proteinet ikke udtrykkes i både EGFP-positive og EGFP-negative celler. (Fig S2).