PLoS ONE: epidermal vækstfaktor receptor i prostatakræft Afledt Exosomes

Abstrakt

exosomer proteiner og microRNA har fået meget opmærksomhed som diagnostiske værktøjer og biomarkør potentiale i forskellige maligniteter, herunder prostatakræft (PCA). Imidlertid rolle exosomer og membranassocierede receptorer, især epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) som mediatorer af celleproliferation og invasion i PCa progression forbliver uudforsket. EGFR er ofte overudtrykkes og er blevet forbundet med aggressive former for PSA. Mens PCA celler og væv udtrykker EGFR, er det uvist, om exosomer afledt af PCA celler eller PCa patient serum indeholder EGFR. Formålet med denne undersøgelse var at påvise og karakterisere EGFR i exosomer afledt af PCA-celler, LNCaP xenograft og PCa patientserum. Exosomer blev isoleret fra konditioneret medium af forskellige PCA cellelinier; LNCaP xenograft serum samt patientens plasma /serum ved differentiel centrifugering og ultracentrifugering på en sucrosemassefyldegradient. Exosomer blev bekræftet ved elektronmikroskopi, udtryk for exosomal markører og NanoSight

™ analyse. EGFR-ekspression blev bestemt ved Western blot-analyse og ELISA. Denne undersøgelse viser, at exosomer let kan afledes af PCA cellelinjer, serum opnået fra PCa xenograft bærende mus og kliniske prøver afledt af PCA patienter. Tilstedeværelse af exosomal EGFR i PCA patient exosomer kan udgøre en ny tilgang til måling af sygdomstilstanden. Vores arbejde vil gøre det muligt at bygge videre på dette resultat til fremtidig forståelse af PCA exosomer og deres potentielle rolle i PCa progression og så minimale invasive biomarkører for PCa

Henvisning:. Kharmate G, Hosseini-Beheshti E, Caradec J, Chin MY, Tomlinson Guns ES (2016) epidermal vækstfaktor receptor i prostatakræft Afledt Exosomer. PLoS ONE 11 (5): e0154967. doi: 10,1371 /journal.pone.0154967

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 9. januar 2015; Accepteret: April 21, 2016; Udgivet: 6. maj 2016

Copyright: © 2016 Kharmate et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. EG modtaget støtte fra Terry Fox Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste dødsårsag blandt vestlige mænd. Konserveret aktivitet af androgen-receptoren er den vigtigste drivkraft for PCa progression og metastase [1, 2]. Tidligt stadium PCa er helbredes, men en tredjedel af sagerne videre til en mere aggressiv PCa med dårlig overlevelse patient [3]. På trods af tilgængeligheden af ​​flere terapeutiske strategier, rettet mod metastaser og styring sygdom tilbagefald er fortsat en udfordring. Derfor vellykket tidlig påvisning af PCa er af stor betydning. Bortset fra de almindeligt anvendte diagnostiske procedurer /tests såsom prostata specifikt antigen (PSA) test og digital rektal undersøgelse [4], et kritisk behov forbliver for os at opdage nye biomarkører og udvikle en mere følsom endnu minimalt invasive tests for bedre og tidlig diagnose af PSA.

der er voksende beviser tyder på, at kræft celler frigiver mikrovesikler af 30-100 nm i diameter, kendt som ‘

exosomer’

, og at exosomer let findes i biologiske væsker, herunder plasma, serum, malign ascites, urin og modermælk [5, 6]. Exosomer er afledt fra sent endosomer kendt som multivesikulære organer (MVBs) og frigives ved fusion af MVBs med plasmamembranen [7]. Exosomer indeholder unikke protein og RNA last, som frigives i det cellulære mikromiljø og dermed kan fremme celle-celle-kommunikation i tillæg til andre mekanismer [8, 9]. For nylig har vores laboratorium, og andre viste, at godartede samt PCA celler med eller uden androgen receptor (AR) release exosomer [9, 10]. Derudover en omfattende lipid og proteomisk analyse afslørede tydelige forskelle i proteinprofiler af exosomer afledt af godartet sammenlignet med maligne PCA cellelinier [9, 11, 12]. Undersøgelser har vist, at exosomer indeholder membranassocierede proteiner, der virker som mediatorer af cellevækst og sandsynligvis give cellulære fænotypiske forandringer via celle-celle-kommunikation [13-15]. Imidlertid rolle komponent membranassocierede vækstfaktorreceptorer af exosomer som mediatorer af celleproliferation og invasion forbliver uudforsket,.

Foruden androgener, prostata vækst og funktion er in-part reguleres af adskillige vækstfaktorer og deres beslægtede receptorer, hvoraf den ene er den epidermale vækstfaktor og dens receptor (EGFR) [16, 17]. EGFR er et 170 kDa proto-onkogen og transmembrane receptor, som typisk er over-udtrykt i forskellige maligniteter, herunder PCa [18]. Ligandbinding til EGFR inducerer dimerisering, phosphorylering og internalisering af det EGFR som derefter udløse et netværk af intracellulære signalveje, hvilket resulterer i DNA-syntese, celledeling, migrering og adhæsion [18]. Det er blevet vist, at næsten 30% af PCA tilfælde overudtrykke EGFR og at deregulering af EGFR-medieret signaleringsveje er associeret med dårlige kliniske resultater [19, 20]. Selvom EGFR er identificeret som en vigtig anti-tumor mål, har terapier mod EGFR anvender små tyrosinkinaseinhibitorer såsom Gefitinib, Lapatinib og Erlotinib vist sig at have begrænset effektivitet i PCa [21-23]. Mens den intracellulære menneskehandel, genbrug og nedbrydning af EGFR er blevet grundigt undersøgt, er meget lidt kendt, hvorvidt EGFR undslipper lysosomal nedbrydning og i stedet selektivt frigivet ekstracellulært via exosomer.

In vitro

undersøgelser har nu vist, at exosomer isoleret fra immun- og kræftceller indeholder EGFR, EGFR-ligander og opløselige isoformer af EGFR. Derudover tumorceller frigiver exosomer og /eller exosomal gods ind i blodcirkulationen af ​​kræftpatienter [24-29]. Disse observationer har ført os til hypotesen, at EGFR kunne selektivt frigives via exosomer og kan meget vel spille en rolle i PCa progression. Desuden kan ikke besværliggøres, den mulighed, at den selektive optagelse af EFGR til exosomer kan være, i det mindste in-part, der er ansvarlig for svigt af kliniske resultater, har imidlertid ingen sammenlignende analyse mellem exosomal indhold og tumorcelle blevet gjort i dette håndskrift. For at bestemme om PCa afledte exosomer indeholder EGFR, vi isoleret og karakteriseret exosomer fra et panel af PCA celler såvel som serum fra LNCaP xenotransplanterede mus og serum /plasma fra PCA patienter. Dette er en første rapport, der viser, at EGFR er indeholdt i exosomer afledt af PCA cellelinier, både LNCaP xenograft og PCa patientserum. Disse observationer er opmuntrende for yderligere at undersøge den mulige rolle af EGFR-holdige exosomer i pro overlevelse og behandling resistensmekanismer såvel som potentielle biomarkører i PCa diagnose og progression.

Materialer og metoder

Etik Statement

Frosne PCa patient plasma /serum blev købt fra en privat blod og væv repository, Bioserve Global Biorepository, 9000 Virginia Manor Road, Suite 207 Beltsville, MD 20705 USA (https://www.bioserve.com/human-prøver /global-biorepository-overview.cfm). Kontrol serum blev opnået fra 31 år gammel sund mand frivillig med en verbal samtykke godkendt af den etiske bestyrelse (certifikat # H09-01010). The University of British Columbia Clinical Research Ethics Board (certifikat # H09-01010) godkendt brugen af ​​kommercielt erhvervet humant serum, der skal bruges i forbindelse med denne forskning.

godkendelse til dyr arbejde blev opnået fra universitetet af British Columbias Institutional Animal Care Udvalg (IACC, # A11-0337). I løbet af undersøgelsen pleje, bolig og anvendelse af dyr blev udført i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal retningslinjer Pleje og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell Culture

Menneskelig prostatakræft celler, blev LNCaP [30] og c4-2 celler opretholdt i RPMI 1640 medium henviser DU145 og PC3 i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 5% FBS (Invitrogen) og antibiotikum, ved 37 ° C i 5% CO2. Godartede RWPE-1 celler blev også dyrket i keratinocyt-SFM (KSFM) med vækst supplement (GIBCO) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). Cellerne blev dyrket til 60-70% konfluens og sultes for serum i 48-72 timer før exosomer isolation. Alle cellelinier blev opnået fra ATCC.

Serumprøver

Mus bærer LNCaP xenotransplantater blev fremstillet som beskrevet tidligere [31, 32]. Kort fortalt blev athymiske mus inokuleret med 2 x 10

6 LNCaP-celler. Tumorer blev dyrket i 28 dage, hvorefter serum blev afledt fra blod udtaget ved hjertepunktur ved euthanisation. Serumprøver blev opsamlet ved fra tre nøgne kontrolmus og tre mus bærende forskellige størrelser af tumorer: lille ( 400mm

3); medium (400-1000mm

3) og store ( 1000mm

3). Frozen PCa patient plasma /serum blev købt fra en privat blod og væv repository, Bioserve (Beltsville, MD, USA). Fire humane plasma og tre serumprøver opnået fra PCA patienter (tabel 1) blev analyseret i denne undersøgelse. Kontrolserummet blev opnået fra to 31 år gammel raske mandlige forsøgspersoner. Godkendelse blev opnået fra The University of British Columbia Clinical Research Ethics Board for humant serum, der skal bruges i forbindelse med denne forskning

Antistoffer

Antistofferne bruges blev:. Mus anti- CD-9 (C-4, # sc-13118), muse-anti-Alix (1A12, # sc-53540) og gede-anti-EGFR (N-20, # sc-31.155) fra Santa Cruz Biotechnology Inc., (Santa Cruz , CA); kanin anti-LAMP2 (# ab37024) fra Abcam (Toronto, ON) og kanin anti-GRP94 (# 2104) fra Cell Signaling Technology (Whitby, ON). Alle primære antistoffer blev anvendt i en koncentration på 1: 1000 for western blot-analyser. De sekundære antistoffer anvendt til detektion var Alexa Flour 680 æsel-anti-kanin (# A10043, 1: 10000), æsel-anti-muse (# A10038, 1: 10000) og æsel-anti-gede (# A21084, 1: 10000) fra Life Technologies (Invitrogen), Burlington ON.

Udarbejdelse af exosomer fraktioner

exosomer fra PCA-celler blev isoleret ved anvendelse af seriel centrifugering metode som tidligere beskrevet [9]. Frosne patientens plasma /serum eller LNCaP xenograft serumprøver blev fortyndet med phosphatpuffer saltvand (PBS) i et 1: 1 forhold [33]. Plasma /serumprøver blev derefter forbehandlet med anti-IgG-antistof (1: 500 fortynding) koblet til A /G sepharose beads (25 ul) for at udfælde overdrevne ikke-specifikke immunoglobuliner. Efter inkubation natten over ved 4 ° C blev forbehandlede prøver centrifugeret ved 5000x

g

i 15 minutter og den før-blokerede serum blev anvendt til exosomer isolation under anvendelse af en standard ultracentrifugering fremgangsmåde tidligere rapporteret [9, 33 ]. Kort fortalt, de på forhånd blokerede serumprøver gik gennem en række centrifugeringstrin (2000x

g

i 20 minutter og 20.000 x

g

i 45 min) og derefter overført til 30% saccharose-opløsning, efterfulgt af ultra-centrifugering ved 110,000x

g

i 2 timer. Isolerede exosomer blev udvundet fra rørsukkeropløsningen og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere analyser.

Transmission (TEM)

exosomer isoleret fra LNCaP xenograft serum og PCa patient plasma /serum var adsorberet på glød afladet 300 mesh Formvar /kulstof-belagt TEM net (Ted Pella, Redding Californien, USA) i 5 min. Prøverne blev negativt farvet med 2% vandigt uranylacetat i 5 minutter og observeret med et Hitachi H7600 TEM drevet ved 80kV (Hitachi High-Technologies Corp., Tokyo, Japan). Billeder blev taget med en sidemonteret 1K AMT Advantage digital kamera (Advanced mikroskopiteknikker, Corp. Woburn, MA, USA) [9].

NanoSight

™ partikel sporing analyse

størrelsen og koncentrationen af ​​de isolerede exosomer blev analyseret under anvendelse af NanoSight

™ LM10-HS10 systemet (NanoSight Amesbury, UK) som beskrevet for nylig [34]. Hver exosomer prøve blev fortyndet i exosomer-free forfiltreret PBS til opnåelse målbare koncentration mellem 0,5 × 10

8 og 5 × 10

9 partikler /ml. Til analyse blev en monokromatisk laserstråle (405 nm) påføres de fortyndede plasma exosomer der blev injiceret i en LM12 visning enhed med en styret sprøjtesystem laser. NanoSight

™ sporing analyse (NTA) software version 2.3 analyserede prøverne ved en konstant temperatur (25 ° C) med kamera lukkertid på 60 millisekunder og få sat til 1400. Telestyrelsen software produceret seks videoer af 60 sekunders varighed, med 5 sekunders forsinkelse mellem optagelserne skaber seks gentagne histogrammer, der blev midlet til opnåelse af endelige estimat af partikelstørrelsen og koncentrationen af ​​exosomer. NTA indstillinger var pre-optimeret og holdes konstant mellem prøverne.

Western blot-analyse

Exosom prøver blev behandlet i radioimmunudfældning assay (RIPA) buffer at frigive exosomal indhold. Proteinkoncentrationen blev derefter målt ved anvendelse af BCA Protein Assay kit ifølge producentens instruktioner (Thermo Scientific Pierce). Lige så stor mængde protein (30 ug) blev påsat for hver prøve på en 10% SDS-PAGE-gel. Exosomal markører blev identificeret under anvendelse primære antistoffer specifikke for lysosomal-associeret membranprotein-2 (LAMP-2) (1: 1000), CD-9 (1: 1000) og Alix (1: 1000). Udtrykket af EGFR i exosomer afledt af PCA cellelinier såvel xenograft eller humant plasma /serum blev detekteret ved anvendelse gede anti-EGFR antistof, som detekterer EGFR af mennesker og mus oprindelse.

ELISA til EGFR detektion

EGFR niveauer i exosomer isoleret fra LNCaP xenograft og patient plasma /serum blev bestemt under anvendelse af EGFR-ELISA-kit (Sigma Aldrich, # RAB0160) ifølge fabrikantens protokol. Lyofiliseret humant EGFR protein standard, hel plasma /serum og exosomer prøver blev tilsat til 96-brønds plade, som var præ-coatet med anti-human EGFR-antistof i 2,5 timer ved stuetemperatur. RWPE-1-cellelysat blev anvendt som positiv kontrol. Biotinyleret EGFR-antistof tilsat i 1 time ved stuetemperatur følgende vaske. HRP-Streptavidin blev derefter inkuberet i 45 min. ELISA Kolorimetrisk 3,3 ‘, 5,5-tetra-methylbenzidine (TMB) blev tilsat i 30 minutter i mørke og 0,2M svovlsyre (stop opløsning) blev tilsat straks at standse reaktionen, hvorpå gulfarvet produkt blev målt ved 450 nm anvendelse af en automatiseret ELISA-læser (Rayto, RT-1904C Chemistry Analyzer, Atlanta GA, USA) ved 450 nm. Resultaterne repræsenterer mængden af ​​EGFR med uforarbejdet plasma og oprensede exosomer som ng /ml. Assayet blev gentaget to gange og med hver prøve i tre eksemplarer.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 6.0. Forskellen mellem exosomal EGFR i PCA patienter og kontrolpersoner blev analyseret ved anvendelse af Student t-test. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± SEM.

Resultater

Tre gange berigelse af exosomer i PCa patientserum end raske kontrolpersoner

Karakterisering af exosomer isoleret fra LNCaP xenotransplanteret mus serum og PCa patient plasma /serum blev udført under anvendelse TEM, NanoSight

™ og Western blot-analyser, kollektivt. TEM-analyser afslørede et flertal af vesikler i 100 nm størrelsesområde som var karakteristisk for exosomer, ifølge deres klassiske skålformet morfologi, i repræsentative c4-2 PCA-celler, LNCaP xenotransplantat serum samt PCa patientserum (figur 1). Tilstedeværelsen af ​​exosomer blev yderligere bekræftet under anvendelse NanoSight

™ teknologi som for nylig beskrevet [34]. Fig 2 og 3 viste NTA profiler af exosomer med en enkelt top, der repræsenterer tilstanden størrelse exosomer (85-150nm), som pr størrelsen af ​​exosomer rapporteret rutinemæssigt i litteraturen. Vi observerede, at den samlede koncentration af exosomer afledt fra kontrolmus serum var 1,98 x 10

11 partikler /ml (Fig 2A). Interessant antallet af partikler steg i serum afledt af mus, der bærer små (2,2 x 10

11, Fig 2B), medium (3,98 x 10

11 Fig 2C) og store (6,66 x 10

11 Fig 2D) tumorer antyder, at exosomer er mere rigelige i tumor-bærende mus end de normale mus. Endvidere har vi målte antallet af exosomer fra serum afledt fra humant kontrol og PCA patienter. Fig 3A viste, at kontrol humant serum indeholdt 4,15 x 10

11 partikler /ml, hvorimod PCa patient plasma (13,3 x 10

11) og serum (9,9 x 10

11) viste to-fold stigning i antallet af partikler indikerer, at tumorceller producerer flere exosomer end de normale celler (fig 3B og 3C). Den NanoSight analyserede mellem 3000-4000 partikler og dermed SEM var lav mellem ± 0,12 til 0,35.

Repræsentant TEM billeder af exosomer afledt af a) C42 PCa cellelinje b) LNCaP xenograft serum og c) patient plasma ved ultracentrifugering metode. Exosomer var negativt farvet med 2% uracyl acetat efter fjernelse af fugt. Pile angiver skålformede strukturer, der er identificeret som exosomer (30-100 nm i diameter).

Analysen viste, at betyde størrelse exosomer isoleret fra kontrol mus var 126 nm (a) mens LNCaP xenotransplanteret mus bærende lille tumor var 81nm (b), 137 nm fra medium (c) og 67 nm fra store tumorer (d). Koncentrationen af ​​exosomer secernerede forøget med den stigende størrelse af tumor.

NTA profiler af exosomer viser en enkelt top, der repræsenterer gennemsnitlige partikelstørrelse og koncentration af exosomer fra normalt individ (a) og patient plasma ( b) og serum (c). Den gennemsnitlige partikelstørrelse ~ 120 Nm nm bekræftede tilstedeværelsen af ​​exosomer. Exosomer afledt af PCa patient var betydeligt højere end kontrollen humant serum.

Identifikation af markører bekræfter exosomer isolation fra serum

Western blot analyser blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​exosomet-specifikke markører. Som vist i fig 4A, CD-9 (tetraspanin), et almindeligt anvendt membranbundet exosomal markør var højere i serum fra små LNCaP xenotransplantater, som sammenlignet med den i exosomer fra nøgne mus kontrol. Interessant, ser vi ikke en markant højere udtryk i de store tumorer. Disse data også korreleret med NanoSight data (figur 2), der viser højere antal exosomer i serum fra tumorbærende mus end kontrolgruppen museserum. For yderligere at validere renheden af ​​exosom fraktioner opnået, bestemmes vi tilstedeværelsen af ​​en kendt endoplasmatisk reticulum markør GRP94 i exosomer isoleret fra xenograft serumprøver. Vores data viste mangel på GRP94 i exosom fraktioner, hvilket indikerer vellykket berigelse og isolering af exosomer fra serumprøver via saccharose-assisteret ultra-centrifugering. Ekspressionen af ​​lysosomale-associeret membranprotein-2 (LAMP-2) og Alix blev også undersøgt som et alternativ exosome markør. Fig 4B og 4C viste, at LAMP-2 og Alix blev detekteret i PCa serum /plasma afledt exosom fraktioner og var koncentrationsafhængig. Ud fra følgende betragtninger hele plasma var blottet for LAMP-2, hvilket igen indikerer kvaliteten af ​​exosomer beriget for under isolation.

a) CD9 var til stede i exosomer afledt LNCaP xenograft mus bærende små, mellemstore og store LNCaP tumorer hvorimod kontrol museserum manglede CD9. GRP94, en kendt endoplasmatisk reticulum protein, der anvendes som en negativ kontrol var til stede i exosomer tyder berigelse b) LAMP2 var til stede i exosomer afledt af PCa patient plasma henviser fravær af LAMP2 i helplasma angivet vellykket berigelse. c) Alix var til stede i exosomer afledt fra patient plasma ved forskellige exosomal proteinkoncentrationer.

PCa afledte exosomer indeholder EGFR

EGFR er en potent celle regulator forbundet med fremskreden PCa progression. Vi næste stilling til, om PCA celler og serum afledte exosomer indeholder EGFR. Fig 5A viser differentiel ekspression af fuld-længde 170 kDa EGFR i totale cellelysater samt exosomer fraktioner afledt fra et panel af AR-positive (LNCaP, c4-2, RWPE-1) og AR-negativ (DU145, PC3) cellelinier . Samlet set tilstedeværelsen af ​​EGFR i totale cellelysater er højere end dens exosom modstykker, hvorimod celleafledte exosomer viser variabelt indhold til forskellige cellelinier EGFR. Vi næste bestemmes tilstedeværelsen af ​​EGFR i

in vivo

prøver. Exosomer fra kontrolmus serum viste ingen EGFR exosomer imidlertid isoleret fra serum fra LNCaP-xenotransplantater indeholdt EGFR uanset tilstedeværelsen af ​​tumor og tumorstørrelse (Fig 5B).

EGFR var til stede i exosomer afledt af a) panel af AR responsivt og AR-reagerer såvel som godartet prostata epitelceller (RWPE-1) og i forhold til cellelysat, b) Kontrol nøgne mus og LNCaP xenograft serum. c) EGFR er indeholdt i exosomer afledt fra fire forskellige PCA patienters plasma (1-4), 3 serumprøver (5-7) og kontrol-emne og med uforarbejdet plasma fra kontrolindivid og patient (1 og 2). d) Ekspressionen af ​​EGFR på 170 kDa og 110 kDa i serum og plasma øges med stigende belastning proteinkoncentration. Interessant, der er en betydelig mængde af EGFR med uforarbejdet plasma, som er i tillæg til den exosomal fraktion. Histogrammet (e) viser EGFR niveauer (ng /ml) målt ved ELISA med uforarbejdet plasma fra kontrolindivid og PCa patient plasma /serum og exosomer afledt fra tilsvarende plasma /serum. Niveauerne af serum EGFR er forholdsvis ens i kontrol- og PCA emner mens exosomer isoleret fra PCa patient serum indeholdt signifikant højere mængder af EGFR end kontrollen emne. Data, der er repræsenteret som middelværdi ± SEM, * p. 0,05

For at validere den kliniske relevans af exosomal EGFR, vi undersøgt, om exosomer isoleret fra PCa patient plasma /serum indeholdt EGFR. Western blot analyser viste påviselige niveauer af en fuld-længde 170 kDa EGFR i to ud af fire exosom fraktioner af PCA patientens plasma og alle tre serumprøver, mens exosomer fra kontrolprøver var negative for EGFR (Fig 5C). Som vist i fig 5D, exosomer indeholdt EGFR på en koncentrationsafhængig måde. Mere interessant, det ubehandlede hele serum viste også betydelige niveauer af EGFR tyder tilstedeværelsen af ​​opløselige form EGFR cirkulerer i serum fra PCA patienter som tidligere blev rapporteret for bugspytkirtelkræft patientserum i en undersøgelse udforske exosomer i serum fra denne patientpopulation [35] . Endvidere blev EGFR niveauer detekteret i hele plasma /serum og exosomer afledt af PCA patienter og kontrol genstand anvendelse af ELISA-assayet (fig 5E). ELISA måling viste, at opløselige EGFR niveauer i patientens plasma eller serum ikke var bemærkelsesværdigt anderledes end kontrolserummet; dog EGFR niveauer signifikant højere i exosomer afledt af PCA patienters plasma /serum sammenlignet med kontrolgruppen emnet.

Diskussion

Exosomer cirkulerer i blodet kan give vigtige oplysninger, der kan ofte overses i prognostiske evalueringer. Vores lab offentliggjorde for nylig en omfattende proteomisk og lipid analyse af exosomer afledt af PCA celler

in vitro

med henblik på at give indsigt i kandidat protein biomarkører, som exosomer har potentiale til at give [9]. Vi har også etableret en reproducerbar metode til isolering og kvantificering af exosomer fra humant serum [34]. Frigivelsen af ​​exosomer i blod, urin og andre biologiske væsker giver således en mulighed for at udnytte ikke-invasive metoder til prognostisk og diagnostisk evaluering af PCa i patienter. Dette arbejde, der fokuserer på relevansen af ​​EGFR i PCa, beskriver isolering og karakterisering af exosomer afledt af

in vitro

,

in vivo

og kliniske PCA prøver som en forlængelse af vores tidligere arbejde i PCa cellelinier [9] [34].

Vores undersøgelse viser, at tilstedeværelsen af ​​EGFR i exosomer oprenset fra PCA-celler dyrket

in vitro

, serum fra LNCaP xenograft bærende mus og PCa patientserum. Adskillige rapporter har indikeret tilstedeværelsen af ​​EGFR i exosomer afledt af glioblastom, bugspytkirtlen, brystkræft og æggestokkene cellelinjer

in vitro

i exosomer fra lungekræft patient serum, dog begrænset er kendt af EGFR i PCa afledte exosomer [ ,,,0],36-39]. EGFR er ofte over-udtrykt og er associeret med afvigende signalering fører til aggressive maligniteter og dårlig patient overlevelsesrate [40]. I PCa er hyperaktivitet af EGFR forbundet med androgen uafhængighed og metastase af prostatacancerceller [41, 42]. Da exosomer er involveret i celle- celle kommunikation, der ændrer fænotype af modtager /målceller [43-45], exosomal-EGFR udtrykkes af forskellige tumortyper, herunder PCa kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. Vi observerede, at antallet af exosomer var signifikant højere i PCa serum og xenograft end kontrollen, hvilket antyder, at exosomer kan udgøre et værktøj til at differentiere normal og sygdomstilstand. Vores resultater er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse fra Turay et al, hvor de viser, at exosom numre specifikt forøget i serum fra PCA patienter sammenlignet med deres kontrol modparter [46]. Tumor-exosomer menes at have betydning for udviklingen af ​​resistens over for anti-tumor-terapier [47, 48]. Men mens prækliniske data indikerer, at EGFR spiller en væsentlig rolle i PCa progression [21]; kliniske forsøg med EGFR-hæmmere (Gefitinib, lapatinib eller erlotinib) har vist begrænset fordel for PCA patienter [22, 23, 49].

Opløselige isoformer af EGFR (sEGFR) er også blevet identificeret i konditioneret medie af brystkræft, ikke-småcellet lungekræft og bugspytkirtelkræftceller samt cirkulerer i blodbanen [35, 50, 51]. Men der er begrænset information om det mekanistiske rolle og biokemiske egenskaber af disse isoformer. Der er beviser for, at fuld længde EFGR undergår proteolytisk spaltning og nye isoformer [52, 53]. Desuden har en fuld-længde receptor og et 65kDa opløselig isoform blevet identificeret på exosomer frigivet fra humane keratinocyt cellelinier [50]. Ligeledes observerede vi en fuld længde 170 kDa EGFR og et bånd ved 110 kDa i patientens plasma og serum-afledte exosomer antyder, at opløselige isoformer af EGFR kan være til stede i exosomer foruden 170 kDa EGFR. Interessant nok i PCA cellelinjer og LNCaP xenograft bærende mus serum sådanne bånd blev ikke observeret. Vores observation understøttes af en lignende undersøgelse i brystcancerceller og patientserum som spekulerer tilstedeværelsen af ​​opløselige vækstfaktorer cirkulerer i patientens serum [54]. Vi har detekteret også et bånd ved 110 kDa i patientens plasma /serum, der muligvis kunne være den frie opløselige isoform af EGFR. Tidligere rapporter viser opløseligt EGFR-protein i serum fra patienter med metastatisk brystkræft og lungekræft kunne støtte vores resultater [39, 54]. Selv hos brystkræftpatienter, blev de opløselige EGFR isoformer forbundet med korte overlevelsesrate, indebære nogle øgede sEGFR eller ingen forskel mellem raske personer og patienter [39]. Ikke desto mindre kan estimering af sEGFR niveauer i exosomer og perifert blod giver klinisk relevans i metastatiske kræftformer. EGFR isoformer, der er til stede i PCa patientserum klart har en uidentificeret rolle i tumorigenese og er behov for yderligere kvantitative assays til evaluering af disse isoformer i PCa-afledte exosomer. Sammenfattende den foreliggende undersøgelse viser exosomer er rigt udskilles i serum hos xenotransplanterede mus der bærer tumorer og PCA patienter end deres kontrol- modstykker. Desuden er denne undersøgelse identificeret EGFR i udskilles exosomer og giver overbevisende dokumentation for, at cirkulerende EGFR kan være konstitutive i exosomer og yderligere evaluering af exosomer EGFR i PCa patient serum kan identificere sin rolle i modstanden af ​​EGFR målrettede behandlinger afprøvet i klinikken mod PCa progression ( skematisk fremstilling af rolle EGFR som vist i figur 6).

ligandbinding inducerer hurtig aktivering og internalisering af EGFR og endocytose. Hvorvidt EGFR undslipper lysosomal nedbrydning og frigives ekstracellulært via exosomer er ukendt. Overførslen af ​​EGFR via exosomer kan i væsentlig grad ændre tumor mikromiljø og kunne være relevant for progression af en aggressiv PCa.

Støtte Information

S1 Tjekliste. NC3Rs ANKOMMER Retningslinjer Tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s001

(DOCX)

S1 Fig. Western blot analyse, der viser CD9 udtryk i exosomer afledt LNCaP xenograft mus bærende små, mellemstore og store LNCaP tumorer hvorimod kontrolgruppen musen serum manglede CD9

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s002

(TIF)

S2 fig. . Western blot viser fuld ukuperede gel af GRP94

Den exosomer manglede tilstedeværelsen af ​​GRP94 bekræfter isolation succesfulde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s003

(JPG)

Tak

Vi anerkender støtten fra Terry Fox Foundation for løn støtte, som aktiveret afslutningen af ​​arbejdet beskrevet.