Abstrakt
En af de lovende muligheder for den kliniske anvendelse af kold plasma, såkaldt kold atmosfærisk plasma (CAP), er dens anvendelse på maligne celler og kræftvæv ved hjælp af sine antineoplastiske virkninger, primært gennem levering af reaktive ilt og kvælstof arter (ROS, RNS). I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af den fælles landbrugspolitik på celleproliferation og fortløbende molekylære reaktionsmekanismer i etablerede prostatacancer (PC) cellelinjer. PC celler viste en signifikant reduceret cellevækst efter behandling CAP som følge af både en øjeblikkelig stigning af intracellulære peroxidniveauer og gennem induktion af apoptose indikeret ved annexin V-assay, TUNEL assay, og evalueringen af ændringer i nuklear morfologi. Især co-administration af N-acetylcystein (NAC) fuldstændigt neutraliserede effekter fælles landbrugspolitik ved NAC optagelse og hurtig konvertering til glutathion (GSH). C-vitamin kunne ikke modvirke den fælles landbrugspolitik inducerede effekter på cellevækst. Sammenfattende relativt korte behandlinger med CAP 10 sekunder var tilstrækkelig til at inducere en signifikant inhibering af cancerproliferation, som observeret for første gang i urogenital cancer. Derfor er det vigtigt at forstå funktionen af CAP relateret celledød og afklare og optimere CAP som cancerterapi. Øget peroxider kan ændre redox-regulerede signalveje og kan føre til vækst og apoptose. Vi antager, at den generelle intracellulære redox homeostase, især niveauet af cellulær GSH og peroxidaser såsom peroxiredoxins påvirke resultatet af behandlingen af den fælles landbrugspolitik
Henvisning:. Weiss M, Gumbel D, Hanschmann EM, Mandelkow R, Gelbrich N , Zimmermann U, et al. (2015) Cold Atmosfæriske Plasma Behandling inducerer antiproliferativt effekter i prostata cancer celler fra Redox og Apoptotiske signalveje. PLoS ONE 10 (7): e0130350. doi: 10,1371 /journal.pone.0130350
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES
Modtaget: September 25, 2014 Accepteret: 18. maj 2015; Udgivet: Juli 1, 2015
Copyright: © 2015 Weiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Dele af det arbejde blev finansieret af tilskud på CHL: (1) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), LI984 /3-1 (https://www.dfg.de), (2) Science Network Molekylær Medicin, University Medicin Greifswald, Fomm-2013-06 (https://www.medizin.uni-greifswald.de/fvmm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
trods udviklingen af nye lovende terapeutiske strategier mod tidlig og fremskreden urogenital tumorer, såsom prostata, nyre- eller urethral cancer, radikal kirurgi er stadig den standard terapi som en helbredende tilgang. Primært, prostatacancer (PC) repræsenterer en af de mest diagnosticerede ondartede sygdomme og forbliver anden førende årsag til tumorassocierede dødsfald i mandlige i den vestlige halvkugle [1]. I de fleste områder af kirurgisk onkologi der er bred enighed om excision af en tumor i alt og med en tilstrækkelig stor kirurgisk margen (R0-resektion). Overraskende, kliniske forsøg viser, at kræft-positive kirurgiske margener er uundgåelige i et betydeligt antal tilfælde [2, 3, 4]. Men fortrinsvis fuldstændig lokal excision af maligne celler øger risikoen for at beskadige flankerende væv og organer. Derfor er nye terapeutiske anvendelser kræves for at forhindre kræft-positive kirurgiske margener ved at fjerne mikroskopiske rester efter resektion af urogenitale tumorer, og samtidig gøre det muligt at reducere den mindste afstand mellem behandlede tumor og omkringliggende væv.
For nylig koldt atmosfæriske plasma (CAP) indikerede lovende antineoplastiske virkninger på flere tumorer, f.eks melanom, gliom og bugspytkirtelkræftceller [5, 6, 7], og derfor kunne være en effektiv fremgangsmåde til anti-cancer behandling i klinisk urologi i fremtiden. Fysisk plasma er defineret som en meget reaktiv ioniseret gas indeholdende forskellige biologisk reaktive faktorer involverer ladede partikler (ioner, elektroner), exciterede atomer og molekyler (dvs. reaktive oxygen og nitrogenforbindelser, Ros, RNS), frie radikaler (atomer eller molekyler indeholdende en uparret elektron), fotoner og elektromagnetiske felter, der fører til udledning af synlige ultraviolet, vakuum-ultraviolette samt infrarød stråling [8, 9]. Temperaturen kan justeres til kropstemperatur. De reaktive forbindelser, som bliver biokemisk aktive, der dukker op under generering af plasmaet ved interaktion med molekyler af den omgivende luft, og /eller ved kontakt af plasma med enten mediet, kropsvæsken eller vævet, der skal behandles [10, 11, 12]. Behandling af biologiske væv og celler med CAP bliver muligt, på grund af elektroner varme op meget hurtigere i et elektrisk felt i forhold til ioner, hvilket resulterer i en omgivende temperatur plasma jet [13]. Afklaring de underliggende biologiske virkninger og virkningsmekanismer stadig en betydelig udfordring, men der er stadig flere tegn rapporterer, at ROS er primært ansvarlige for CAP-afhængig celledød [14]. Cancercellevækst er ofte forbundet med en forstyrrelse af fysiologisk redox homeostase og signalering, fx forhøjede niveauer af 8-hydroxy desoxyguanosin og hydrogenperoxid er blevet vist i forskellige carcinomceller [15]. Redox signalering formidles af medlemmer af thioredoxin familie (fx thioredoxins, TRX’er; glutaredoxins, Grxs; peroxiredoxins, Prxs), der kontrollerer vigtige cellulære processer, herunder spredning og apoptose. TRX’er og Grxs regulere proteinfunktion via reversibel reduktion /oxidation af specifikke cysteinylrester og styre intracellulære hydrogenperoxid niveauer ved at reducere Prxs, hvilket igen reducerer cellulære peroxider til vand. Thioredoxin isoformer er allestedsnærværende udtrykt i pattedyr, er lokaliseret i hele opdelte celler, og viser tydelige ændringer i udtryk i forskellige patologier herunder kræft (for en oversigt se Hanschmann et al. [16]). En stærk og vedvarende forstyrrelser i redox signalering, da det kan skyldes eksponering CAP, kan føre til hæmning af forstyrres eller forstyrrede funktioner af proteiner og essentielle cellulære signalveje [17].
I denne undersøgelse vi beskrive virkningerne behandling CAP på humane PC cellelinier. Vores undersøgelse er ikke kun støtte tidligere data om CAP-drevet ændring af ROS, men i øvrigt bekræfter den specifikke induktion af peroxider, der umiddelbart ændrer redox staten Prxs reversibelt og potentielt andre proteiner, der fremmer cellevækst og apoptose, hhv.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskelig epitel PC cellelinier LNCaP og PC-3 (Cell Lines service, Eppelheim, Tyskland) blev formeret i RPMI 1640 medium suppleret med 10 % føtalt kalveserum og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin (PAN Biotech) ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fugtig atmosfære. For celleoverføringen på en cellekultur plade blev adhærente celler løsgøres ved 0,1% trypsin /0,04% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og resuspenderet i RPMI-medium. Til yderligere eksperimenter RPMI-medium blev suppleret med 5 mM N-acetylcystein (NAC; Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland)., 100 pM vitamin C (Carl Roth) eller 5 pg /ml cycloheximid (Merck, Darmstadt, Tyskland), henholdsvis
CAP behandling
for at generere CAP med argon som bæregas, blev det atmosfæriske tryk plasma jet kINPenMed (Neoplas GmbH, Greifswald, Tyskland) udnyttet (figur 1). Suspenderede celler blev behandlet i 500 pi RPMI 1640-medium (PAN Biotech, Aidenbach, Tyskland) på en ikke-coatet cellekultur plade. Den største årsag til celle behandling i suspension var at undgå bivirkninger fra kilden af den fælles landbrugspolitik ved behandling vedhæftende celler, dvs. mekaniske skader og tørring. Proliferationsassays blev opformeret med 3×10
4 LNCaP og PC-3 celler. Yderligere analyser og Western Blot-analyse blev udført med 6×10
5 LNCaP og PC-3 celler kilde Den fælles landbrugspolitik blev ansøgt om 10 s og kontroller blev behandlet med ikke-ioniseret argongas i 10 s, hhv. Følgende CAP behandling celler blev straks overført til poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) belagt cellekulturplader og blev dyrket i RPMI 1640 medium for angivne tidspunkter. Til behandling CAP med kINPen09 følgende indstilling blev brugt: Argon gas flow: 3 l /min; forsyningsspænding = 65 V DC; frekvens: 1,1 MHz; eksponeringstid: 10 s. Kontrolceller: Argon gas flow: 3 l /min; eksponeringstid: 10 s [18, 7]
(A) Plasma jet kINPen09 (Neoplas GmbH, Greifswald, Tyskland), (B) skematisk rekonstruktion af kINPen09 og sammensætningen af fysisk plasma
spredning assay
Cellulær spredning af LNCaP og PC-3 celler blev analyseret i 24 cellekulturplade plader (1 ml /hul) ved hjælp en CASY Cell Counter og Analyzer Model TT (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i løbet af en periode på 120 timer. Adhærerende celler blev frigjort med 0,1% trypsin /0,04% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og resuspenderet i CASYton opløsning (Roche Applied Science). Antallet af levende celler blev bestemt i dubletter for hver prøve.
Annexin V assay
LNCaP og PC-3-celler blev suspenderet i 500 pi RPMI-medium og blev CAP behandlet i 10 sek. Argon behandlede celler tjente som kontrol. Efter 4 timers inkubation adhærente celler blev frigjort med 0,1% trypsin /0,04% EDTA, vasket med PBS og resuspenderet i bindingsbuffer. AnnnexinV assay blev udført ved hjælp af FITC Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD Bioscience, Tyskland) som anbefalet af leverandøren.
Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) assay
6×10
5 suspenderet LNCaP og PC-3-celler blev suspenderet i 500 pi RPMI-medium og CAP behandlet i 10 sek. Argon behandlede celler tjente som kontrol. Efter 24 timers inkubation adhærente celler blev frigjort med 0,1% trypsin /0,04% EDTA. TUNEL apoptose analyse blev udført ved anvendelse af HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) efter leverandørens anbefalinger. Data blev erhvervet ved hjælp af en Infinite 200 PRO multimode-læser (Tecan) og blev analyseret ved hjælp af i-kontrol 1.9 software (Tecan).
Nuklear morfologi assay
6×10
5 suspenderet LNCaP og PC-3-celler blev CAP behandlet i 10 sekunder og podet på en 6-brønds celledyrkningsplade indeholdende 2,5 ml RPMI-medium. Argon behandlede celler tjente som kontrol. Celler blev dyrket i 24 timer, blev vasket med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, skyllet to gange med PBS og inkuberet med 0,2% Triton-X-100 i 5 min. Celler blev vasket med PBS og farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Carl Roth) til fluorescens-analyse under anvendelse af en BZ-9000 fluorescensmikroskop systemet (Keyence, Osaka, Japan) og en BZ II Analyzer software (Keyence ). Under apoptose celler ligger til grund kerneforandringer morfologi, chromatinkondensering, og nedbrydning body fragmenter nukleare [19, 20, 21]. Til påvisning af morfologiske ændringer fluorescerende mikroskopiske billeder blev taget fra 10 positioner pr 3,5-cm-celledyrkningsskål, svarende 0,5% af det samlede vækstområde. Computational morfometrisk analyse blev udført for hver enkelt kerne. Samlede antal DAPI positive kerner varierede 400-600 (CAP /cycloheximid behandlede celler) og 700-1000 (argon /vehikelbehandlede celler). De morfometriske parametre blev beregnet af BZ II Analyzer software. Derfor Hybrid celletal BZ-H2C modulet blev anvendt til at definere parametrene for udvælgelse. Single kerner blev defineret af co-lokalisering funktion som DAPI positive områder i et område fra 0,3 til 200 um
2, undtagen kerner klynge og fragmenterede kerner. De morfometriske parametre blev opnået af softwaren analyseværktøjer areal, omkreds, storakse, lille akse, og lysstyrke. Apoptotisk kondens repræsenteret ved kerner krympning er kendetegnet ved et fald på det nukleare område og omkreds. Yderligere morfologiske chancer ledsaget med nukleare deformation og disrounding udgør misforhold af parametre større og mindre akse, samt en stigning af nuklear lysstyrke.
Western blotting
2-Cys Prxs redox blot.
for at bestemme den fælles landbrugspolitik-inducerede ændringer i cellulære niveauer og redox tilstand PRX1, PRX2 og Prx3 6×10
5 suspenderet LNCaP og PC-3 celler blev behandlet med CAP eller argon i 10 s. Cellerne blev centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min. Supernatanten blev opsamlet og blandet med påføringsfarvestof (0,3 M Tris /HCl (pH 7,0), 50% glycerol, 5% SDS, 0,1% bromphenolblåt) og blev nedfrosset ved -20 ° C til senere analyse af potentielle sekretion af PRX1 og PRX2. Celler blev inkuberet i 15 minutter i PBS indeholdende 100 mM af alkyleringsmidlet N-ethylmaleimid (NEM), der binder irreversibelt til frie thiolgrupper. Efter centrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter, supernatanten blev kasseret, og pelleten blev resuspenderet i NEM-holdig buffer (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, proteasehæmmere, 100 mM NEM ) i 15 minutter og lyseret ved tilsætning af 2% CHAPS. Samlede proteinmængde blev bestemt ifølge Bradford og 10-20 ug protein blev fortyndet og blandet med påføringsfarvestof. SDS PAGE blev kørt ved hjælp pre-støbt geler (4-20%, BioRad) og pletten-fri teknologi (BioRad). For at analysere redoxtilstanden af den cellulære Prxs, proteiner analyseres ved ikke-reducerende SDS-PAGE. For at analysere udskilt Prxs i supernatanten, blev lige store volumener reduceret med 100 mM DTT i 30 minutter ved stuetemperatur og 10 min ved 94 ° C. Proteiner blev separeret ved SDS PAGE og overført til PVDF-membraner ved hjælp af semi-tør teknik. Membraner blev blokeret med 5% mælkepulver og 1% BSA i TBS indeholdende 0,05% Tween-20. PRX1, PRX2 og Prx3 blev analyseret under anvendelse af specifikke primære antistoffer (produceret og evalueret som anført i [22] og [23]), et HRP-mærket sekundært antistof og forøget kemiluminescens udvikling teknik under anvendelse af ChemiDoc systemet (BioRad). Niveauer af oxiderede Prxs blev kvantificeret ved densitometrisk analyse under anvendelse ImageJ og ImageLab software (BioRad) og blev normaliseret til den samlede mængde af den særlige Prx. Endvidere blev samlet protein kvantificeret baseret på pletten-fri teknologi og blev anvendt til normalisering af blotting data indsamlet fra densitometrisk analyse.
Glutathion (GSH) assay Salg
LNCaP og PC-3-celler blev inkuberet i nærvær eller fravær af 5 mM NAC over en periode på 12 timer. Celler blev høstet med 0,1% trypsin /0,04% EDTA, vasket med PBS og lyseret i lysebuffer (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, proteaseinhibitorer, og 2% CHAPS). Proteinmængden blev bestemt ifølge Bradford. 100 ug protein blev udfældet natten over under anvendelse af 4% sulfosalicylsyre. Prøver blev centrifugeret ved 4 ° C i 30 minutter ved 13000 rpm. Supernatanter blev neutraliseret under anvendelse af NaOH og blev analyseret for total GSH-indhold i et kolorimetrisk assay mod en GSH standard med kendte koncentrationer (0-0,2 mM). Bestemmelsen er baseret på dannelsen af den gule TNB fra 5,5′-dithio-bis- (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) i nærvær af GSH. Assayet blev udført i en 96 brønd plade; indeholdt reaktionsblandingen 1,5 mM NADPH (Carl-Roth), gær GSH reduktase og 1,5 mM DTNB (Carl-Roth) og blev målt ved 412 nm som endepunkt-assay under anvendelse af Infinite 200 PRO multimode reader (Tecan).
Statistik
statistiske sammenligninger blev udført fra mindst 9 uafhængige vækst kinetiske eksperimenter og i tilfælde af andre analyser fra mindst 3 uafhængige forsøg ved hjælp af uparret Students
t
test. Resultater af
s
0,05 blev betragtet signifikant. Data er angivet som middel ± SD.
Resultater
behandling CAP hæmmede celleproliferation af menneskelig PC cellelinjer
I denne undersøgelse, vi sigter mod at analysere på kort og lang langsigtede virkninger af CAP på proliferation af human PC cellelinier LNCaP og PC-3 efter en enkelt behandling på 10 s CAP. Argon behandlede celler blev anvendt som kontrol. Ved hjælp af en CASY Cell Counter og Analyser Model TT det samlede celleantal blev analyseret i en periode på 120 timer (fig 2a og 2b). 10 s ansøgning CAP forårsaget betydelige reduktioner i det samlede celleantal af den observerede cellelinjer LNCaP (Fig 2A, 4 timer: 2,15 fold,
s
= 0,1138; 24 timer: 1,36 gange,
p
= 0,2034; 48 h: 1,79 gange,
s
= 0,0227; 72 h: 1,88 gange,
s
= 0,0584; 96 h: 1,96 gange,
s
= 0,0148; 120 h: 2,30 gange,
s
= 0,0050) og PC-3 (fig 2B, 4 timer: 3,23 gange,
s
= 0,0040; 24 timer: 1,82 gange,
s
= 0,0007; 48 h: 1,90 gange,
s
= 0,0177; 72 h: 2,01 gange,
s
= 0,0011; 96 h: 2,58 gange,
s
= 0,0010; 120 h:. 2,96 gange,
s
= 0,0015) sammenlignet med argon-behandlede kontroller
efter behandling landbrugspolitik for 10 s LNCaP og PC-3-celler blev talt under anvendelse af en CASY Cell Counter og Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) ved angivne tidspunkter efter. Kontrolceller blev behandlet i 10 s med argon (contr). Levende celle antal (A) LNCaP-celler, og (B) PC-3-celler behandlet med CAP afslørede signifikant nedsat celletal sammenlignet med kontroller. (C) LNCaP-celler inkuberet med 10 nM docetaxel viste signifikant inhiberede cellevækst, sammenlignes på CAP behandling. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD af celletal. *
s
0,05; ***
p
. 0,001, bestemt ved Students
t
test
CAP-induceret apoptose i LNCaP og PC-3 celler
til bevis om nedsættelsen af celletal efter behandling CAP er resultatet af apoptotisk celledød, vi yderligere undersøgt virkningerne af behandling Cap af annexin V og TUNEL assay samt evaluering af nuklear fysik ved det nukleare morfologi analysen. Farvning af membranøs phosphatidylserin via annexin V, herunder bl.a., en afgørende faktor for apoptose, når de externalized til den ydre plasmamembran, viste en akkumulering af annexin V signal 4 timer efter behandling af LNCaP CAP og PC-3-celler (Fig 3; LNCaP : 1,25 gange,
s
= 0,0007; PC-3: 1,60 gange,
s
= 0,2954). Resultaterne var signifikant for LNCaP, mens trods en respektabel stigning i annexin V signal, ikke signifikant til PC-3. Derfor håndhæves vi apoptose detektion med TUNEL-assay og cellekernemorfologi assay at visualisere ændringer i cellekernemorfologi.
LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med CAP i 10 s og blev dyrket i 24 timer. Argon behandlede celler blev anvendt som kontrol (contr). Celler blev høstet og forarbejdet ved anvendelse af et FITC Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Bioscience, Tyskland) ifølge fremstiller ‘instrukser. 24 timer efter behandling CAP LNCaP og PC-3-celler viste en stigning af phosphatidylserin-bundne Annexin V. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ***
s
0,01, som bestemt ved Students
t
test
Ved mærkning DNA-fragmenter gennem TUNEL assay både LNCaP og PC-3 celler. viste en signifikant højere sværhedsgraden af DNA fragmentering og derfor en stigning i TUNEL positiv celle område efter behandling CAP sammenlignet med argon behandlede kontroller (fig 4A, LNCaP; 4 timer: 3,07 fold,
s
= 0,0068; 24 h: 1,93 gange,
s
= 0,0012, fig 3B, PC-3; 4 timer: 3,35 gange,
s
= 0,0078; 24 timer: 2,24 gange,
s
= 0,0384). Desuden cellekernemorfologi assayet er almindeligt brugt til at detektere apoptose i eukaryote celler og andre celletyper, som er en indikator for morfologiske forandringer i kernen. Som afbildet i figur 5, det nukleare morfologi analysen af CAP behandlede LNCaP- og PC-3 celler afslørede betydelige og apoptose-associerede ændringer af nukleare morfologi vedrørende område (Fig 5A; LNCaP: 1,04 gange fald,
s
= 0,0022 fig 5F, PC-3: 1,27 gange fald,
s
= 0,0021), perimeter (figur 5B; LNCaP: 1,02 gange fald,
s
= 0,0310, fig 5G, PC-3 : 1,11 gange fald,
s
= 0,0065), storakse (figur 5C, LNCaP: 1,02 gange fald,
s
= 0,0405, fig 5H, PC-3: 1,13 gange fald,
s
= 0,0050) og mindre akse (figur 5D, LNCaP: 1,03 gange fald,
s
= 0,0085, fig 5I, PC-3: 1,14 gange fald,
s
= 0,0051), samt lysstyrke per celle (fig 5E; LNCaP: 2,25 gange stigning,
s
0,0001, fig 5J; PC-3: 1,45 gange fald,
s
= 0,0034) sammenlignet med argon behandlet kontroller. Induktion af apoptose ved cycloheximid inkubation tjente som intern kontrol [24], og forårsagede sammenlignelige ændringer af området (figur 5A; LNCaP: 1,27 gange fald,
s
= 0,0028, Fig 5F, PC-3: 1,14 gange fald ,
s
= 0,0006), perimeter (figur 5B; LNCaP: 1,13 gange fald,
s
= 0,0071, fig 5G, PC-3: 1,09 gange fald,
p
= 0,0005), storakse (figur 5C, LNCaP: 1,15 gange fald,
s
= 0,0099, fig 5H, PC-3: 1,13 gange fald,
s
= 0,0001) og mindre akse (figur 5D; LNCaP: 1,13 gange fald,
s
= 0,0012, fig 5I, PC-3: 1,02 gange fald,
s
= 0,4306), samt lysstyrke per celle ( fig 5E; LNCaP: 1.23 dobling,
s
0,0001, fig 5J; PC-3:. 1,55 gange fald,
s
= 0,0002)
LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med CAP i 10 s og blev dyrket i 4 timer eller 24 timer. Argon behandlede celler blev anvendt som kontrol (contr). Celler blev høstet og forarbejdet ved specifik mærkning af nuklear DNA-fragmentering med et HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) ifølge fremstiller ‘instrukser. (A) Nuclear DNA fragmentering af LNCaP og (B) PC-3-celler efter 10 sekunders behandling CAP (CAP) sammenlignet med argon behandlet kontroller (controll). Umærkede kontrolceller (umærket controll) tjente som negativ kontrol og nuklease-behandlede celler (nuklease controll) tjente som positiv kontrol hhv. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *
s
0,05, **
s
. 0,01, som bestemt ved Students
t
test
LNCaP og PC -3-celler blev CAP behandlet i 10 sekunder, fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til fluorescens-analyse. Nukleare parametre område (A, F), perimeter (B, G), storakse (C, H), lilleakse (D, I) og lysstyrke per celle (E, J) efter DAPI fluorescensen af LNCaP og PC-3-celler efter fælles landbrugspolitik og argon (contr) behandling. Inkubation med cycloheximid (cyclohex) og dets vehikel tjente som intern positiv kontrol for apoptose. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *
s
0,05, **
s
0,01, ***
s
0,001, bestemt ved Students
t
test.
Inkubation med NAC omvendt anti-proliferative virkninger CAP
for nylig, er der voksende tegn på, at anti-proliferative virkninger loft over pattedyrceller er forårsaget af induktion af reaktive arter, herunder ROS og RNS [4]. For at bestemme om reaktive arter er ansvarlige for formindskelsen af cellulær vækst i pc’en, vi tælles levende celler af CAP eller argon behandlet LNCaP og PC-3-celler, der blev inkuberet i nærvær eller fravær af NAC og vitamin C i op til 120 timer ( fig 6). Begge reagenser vides at mediere universelle antioxiderende virkning [22]. Igen, anvendelsen af CAP på celler dyrket i RPMI celledyrkningsmedium afslørede signifikant nedsat celleantal af LNCaP (figur 6A; 4 timer: 2,04 fold,
s
= 0,0328; 24 h: 1,30 fold,
p
= 0,1277; 48 h: 1,58 gange,
s
= 0,0298; 72 h: 1,77 gange,
s
= 0,0275; 96 h: 2.00 fold,
p
= 0,0189; 120 h: 2,30 gange,
s
= 0,0205) samt PC-3-celler (fig 6B, 4 timer: 2,63 gange,
s
= 0,0005; 24 t : 2,08 gange,
s
= 0,0008; 48 h: 2,07 gange,
s
= 0,0044; 72 h: 2,61 gange,
p
= 0,0048; 96 h: 2.29 fold,
s
= 0,0509; 120 h: 2,12 fold,
s
= 0,0056) sammenlignet med argon behandlet kontroller og var sammenlignelig med det, vi har vist før (figur 2). Især tilskud af NAC til CAP behandlet LNCaP og PC-3-celler stort set fjernet den væksthæmmende virkning af CAP som NAC-inkuberet cellelinjer udviste forøget cellevækst efter plasmabehandling sammenlignet med CAP-behandlede celler i fravær af NAC (Fig 6A; LNCaP, 4 timer: 2,30 gange,
s
= 0,1084; 24 timer: 1,27 gange,
s
= 0,1474; 48 h: 1,38 gange,
s
= 0,1853; 72 timer: 1,50 gange,
s
= 0,0952; 96 h: 1,52 gange,
s
= 0,1323; 120 h: 1,60 gange,
s
= 0,0134; fig 6B ; PC-3; 4 timer: 1,95 gange,
s
= 0,0287; 24 timer: 1,81 gange,
s
= 0,1111; 48 h: 1,61 gange,
s
= 0,1011; 72 h: 1,73 gange,
s
= 0,0571; 96 h: 1,43 gange,
s
= 0,0917; 120 h: 1,57 gange,
s
= 0.2247 ). Mest interessant, blev antiproliferative virkninger CAP ikke begrænset af antioxidanten vitamin C som proliferationen af CAP-behandlede celler i nærvær eller fravær af vitamin C statistisk ikke forskellig. CAP behandlede celler suppleret med C-vitamin viste en statistisk signifikant reduktion af LNCaP og PC-3 spredning i forhold til argon behandlet kontroller (LNCaP, Fig 6C, 4 timer: 1,85 gange,
p
= 0,0397; 24 timer: 1.61 fold,
s
0,0001; 48 h: 1,76 gange,
s
0,0001; 72 h: 1,91 gange,
p
= 0,0020; 96 h: 2,16 fold,
s
= 0,0007; 120 h: 2,20 gange,
s
= 0,0001; PC-3, fig 6D, 4 timer: 2,24 gange,
s
0,0001; 24 timer: 1,80 gange,
s
0,0001; 48 h: 1,74 gange,
s
0,0001; 72 h: 2,25 gange,
s
96 h: 2,35 gange,
s
0,0001; 120 h:. 2.30 fold,
s
= 0,0002)
Living celle antal LNCaP og PC -3 celler efter behandling landbrugspolitik for 10 s. CAP-behandlede celler blev inkuberet med cellekulturmedium i fravær af NAC og vitamin C (○ og ●), (A + B) cellekulturmedium indeholdende 5 mM NAC (□ og ■), og (C + D) cellekultur medium indeholdende 100 uM vitamin C (VITC, □ og ■) over en periode på 120 timer. Celler blev talt ved hjælp af en CASY Cell Counter og Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) ved angivne tidspunkter. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD af celletal. *
s
0,05, **
s
0,01, ***
s
0,001, bestemt ved Students
t
test.
NAC er en etableret kilde til GSH-syntese og således en kilde til den mest rigelige to-elektrondonor, mens C-vitamin er en mere effektiv one-elektrondonor. Dernæst vi vurderet, om de beskyttende virkninger af NAC behandling kunne baseres på øget intracellulære GSH niveauer ved hjælp af en kolorimetrisk analyse for total cellulære GSH (Fig 7). Faktisk NAC behandling førte til en stigning i intracellulære GSH-indholdet i løbet af få timer efter behandling (LNCaP, fig 7A; 4 timer: 1,18 fold; 8 h: 1,66 fold; 12 h: 1,66 fold, PC-3, fig 7B ; 8 h: 1,47 fold, 12 h:. 1,37 gange)
LNCaP og PC-3 celler blev behandlet med 5 mM NAC i en periode på 12 timer. Celler blev høstet og lyseret på forskellige tidspunkter. Total GSH-indholdet blev analyseret i et kolorimetrisk assay under anvendelse af 5,5′-dithio-bis- (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) som substrat. GSH-niveauer blev kvantificeret mod GSH standarder og er afbildet som pmol /mg total protein. 4 h (LNCaP) og 12 timer (PC-3) efter NAC behandling en markant stigning i de samlede GSH-niveauer blev opdaget. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD af celletal.
For at analysere, om behandling CAP inducerer produktionen af ROS eller snarere øger de intracellulære niveauer af peroxider, analyserede vi de proteinniveauer og redoxtilstanden af 2-Cys PRX1, PRX2 og Prx3. Desuden har vi undersøgt en potentiel sekretion af PRX1 og PRX2, som primært lokaliseret i cytosolen, i den ekstracellulære væske; Prx3 udelukkende placeret i mitokondrier, og derfor ikke var forventet en Prx3 sekretion [16, 17]. Under deres katalytiske mekanisme reducerer peroxider til vand, Prxs danne en intermolekylær disulfidbinding. Skiftet i størrelse kan let detekteres ved en Prx redox-blot, med celleprøver er forbehandlet med alkyleringsmidlet NEM, som irreversibelt binder reducerede thiolgrupper og beskytter dem mod yderligere oxidation. Da ROS produktion potentielt er en umiddelbar årsag til behandling af den fælles landbrugspolitik, vi høstede LNCaP og PC-3 celler straks og 1 time efter 10 s behandling fælles landbrugspolitik. Sammenlignet med argon behandlet kontroller, behandling CAP overdrevet sekretionen af cytosoliske PRX1 til den ekstracellulære væske efter 1 time (data ikke vist). Ingen væsentlige ændringer i sekretion af PRX2 kunne detekteres. Endvidere kunne vi ikke påvise signifikante ændringer i proteinniveauet af enhver af de 2-Cys-Prxs (Fig 8). Men for begge cellelinier LNCaP og PC-3, PRX1 og Prx3 viste, en forøget mængde af den oxiderede, dimere form følger umiddelbart efter behandlingen CAP (figur 8; PRX1; LNCaP: 1,41 fold, PC-3: 1,67 fold; Prx3; LNCaP: 3,63 fold; PC-3: 1,67 gange), målt som forholdet mellem den oxiderede, dimert protein sammenlignet med den totale (monomere plus dimert) protein efter behandling FLP, sammenlignet med argon-behandlede kontrolceller. Overraskende kunne ikke påvises dette umiddelbare oxidation efter eksponering landbrugspolitik for PRX2. For at analysere, om den forøgede mængde af oxiderede PRX proteiner er ikke kun en kortvarig effekt af behandling CAP, vi analyserede også LNCaP og PC-3 celler 1 time efter behandlingen af den fælles landbrugspolitik. 1 time efter behandling CAP vi ikke kunne påvise nogen tydeligere ændring af størrelsen af den oxiderede, dimere form af PRX1, PRX2 og Prx3 i begge cellelinier sammenlignet med argon-behandlede kontrolceller. Igen, ingen signifikante ændringer i ekspressionen eller sekretionen af 2-Cys Prxs var påviselige (Fig 8A). Ikke desto mindre, vi registreret en let forhøjet PRX2 oxidation i LNCaP celler 1 time efter behandling CAP ved hjælp af 2-Cys redox blot (figur 8).
LNCaP og PC-3 celler blev behandlet i 10 s med CAP eller argon (contr) hhv. Samme samt 1 time efter behandlingen blev celler behandlet med alkyleringsmidlet N-ethylmaleimid (NEM), der binder irreversibelt til reducerede thiolgrupper før cellelyse. Protein- niveauerne af cytosolisk PRX1 og 2, samt mitokondrie Prx3 blev analyseret i cellelysater, samt redoxtilstanden ved hjælp af ikke reducerende SDS PAGE og western-blot. A) repræsentant Prx redox blots af de tre analyserede peroxidaser PRX1, PRX2 og Prx3, viser det monomere Prx og under den katalytiske mekanisme genereret oxideret, dimere form. B) Densitometrisk kvantificering af de oxiderede Prxs forhold til den samlede Prx protein (monomer og dimer form).
Diskussion
CAP molekylære virkningsmekanisme stadig dårligt forstået. Den foreliggende undersøgelse kritisk undersøger virkningen af den fælles landbrugspolitik på PC celler og har til formål at undersøge hidtil ukendte molekylære mekanismer bag behandling af den fælles landbrugspolitik.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.