PLoS ONE: En Tri-Marker spredning Index forudser Biokemisk Gentagelse efter kirurgi for prostata Cancer

Abstrakt

Prostatakræft udviser enorm variation i klinisk adfærd, der spænder fra ugidelig til dødelig sygdom. Bedre prognostiske markører er nødvendige for at stratificere patienterne for passende aggressiv terapi. Ved udtrykket profilering, kan vi identificere en spredning signatur variabelt udtrykt i prostatakræft. Her har vi spurgt, om en eller flere væv biomarkører kan indfange disse oplysninger, og give prognostisk nytte. Vi analyseret tre spredning signatur gener:

MKI67

(Ki-67; også en klassisk spredning biomarkør),

TOP2A

(DNA topoisomerase II, alfa), og

E2F1

( E2F transkriptionsfaktoren 1). Immunohistokemisk farvning var evaluerbare på 139 radikal prostatektomi tilfælde (i væv microarray-format), med en median klinisk opfølgning på otte år. Hver af de tre proliferationsmarkører var i sig selv prognostisk. Især at kombinere de tre markører sammen som en “spredning indeks” (. 0 eller 1,

vs

2 eller 3 positive markører), forudsat overlegen prognostisk ydeevne (hazard ratio = 2,6 (95% CI: 1,4-4,9)

P

= 0,001). I en multivariat analyse, der omfattede præoperativ serum prostata specifikt antigen (PSA) niveauer, Gleason kvalitet og patologisk tumor fase, det sammensatte spredning indekset forblev en signifikant prædiktor (

P

= 0,005). Analyse af modtager-operating characteristic (ROC) kurver bekræftede den forbedrede prognosticering gav ved inkorporering proliferationsindekset (sammenlignet med de clinicopathologic data alene). Vores resultater fremhæve den potentielle værdi af en multi-gen signatur-baserede diagnostiske, og definere en tri-markør spredning indeks med mulighed nytte for forbedret prognosticering og behandling lagdeling i prostatakræft

Henvisning:. Malhotra S, Lapointe J , Salari K, Higgins JP, Ferrari M, Montgomery K, et al. (2011) En Tri-Marker spredning Index forudser Biokemisk Gentagelse efter operation for prostatakræft. PLoS ONE 6 (5): e20293. doi: 10,1371 /journal.pone.0020293

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Januar 20, 2011; Accepteret: April 28, 2011; Udgivet: 23. maj 2011

Copyright: © 2011 Malhotra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health: CA111782 (JDB), CA122246 (JRP), CTSA give UL1 RR025744 (Stanford Spectrum); og fra Burroughs Wellcome Fund: # 1007519 (JRP, JDB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en førende årsag til kræft dødsfald i USA [1]. Trods det, prostatakræft udviser betydelig variation i klinisk adfærd. Mange (hvis ikke de fleste) prostatakræft er klinisk indolent, mens andre er klinisk aggressiv, blive metastatisk og dødbringende. For lokaliseret prostatacancer, behandlingsmuligheder spænder fra aktiv overvågning ( “vågent venter”) til afgørende kirurgisk excision (radikal prostatektomi) eller strålebehandling [2], [3]. Docetaxel kemoterapi bliver også vurderet i adjuverende og neoadjuverende [4]. I stigende grad, er der behov for prognostiske biomarkører til præcist stratificere patienter til passende risikofrit tilpasset terapi

Aktuelle prognostiske faktorer omfatter Gleason kvalitet, tumor stadie, og præoperativ serum PSA [5] -. [8], og nomogrammer at kombinere sådanne oplysninger [9], [10]. er dog stadig stor usikkerhed, og som sådan mange mænd vælger unødigt aggressiv terapi. Andre foranstaltninger, f.eks tumorhistologi, DNA ploidi, proliferationsmarkører, og udvalgte cancer-gener, er også under evaluering [11] – [15]. Af disse markører af tumorcelleproliferation, f.eks S-fasen fraktion eller Ki-67 immunfarvning, er allerede i klinisk brug for andre typer kræft, herunder for eksempel brystkræft [16], gastroentero-pancreas neuroendokrine tumorer [17], og kappecellelymfom [18].

i tidligere undersøgelser, vi anvendte DNA microarrays for at profilere genekspression i prostatacancer [19]. Unsupervised gruppering af udtryk profiler afslørede distinkte tumor klynger (fastlæggelse molekylære undertyper), samt forskellige klynger (eller “funktioner”) af co-udtrykte gener, identificere de underliggende biologiske veje og processer. Blandt disse, en prominent gen-udtryk funktionen angiveligt reflekteret tumorcelleproliferation niveauer, og dens udtryk varieret betydeligt fra prostatakræft. Her har vi satte os for at karakterisere spredning signatur gener som væv biomarkører, og vurdere deres prognostisk anvendelighed.

Metoder

Molekylære signaturer

For at evaluere en celle proliferation signatur i prostatakræft, vi analyserede tidligere publiceret [19] cDNA microarray gen-udtryk profiler fra 71 prostatakræft og 41 normal prostata (uengagerede væv fra de modsatte lap) prøver. De microarray data er MIAME kompatibel, og de rå data er tilgængelige på GEO (tiltrædelse GSE3933). Hierarkisk klyngedannelse [20] blev anvendt på de 7.957 gener (cDNA’er), der var både godt målt (signal /baggrund 1,5 i mindst 50% af prøverne) og variabelt udtryk (≥2 gange udtryk ændring fra medianen i mindst 2 eksemplarer). En gen-klynge, der omfattede mange gener med kendte roller i celleproliferation (en formodet “proliferation signatur” klynge) blev yderligere bedømt. Overlapninger mellem den formodede spredning-signatur klynge (indeholdende 94 unikke gener) og 639 kanonisk vejen (BioCarta og Kegg) gen sæt blev evalueret ved brug af Molecular signaturer Database (MSigDB) [21] “beregne overlap” funktion, baseret på den hypergeometriske fordeling. Ki-67, TOP2A og E2F1 blev udvalgt blandt spredning signatur generne baseret på tilgængeligheden af ​​antistoffer er egnede til immunhistokemi på formalin-fikseret, paraffinindstøbt væv.

Tissue microarray kohorte

A væv microarray inkluderet 139 fuldt evaluerbare formalinfikserede, paraffinindlejrede primære prostata tumorer udvalgt fra diagnostiske radikal prostatektomi sager udført på Stanford University Hospital mellem 1986 og 1996, med Institutional Review Board godkendelse og skriftlig patient samtykke (protokol ID 11612) [19]. Hvert tilfælde var repræsenteret ved dobbelte 0,6 mm tumor kerner. Klinisk-patologisk karakteristika for de tilfælde er opsummeret i tabel 1. Patienterne blev behandlet med radikal prostatektomi alene, og kliniske opfølgning hver 6. måned inkluderet PSA-test og fysisk undersøgelse, medianen klinisk opfølgning var 8 år.

Immunhistokemi

Serial sektioner af 4 um blev skåret fra vævet microarray blokken, de-paraffinized i Citrisolv (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), og hydratiseres i en gradueret serie af alkoholopløsninger. Varmeinduceret antigen hentning blev udført ved mikrobølge forbehandling i citrat (1 mM, pH 6,0) i 15 minutter før farvning. Endogen peroxidase blev blokeret af præinkubering med 1% hydrogenperoxid i phosphatbufret saltvand. Ki-67 mus monoklonalt antistof (MIB-1, Dako, Nordamerika, Carpinteria, CA) blev anvendt ved 1:100 fortynding TOP2A monoklonalt muse-antistof (SWT3D1; Research Diagnostics, Flandern, NJ) ved 1:10 fortynding, og E2F1 muse-monoklonalt antistof (18E10, GeneTex, Irvine, CA) ved 1:200 fortynding hver i 30 min. Chromogen detektion blev udført under anvendelse et peroxidase-konjugeret sekundært antistof og DAB reagenser leveret med Envision detektion kit (Dako). Immunostains blev scoret af en patolog (J.P.H) blindet for kliniske data, og kriterierne for positivitet indstillet til at give et dynamisk område. For Ki-67 og TOP2A, blev stærk farvning i ≥5% tumor kerner scoret som positiv. For E2F1, som farves en højere andel af kerner, stærk farvning i ≥50% tumor kerner blev scoret som positive. Hvis en dublet kerne scoret positiv, blev sagen som positiv.

Statistisk analyse

Korrelationer mellem spredning biomarkører blev vurderet af Pearson korrelation. Associationer mellem spredning biomarkører og clinicopathologic variabler blev vurderet ved Fishers eksakte test. Kaplan-Meier plots og log-rank test blev brugt til at teste ligestilling mellem efterladte funktioner på tværs af prostatakræft grupper. Multivariate Cox proportionel risiko regressions analyse, med bånd håndteres af Efron appoximation, blev anvendt til at identificere de væsentlige prædiktorer for PSA gentagelse. Receiver-operating characteristic (ROC) kurver blev evalueret for de betydelige prædiktorer for PSA gentagelse. Alle analyser blev udført ved hjælp af R statistisk programpakke og WinStat software (R. Fitch Software, Chicago, IL).

Resultater

I vores tidligere undersøgelser, udtryk profilering af prostatakræft afslørede tydelig molekylære undergrupper samt gen-ekspression funktioner afspejler underliggende biologiske processer [19]. I en re-analyse af disse data, en prominent gen-ekspression funktion (fig. 1A) omfattede gener, der regulerer celle-cyklus (f.eks

CCNE1

,

CDK1

,

Cdc25A

), og er involveret i DNA-replikation (fx

POLE2

,

MCM4

,

TK1

) og kromosom dynamik (f.eks

SMC4

,

CENPE

), angiveligt afspejler tumorcelleproliferation niveauer. Denne funktion blev variabelt udtrykt tværs prostatakræft, og særligt fremtrædende blandt lymfeknudemetastaser, og en undergruppe af primære tumorer inden molekylære undertyper 2 og 3, undergrupper tidligere fundet at være mere klinisk-aggressive [19]. Evaluering overlapninger mellem denne klynge af gener og kanoniske pathwaygen-sæt i Molekylær Signatur Database [21] bekræftet en forbindelse til celle spredning; top fem signifikant (

P

0,01). overlappende gen indstiller alle relateret til celle-cyklus /sprednings veje (. figur 1B)

(A) Unsupervised klynge analyse af prostatakræft ( datasæt fra ref. [19]) afslører molekylære undertyper af prostatakræft (1, 2 og 3, mærket), og gen-ekspression funktioner afspejler underliggende biologiske processer.

Venstre

, miniature Heatmap af klyngen analyse.

Right

, forstørret billede af den “spredning cluster”, med udvalgte gener vist (

MKI67

,

TOP2A

og

E2F1

i rød tekst, markeret med pil). Røde og grønne ekspressionsniveauerne afspejler høje og lave værdier, henholdsvis (se tast). Rød fyldte cirkler (

under

) identificere lymfeknudemetastaser. (B) overlapning matrix af spredning klynge gener (N = 94) med kanoniske pathway (CP) gen sæt identificerer top gen sæt kampe (alle væsentlige,

P

0,001) alt vedrørende celle-cyklus /spredning . Konstant blå fyld indikerer overlappende medlemskab mellem spredning klynge og forespørges gen sæt.

Høje spredning satser i kræft er typisk forbundet med dårligere kliniske resultat. Vi søgte derfor at vurdere den prognostiske værdi af spredning signatur gener, enkeltvis eller i kombination, i prostatakræft. Baseret på tilgængeligheden af ​​antistoffer er egnede til immunhistokemi på formalin-fikseret, paraffin-indstøbt væv, valgte vi at fokusere på tre spredning signatur gener,

MKI67

(koder den klassiske celledeling markør, Ki-67) [22 ],

TOP2A

(DNA topoisomerase II, alfa), og

E2F1

(E2F transkriptionsfaktor 1) (fig. 1A).

Immunhistokemi blev udført på en væv microarray der indeholdt prostata kræfttilfælde fra radikal prostatektomi (tabel 1), der er forbundet med en median klinisk opfølgning på otte år. Alle tre proliferationsmarkører udviste den forventede nuklear farvning (fig. 2A). Interessant, mens Ki-67 og TOP2A typisk farves kun en lille brøkdel af tumor kerner, E2F1 ofte farves størstedelen af ​​tumorceller (Fig. 2A). Ki-67 og TOP2A immunfarvning tværs tilfælde var signifikant korreleret (R = 0,38,

P

0,001) (figur 2B.). Ki-67 og E2F1 var mindre korrelerede (blot mangler statistisk signifikans) (R = 0,13,

P

= 0,06), og noget overraskende, TOP2A og E2F1 ikke synes korreleret (R = 0,00,

P

= 0,50) (fig 2B)

(A) immunfarvning af proliferationsmarkører Ki-67, TOP2A og E2F1..; repræsentative positive og negative tilfælde vist. (B) parvise sammenligning af immunofarvningsprocedure vurdering mellem sager. Pearson korrelation (R) værdier vist. (C) Kaplan-Meier analyse af Ki-67 ( 5%

vs

≥5% tumor kerner.), TOP2A ( 5%

vs

≥5% tumor kerner. ) og E2F1 ( 50%

vs

≥ 50% tumor kerner) immunfarvning..

P

-værdier (log-rank test) viste. (D) Kaplan-Meier-analyse af kombineret markør-farvning (se nøgler).

P

-værdier (log-rank test) vist.

For at vurdere og sammenligne prognostisk værdi, vi udførte Kaplan-Meier analyser på det sæt af 139 sager, der kunne evalueres for alle tre proliferationsmarkører. Ki-67 positivitet (≥5% kerner farvning) viste en stærk tendens til tidligere biokemisk-recidiv efter prostatektomi (

P

= 0,107) (fig. 2C) (analyse af det fulde sæt af 156 tilfælde vurderes mht Ki -67 nået statistisk signifikans data ikke vist). TOP2A positivitet (≥5% kerner farvning) og E2F1 positivitet (≥50% kerner farvning) var signifikant associeret med tidligere recidiv (

P

= 0,028 og

P

= 0,043, henholdsvis) (Fig . 2C). Ingen af ​​de tre spredning biomarkører var signifikant forbundet med andre clinicopathologic funktioner, herunder præoperativ PSA, Gleason kvalitet og patologisk stadium (tabel 2).

Vi har også bestemt, om at kombinere markører kan forbedre prognostisk værdi. En sammenligning af tilfælde uden, en, to eller tre positive proliferationsmarkører viste signifikante forskelle (

P

= 0,009), i almindelighed med trinvise antal positive markører associeret med tidligere tilbagefald (fig. 2D). Stratificering sager med ingen eller en positiv markør,

vs.

Sager med to eller tre positive markører, herefter kaldet tri-markør “spredning index”, forudsat den største prognostiske betydning (

P

= 0,001), med en hazard ratio på 2,6 (95% konfidensinterval 1,4-4,9). Dette resultat var også tydelig ved analyse af ROC kurver (tabel 3; bemærk større areal under kurven for den tri-markør spredning indeks)

Især i en multivariat analyse, der omfattede kendte prognostiske markører. – præoperativ serum PSA, Gleason kvalitet og patologisk stadium, – det sammensatte proliferationsindekset forblev en signifikant prædiktor (

P

= 0,005) (tabel 4). Den forbedrede prognosticering gav ved inkorporering proliferationsindekset (sammenlignet med de clinicopathologic data alene) blev bekræftet ved sammenligning af Kaplan-Meier-kurver (fig 3A;. Bemærk de mere betydningsfulde log-rank test P-værdi) og af ROC-kurver (tabel 3 og figur 3B;. Bemærk det større areal under kurven)

(A) Kaplan-Meier analyse sammenligner multivariate modeller baseret på clinicopathologic data (

venstre

) og clinicopathologic data plus tri. markør spredning indeks (

rigtige

). Sager er grupperet efter tertil. Log-rank test

P

-værdier er angivet. (B) ROC kurve analyse sammenligner multivariate modeller baseret på clinicopathologic data (

venstre

) og clinicopathologic data plus tri-markør spredning indeks (

rigtige

). Analyse gøres på 8 år opfølgning (median follow-up tid for kohorten). Områder under kurven (AUC) er angivet.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi vurderet for prostatakræft den prognostiske anvendelighed af væv biomarkører for celleproliferation, identificeret fra ekspressionsprofil mønstre. To biomarkører, TOP2A og E2F1, scoret af immunhistokemi, blev hver prognostiske (og den klassiske markør Ki-67 næsten så). Navnlig kombinerer markører yderligere forbedret prognostisk værdi. Et sammensat spredning indeks (0,1

vs.

2,3 positive markører), forudsat den største prognostisk betydning, og beholdt værdi, når det kombineres med tiden anvendte prognostiske faktorer.

Markørerne vi evaluerede var udvalgt blandt prostatacancer proliferation klynge gener. Den “spredning signatur” (revideret i ref. [23]) er en almindeligt forekommende mønster i microarray studier. Først rapporteret i brystcancercellelinier og tumorer [24], spredning signatur er fremtrædende på tværs af forskellige cancertyper (i forhold til normalt væv) [25]. Dens medlemskab overlapper betydeligt med celle-cyklus regulerede gener [26], og dens tilstedeværelse korrelerer med celle fordobling gange i kultur [27], og Ki-67 farvning i tumorer [24], [25]. Spredningen signatur er også fundet prognostisk i brystkræft [28], [29] og i mantlecellelymfom [30].

Gene underskrifter sandsynligvis fange flere oplysninger end analyse individuelle gener, og faktisk multi-gen signatur assays har nået klinisk anvendelse [31] – [33]. Især to sådan brystkræft prognostiske /forudsigende signatur omfatter gener rapportering om celledeling [31], [32]. Imidlertid er mikroarray testning ikke let implementeres i den kliniske laboratorium. Vi spurgte derfor, om et lille antal gener effektivt kan fange de relevante oplysninger i spredning signatur, ved straight-forward immunhistokemi.

Vi vurderede tre spredning gener. Ki-67 (spredning-associeret Ki-67 antigen), kodet af

MKI67

gen og almindeligt identificeret af MIB-1 antistof, er en nuklear antigen udtrykt i prolifererende men ikke hvilende celler [34], selv om sin specifikke funktion er fortsat usikker. Tidligere undersøgelser har vist, Ki-67 at være en uafhængig forudsiger af resultatet i prostata kræftpatienter behandlet med radikal prostatektomi [35] – [39] eller strålebehandling [40]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, vi også fundet Ki-67 at være prognostisk, selvom det savnede betydning for undergruppen af ​​tilfælde, som kunne vurderes for alle tre proliferationsmarkører.

TOP2A er et type II DNA topoisomerase, styring af topologiske tilstand DNA (ved at katalysere forbigående dobbeltstrengede brud) under DNA-transkription, rekombination, replikation, og kromosom opdeling ved celledeling [41]. TOP2A er også et mål af flere antineoplastiske lægemidler, fx doxorubicin og etoposid. TOP2A ekspression ved immunhistokemi har vist sig at være prognostisk i bryst- [42] og ovarie [43] cancere. For nylig TOP2A transkript [44] og protein [45] niveauer har været forbundet med systemisk progression af prostatacancer. Vore egne data underbygger denne forening.

E2F1 er en central transkriptionel regulator af DNA-replikation og celle-cyklus progression, og reguleres negativt af RB1 tumor suppressor [46]. Rb /E2F-vejen afbrydes i de fleste kræftformer [47]. Især har en betydelig berigelse af E2F1 bindingssteder er fundet blandt de promotorområder af spredning signatur gener [48], og kendte mål omfatter for eksempel

CCNE1

,

Cdc25A

,

MCM4

,

TK1

, og

CENPE

[49]. Derfor E2F1 er ikke kun en spredning signatur gen, men selv en transskriptionel regulator af andre proliferation signatur gener.

E2F1 immunfarvning har vist sig at være prognostisk i bryst- [50] og lunge [51] cancere, og vi nu udvide dette til prostatakræft. Især mens E2F1, Ki-67 og TOP2A transkriptniveauer er alle celle-cyklus reguleret [26], vi generelt observeret E2F1 immunfarvning i en større del af tumorceller, i modsætning til Ki-67 og TOP2A, som farves kun et mindretal fraktion af celler. Som sådan kunne lave E2F1 positivitet være mere ligetil og reproducerbar, og yderligere evaluering af E2F1 som spredning og prognostisk markør i prostata og andre kræfttyper er berettiget.

Det er vigtigt, vi fandt, at lave tre proliferationsmarkører giver overlegen prognostisk information ihjel nogen enkelt. Hvorfor skal det være så? På udskriften niveau, E2F1, TOP2A og Ki-67 top ved forskellige stadier af cellecyklen, G

1 /S, G

2 og G

2 /M, henholdsvis [26]. Det er derfor muligt, at de tre markører tilsammen giver en mere komplet øjebliksbillede af prolifererende celler. Alternativt ved hjælp af tre markører kan “udglatte” unøjagtighed i patolog scoring. Hvorvidt herunder mere end tre proliferationsmarkører yderligere kan forbedre ydeevnen er ukendt, selvom vi bemærke, at tre markører er inden for området af, hvad der er praktisk til histologi laboratorier (hvor antistof-paneler er rutinemæssigt bestilt), og lettere, hurtigere og billigere end en mikroarray.

sammenfattende har vi vist, at en tri-markør spredning indeks giver forbedret prognostisk præstation i prostatakræft, tilføjer værdi over tiden anvendte prognostiske faktorer. Mens validering i yderligere kohorter, og på hele vævssnit, er berettiget, vores resultater tyder på, at spredning indeks kunne hjælpe med risiko lagdeling, til valg passende aggressive behandlinger (fx brug af adjuverende behandling), og i sidste ende forbedre patientresultater. Cleary, kliniske forsøg ville være nødvendigt at betragte fordelen med hensyn til prostatakræft-associeret sygelighed og dødelighed. Endelig er det værd at bemærke, at mange antineoplastiske lægemidler rettet mod celledeling [23], herunder taxaner som viser lovende i adjuverende /neoadjuverende indstillingen [4]. Derfor er det muligt (og værd at undersøge yderligere), at spredning indekset også kan vise nytte forudsige respons på specifikke kemoterapi.

Tak

Vi vil gerne takke medlemmerne af Pollack laboratorium for nyttige diskussion.