PLoS ONE: Nisin ZP, en Bakteriocin og konserveringsmiddel, Hæmmer hoved- og halscancer tumorigenese og forlænger overlevelse

Abstrakt

Brugen af ​​små antimikrobielle peptider eller bakteriociner, ligesom nisin, til behandling af kræft er en ny tilgang, der lover godt. Nisin eksempler på denne nye tilgang, fordi det har været anvendt sikkert i mennesker i mange år som en fødevare konserveringsmiddel, og de seneste laboratorieundersøgelser støtte for sin anti-tumor potentiale i hoved og halscancer. Tidligere viste vi, at nisin (2,5%, lavt indhold) har antitumor potentiale i hoved og hals pladecellekræft (HNSCC)

in vitro

in vivo

. De nuværende undersøgelser udforskede en naturligt forekommende variant af nisin (nisin ZP 95%, højt indhold) for sine antitumorvirkninger

in vitro

in vivo

. Nisin ZP inducerede den største grad af apoptose i HNSCC celler sammenlignet med lavt indhold nisin. HNSCC celler behandlet med stigende koncentrationer af nisin ZP udviste stigende niveauer af apoptose og mindsker niveauet af celleproliferation, klonogene kapacitet, og kugle formation. Nisin ZP induceret apoptose gennem en calpain-afhængige vej i HNSCC celler, men ikke i humane orale keratinocytter. Nisin ZP også induceret apoptose dosisafhængigt i humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) med samtidige fald i vaskulær spire dannelse

in vitro

og reducerede intratumoral mikrokar tæthed

in vivo

. Nisin ZP reducerede tumorigenese

in vivo

langtidsbehandling med nisin ZP udvidet overlevelse. Desuden nisin-behandlede mus udviste normal organ histologi uden tegn på inflammation, fibrose eller nekrose. Sammenfattende nisin ZP udstiller større antitumor effekter end lavt nisin indhold, og har således potentiale til at tjene som en ny terapeutisk for HNSCC

Henvisning:. Kamarajan P, Hayami T, Matte B, Liu Y, Danciu T , Ramamoorthy A, et al. (2015) Nisin ZP, en Bakteriocin og konserveringsmiddel, hæmmer hoved- og halscancer tumorigenese og forlænger overlevelse. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10,1371 /journal.pone.0131008

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, UNITED STATES

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: 26 maj 2015; Udgivet: Juli 1, 2015

Copyright: © 2015 Kamarajan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er til rådighed inden for papir og dens støtte Information fil

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af University of Michigan mCubed Funding # U036798 til YK, FPW, og AR. BM blev støttet af de brasilianske CAPES og CNPq sponsoreret, Science Uden Grænser Program. YL blev støttet af akademikere program fra Peking University School og Hospital Stomatologi

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er den sjette førende dødsårsag på verdensplan. Patienter diagnosticeret med HNSCC behandles med kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. I betragtning af dets anatomiske placering, HNSCC kirurgisk resektion er ofte ødelæggende og ofte fuldstændig fjernelse af tumor masse er ikke en farbar vej, ofte gør disse patienter med uhelbredelig sygdom efter behandlinger med kemo- og stråleterapi [1]. Der er begrænsede kemoterapeutiske muligheder for patienter, når deres sygdom er ikke længere modtagelig til at helbrede, og de lave 5-års overlevelsesraten for patienter med metastatisk HNSCC har ikke forbedret i årtier [2,3]. Disse kendsgerninger understreger, at det haster med at forbedre behandlingsmuligheder for disse patienter.

Et par rapporter har antydet, at antimikrobielle peptider eller bakteriociner har cytotoksiske virkninger mod cancerceller [4-8]. Givet dette interessante forudsætning undersøgte vi de cytotoksiske og antitumor egenskaber af antimikrobielle peptid, nisin, og fandt at det blokerer HNSCC tumorigenese [9]. Nisin er et 34-aminosyre polycyklisk antibakterielle peptid, som produceres ved fermentering af den grampositive bakterie

Lactococcus lactis

. Mange antibakterielle midler er effektive mod lignende bakteriearter; dog nisin har bredspektrede effekter, da det også inhiberer gramnegative bakterier [10]. Nisin er ikke giftigt for dyr og er sikker til konsum [11]. Nisin blev godkendt til humant brug som konserveringsmiddel ved World Health Organization (WHO) i 1969 og af Food and Drug Administration (FDA) i 1988, og det har fået en generelt anset-as-safe (GRAS) udpegning af FDA [12]. Det anslås, at 0,94 til 2,24 mg nisin forbruges per person per dag i USA [12]. Mens bakteriociner, som nisin, er blevet anvendt i årtier til forebyggelse af bakterievækst i fødevarer, har de først for nylig blevet testet til forebyggelse af vækst eller induktion af apoptose af cancerceller. Apoptose eller programmeret celledød er en naturlig proces, der eliminerer uønskede eller ældre celler. Men cancerceller er resistente over for apoptose. Således er der stor indsats for at forstå de mekanismer, der regulerer apoptose i disse celler, således at der kan udvikles nye midler til at inducere apoptose af cancerceller. Nisin kan tjene i denne egenskab og udvikling af nisin som et cancer terapeutisk let kan forfølges efter dosering bestemmelser.

For nylig har vi beskrevet, at nisin, kan tjene som en ny potentiel terapeutisk til behandling HNSCC [9]. Nisin medierer disse effekter ved at inducere fortrinsret apoptose, cellecyklus arrest, og reducere celleproliferation i HNSCC celler, i forhold til de primære keratinocytter. Nisin reducerer også HNSCC tumorigenese in vivo. Mekanistisk nisin udøver disse effekter på HNSCC, delvis gennem kation transport regulator homolog 1 (CHAC1), en proapoptotiske kationtransport regulator og gennem en ledsagende CHAC1-uafhængig indstrømning af ekstracellulært calcium [9,13]. Disse resultater støtter brugen af ​​nisin som et potentielt nyt terapeutisk for HNSCC, og da nisin er sikkert til konsum som konserveringsmiddel, dets oversættelse til et klinisk miljø kan lettes.

Nisin virker ved at ændre integriteten af den cellulære membran og danner kortlivede porer og derved ændre membranpotentialet [14]. Nisin bliver nedsænket i cellemembranen gennem de kationiske dele af aminosyrerne strækker til den ene side af molekylet. Disse kationiske dele interagerer med de negativt ladede phospholipid hoveder, mens den hydrofobe del af nisin samvirker med membranen kerne [15]. Nisin engagement med membranen, derfor medierer phospholipid reorganisering og tillader en tilstrømning af ioner [14,16]. Eftersom HNSCC celler og primære keratinocytter er forskellige i deres lipidmembranen sammensætning og funktion og respons på calciumstrømninger, nisin evne til at ændre transmembranpotentialet og membran sammensætning af celler kan føre til forskellige virkninger på disse celler [17-22]. Faktisk støtter vores data denne præmis som grundlag for nisin-medierede forskellen apoptotisk celledød og reduceret spredning af HNSCC celler i forhold til primære keratinocytter [9].

Da nisin rolle som en sikker bacteriocin for opbevaring af fødevarerne, og den viden, som andre bakteriociner besidder proapoptotiske egenskaber mod kræftceller, vores resultater om virkningerne af nisin på HNSCC tumorigenese hjælp som grundlag for nisin som en potentiel ny terapeutisk for HNSCC. Således var vores fokus i den aktuelle undersøgelse, at udvide denne baseline viden. Tidligere anvendte vi en 2,5% nisin (lavt indhold) formulering. I denne undersøgelse var det vores mål at teste effektiviteten af ​​en 95% nisin (højt indhold) på HNSCC celle apoptose og proliferation in vitro og på tumorigenese in vivo. Konkret har vi fokuseret på sit translationel potentiale ved at undersøge en meget ren, fødevaregodkendt form for nisin for sin in vivo og langsigtede virkninger. Til dette formål har vi testet to naturligt forekommende, høje nisin indhold varianter, nisin ZP og nisin AP. I betragtning af nisin sikkerhed til konsum, og givet sin in vitro og in vivo-effektivitet i HNSCC, kunne nisin udvikles som en ny cancer terapeutisk for HNSCC.

Materialer og metoder

Institutional Review Board Godkendelse

Denne undersøgelse er blevet godkendt af og blev gennemført i overensstemmelse med reglerne fastsat for den institutionelle review board og udvalget om anvendelse og pasning af dyr på University of Michigan.

Cell kultur

Fire humane HNSCC cellelinier blev anvendt til disse undersøgelser. HNSCC cellelinje autentificering og oprindelse blev leveret af deres kilder og offentliggjort udførligt. De humane HNSCC cellelinjer, UM-SCC-17B (supraglottis /blødt væv-hals) og UM-SCC-14A (gulvet i munden) blev leveret af Dr. Thomas Carey (Professor, University of Michigan, MI) [23]. Den mundtlige SCC cellelinje HSC-3 (tunge) blev leveret af Dr. Randall Kramer (professor, University of California, San Francisco, Californien) [24]. Den mundtlige SCC cellelinje, OSCC-3 (tunge) blev leveret af Dr. Mark Lingen (professor, University of Chicago). HNSCC celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin og 1% streptomycin. Normale-humant navlevene-endotelceller (HUVEC’er) og ledsagende celledyrkningsmedier og kosttilskud (EGM-2 Bullet Kits) blev opnået fra Lonza (Allendale, NJ). Human rekombinant VEGF165 blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og Matrigel Matrix blev opnået fra BD Biosciences (San Jose, CA). HUVEC’er blev dyrket i EGM-2 basale medier ved 37 ° C i 5% CO

2.

Nisin

nisin A og nisin Z er to naturligt forekommende varianter af nisin, der produceres ved fermentering af

Lactococcus lactis

og de er forskellige ved en enkelt aminosyrerest i position 27; histidin i nisin A og asparagin i nisin Z [25]. Højt indhold former af disse to varianter, nisin ZP og nisin AP (95% indhold /ultrarent,% vægt /vægt; vandholdigt potens ≥38,000 IU /mg) blev indkøbt fra Handary (Bruxelles, Belgien) og lavt indhold nisin A (2,5% indhold i balance natriumchlorid og denaturerede mælketørstof; potens ≥1,000,000 per IU /g) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (N5764). Nisin ZP og AP og lavt indhold nisin blev rekonstitueret i vand og anvendes til alle eksperimenter.

Cell Proliferation og kolonidannelse Analyser

For at bestemme virkningen af ​​nisin på celleproliferation, den CyQUANT NF Cell proliferation Assay Kit blev anvendt ifølge producentens anvisninger (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY). For kolonidannelse assays blev 2000 celler podet i en 6-brønds plade. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af nisin ZP i 48 timer. Efter behandling blev frisk medium tilsat hver 2. dag i en periode på 10 dage. Kolonier blev derefter farvet med 0,5% krystalviolet, og kolonier, som indeholdt 50 celler blev talt. Forsøg blev gentaget tre gange.

Orasphere Assay

Sphere assays blev anvendt til at vurdere forankringsuafhængig vækst, en egenskab menes at bidrage til metastatisk potentiale. HNSCC oraspheres (UM-SCC-17B) blev fremstillet som tidligere beskrevet [26-29]. Kort sagt, celler, der overlever forankringspunkter tilbagetrækning danner flercellede aggregater eller oraspheres. Oraspheres blev udviklet ved at opretholde celler under suspension betingelser på poly (2-hydroxyethylmethacrylat) (poly-HEMA) coatede plader (7,5 mg /ml i 95% ethanol, Sigma-Aldrich) i 36 timer. En orasphere defineres som et aggregat af celler, som er mindst 50 um i diameter. Det samlede areal er besat af oraspheres i hver brønd blev kvantificeret for hver behandling tilstand ved hjælp NIS-Elements BR4.13.04 imaging software. Eksperimenter blev udført tre gange. Nisin blev tilsat til hver brønd på tidspunktet for celleudpladning.

apoptoseassays Salg

For at bestemme virkningerne af tre forskellige former for nisin på HNSCC celle apoptose tre forskellige assays blev udført. Apoptose blev vurderet i nisin behandlede celler ved anvendelse af en direkte farvning metode, en flowcytometri-baseret assay, og et western blotting kan evaluere kendte apoptotiske signalproteiner

Apoptose:. Farvning og mikroskopi

Ethidium bromid og acridinorange (EB /AO) farvning blev anvendt til måling af apoptose som tidligere beskrevet [30]. Til disse assays blev celler udpladet i plader med 96 brønde ved 2 x 10

4 celler /cm

2, og efter 24 timer, behandlet med forskellige koncentrationer af nisin (0, 100, 200, 400 og 800 ug /ml) i 24 timer. Celler blev derefter farvet med en EB /AO plet. EB blev opnået fra Bio-rad (Berkeley, CA) og AO blev opnået fra Acros Organics (Geel, Belgien). EB /AO farvereagens bestod af 100 ug /ml ethidiumbromid og 100 ug /ml acridinorange i PBS. EB /AO farvestof blev tilsat til hver brønd, fjernet, og derefter billeder af farvede celler blev taget med et mikroskop udstyret med en digital imaging system (Eclipse 50i Nikon, Melville, NY). Celler blev talt, og baseret på deres farve, blev klassificeret som enten vital, apoptotiske eller nekrotiske. AO gennemtrænger alle celler og gør kernerne fremtræder grønt. EB er kun optages af celler, når cytoplasmatiske membran integritet går tabt, og det pletter kernerne, så de røde. Således tidligt apoptotiske celler fremtræder grønt med lysegrønne prikker i kernerne følge chromatinkondensering og nuklear fragmentering. Sent apoptotiske celler synes orange (kombination af grønne og røde farver) med større chromatinkondensation og nuklear fragmentering. Nekrotiske celler vises som orange men deres cellekernemorfologi ligner den for levedygtige celler, der er således et fravær af chromatinkondensering. Procentdelen af ​​celler i hver kategori blev bestemt ved tælling mindst 100 celler. Eksperimenter blev udført tre gange

Apoptose:. Flowcytometri

Procentdelen af ​​apoptotiske celler fremkaldt af nisin behandling blev bestemt ved flowcytometri. Kort fortalt blev cellerne løsrevet ved inkubation med enzym-fri dissociation buffer (Invitrogen), pelleteret ved centrifugering, og farvet med Annexin V (BD Pharmingen) til analyse ved flowcytometri (FACSDiVa cellesorterer, Becton Dickinson).

Apoptose: Western Blotting

for at vurdere effekten af ​​nisin ZP på ekspressionen af ​​pro-apoptotiske proteiner i HNSCC celler, vi udførte Western blot analyser af UM-SCC-17B-celler, der blev behandlet med nisin ZP i 18 timer . En calpaininhibitor blev også undersøgt i denne sammenhæng for sin evne til at vende de apoptotiske effekt induceret af nisin ZP; nemlig blokering PARP-spaltning. Den calpaininhibitor blev købt fra Sigma-Aldrich (A6185, St. Louis, MO), rekonstitueret i vand, og anvendes i en koncentration på 500 nM. Efter forskellige behandlinger blev celler opsamlet, vasket en gang med phosphatpufret saltvand og lyseret i 30 minutter, mens på is i radioimmunoprecipitatation assay (RIPA) buffer (R0278, Sigma-Aldrich), som indeholdt en 1% protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma- Aldrich). Lysater blev justeret for proteinkoncentration med BCA-proteinassay-kit (Bio-Rad, Berkeley, CA). Proteinlysater blev opløst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA). Western blot-analyser blev udført ved anvendelse af et anti-poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) primært antistof, et caspase-3 primære antistof (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), et calpain primært antistof (MAB3083, Millipore), efterfulgt af en peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-antistof (SC-2004 Santa Cruz Biotechnology) eller anti-muse-antistof (A9044, Sigma-Aldrich). Blots blev derefter fremkaldt med ECL-plus detektionssystem (Pierce). For at evaluere prøverne for lige protein lastning blev membraner strippet og testet igen med en anti-β-actin antistof (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).

In vitro angiogenese Assay

For at bestemme virkningen af ​​nisin ZP på angiogenese, udførte vi in ​​vitro spire assays [31]. For spire assays blev HUVEC’er trypsinbehandlet og suspenderet i endotelcellevækst medier (EGM-2) indeholdende 50 ng /ml rekombinant vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og forskellige koncentrationer af nisin ZP (0, 100, 400 og 800 ug /ml ). Celler blev podet ved 1 x 10

4 celler /cm

2 i Matrigel coatede plader med 96 brønde og inkuberet natten over. Billeder af spirerne blev taget med EVOS XL Core Imaging System (Life Technologies, Grand Island, NY), så samlet spire længde blev målt ved hjælp af billede J (National Institutes of Health). Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Immunohistokemiske Analyser

For at vurdere nisin virkninger på angiogenese in vivo blev immunohistokemiske analyser brugt til at evaluere CD31 udtryk, en endotel celleadhæsionsmolekyle, i mus tumor vævssnit. Kort fortalt, efter antigen-genvinding af mikrobølge forbehandling (citratpuffer, 10 mM, pH 6,0) blev objektglassene inkuberet med en CD31 primært antistof (DIA-310, Dianova, Hamburg, Tyskland) natten over ved 4 ° C. Efter diaminobenzidin kromogen (DAB) reaktion, blev slides kontrastfarvet med rutine hæmatoxylin. Immunhistokemisk farvning for CD31 blev sorteres og scoret af en patolog på en blindet måde.

Oral cancer musemodel

For at undersøge in vivo antitumor virkninger af nisin ZP, en kræft oral gulv-of- mund musemodel blev anvendt. UM-SCC-17B-celler blev injiceret submukøst i gulvet af munden i mus som beskrevet tidligere [9, 28, 29, 32]. Alle protokoller for de in vivo studier blev godkendt af udvalget om brug og pleje af dyr på University of Michigan. Specifikt blev celler dyrket til 70% konfluens, suspenderet i DMEM, blandet med et tilsvarende volumen af ​​vækstfaktor-reducerede Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences, San Jose, CA) i en endelig koncentration på 1,25 x 10

4 /0,05 ml. Seks uger gamle athymiske nøgne mus (ncr-nu /nu-stamme, NCI, Frederick, MD) blev bedøvet ved intraperitoneal injektion med 100 mg /kg ketamin og 10 mg /kg xylazin. En samlet volumen på 0,05 ml af SCC celle /Matrigel suspension blev injiceret submukøst i gulvet af munden. Tre uger efter tumorcellelinier injektioner og upon bekræftelse på, at tumorer blev etableret, blev dyr ligeligt fordelt i seks grupper: en kontrolgruppe, der fik vand (lige volumen /kontrol) ved oral gavage i 3 uger og fem forskellige behandlingsgrupper, der blev givet nisin behandling ved oral sondeernæring i 3 uger. Efter tumorcelle- injektioner blev musene overvåget hver anden dag. Behandlingsgrupperne bestod af mus, som modtog nisin ZP ved to forskellige koncentrationer (400 og 800 mg /kg per dag), og mus, som modtog nisin AP ved to forskellige koncentrationer (400 og 800 mg /kg per dag). Der var også en anden gruppe af mus, der blev givet nisin ZP (800 mg /kg per dag) over en længere tidsperiode (måneder). Efter gennemførelsen af ​​nisin indgivelse blev musene aflivet ved CO

2 overdosis og cervikal dislokation, så tumorer blev høstet, skyllet i phosphatpufret saltvand (PBS), afbildes, og fikseret natten over i 10% pufret formalin. En digital skydelære blev anvendt til at bestemme tumor volumen ved hjælp af formlen

en

x

en

x

b

/2, hvor

en

er den mindste dimension. Generelt blev musene aflivet, hvis mus udviste fysiologiske tegn på stress fra manglende evne til at spise eller drikke, vægttab, eller når tumorvolumener nå en række 300-500mm

3, og dermed mus blev generelt aflivet ved ca. 3 uger for på kort sigt protokol. Mus blev aflivet ved en CO

2 overdosis.

Statistisk analyse

Generelt værdier blev udtrykt som middelværdi ± SD. Forskelle mellem grupperne blev analyseret af variansanalyse (ANOVA) og Tukey-Kramer HSD test. Til in vivo studier blev uafhængige t-tests med ulige varians anvendes.

Resultater

Nisin ZP og nisin AP inducere signifikant HNSCC celle apoptose dosisafhængigt og videre i lavt indhold nisin

behandling med både nisin ZP (95%) og nisin AP (95%) inducerede betydelige stigninger i apoptose i HNSCC celler (UM-SCC-17B og HSC-3) sammenlignet med behandling med lavt indhold nisin (2,5% ) (fig 1A og 1B). Apoptose blev målt ved anvendelse af ethidiumbromid og acridinorange (EB /AO) farvning og mikroskopi. Virkningerne af nisin ZP og AP på apoptose var dosisafhængig og øget som nisinkoncentrationer ZP og AP øges fra 200 til 400 og /ml. Selv om forskellene i apoptose mellem nisin ZP og nisin AP ikke var væsentlig, nisin ZP udstillet bedre opløselighed, og dermed de fleste eksperimenter blev udført med nisin ZP.

A og B

, grafer, der viser ændringer i procentdelen af ​​apoptotiske HNSCC celler (HSC-3 og UM-SCC-17B) behandlet med kontrolmedium eller medier indeholdende 2,5% nisin, 95% nisin AP, eller 95% nisin ZP i 24 timer. Celler blev derefter farvet under anvendelse af en ethidiumbromid og acridinorange (EB /AO) plet og talt. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05.

C

, mikroskopiske billeder viser morphologhy af HNSCC celler behandlet med kontrol medier eller medier indeholdende nisin ZP (100-800 mikrogram /ml) i 24 timer og derefter farvet med EB /AO (Scale barer, 100 um).

DF

, grafer, der viser ændringer i procent af vitale, apoptotiske og nekrotiske celler (UM-SCC-17B, HSC-3 og normale orale keratinocytter) behandlet med kontrol medier eller medier indeholdende nisin ZP (400 eller 800 mg /ml) i 24 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05 vitale celler; # P. 0,05 apoptotiske celler

Desuden effekten af ​​nisin ZP på HNSCC celle apoptose var signifikante hele en bred vifte af doser fra 100, 200, 400 og 800 mg /ml (Fig 1C- 1E) og i flere HNSCC cellelinier (UM-SCC-17B og HSC-3). Koordineret, celler behandlet med stigende doser af nisin ZP udviste signifikant faldende antal vitale celler og signifikant stigende antal apoptotiske celler, mens antallet af nekrotiske celler forblev relativt lav og konstant. I modsætning hertil primære keratinocytter ikke udviser forbedrede niveauer af apoptose som det ses i HNSCC cellelinier (figur 1F).

Nisin ZP inducerer apoptose via calpain, caspase 8 og PARP spaltning

For yderligere undersøge mekanismen for nisin-medieret apoptose, vi ansat yderligere apoptotiske assays og adspurgte kendte apoptotiske signalproteiner. Fire forskellige HNSCC cellelinjer blev undersøgt for deres nisin lydhørhed. Nisin signifikant øget apoptose i alle fire HNSCC cellelinier som vurderet ved annexin V farvning og flowcytometri (Fig 2A).

En

, grafer, der viser ændringer i procentdelen af ​​apoptotiske celler (UM-SCC -17B, HSC-3, UM-SCC-14A og OSCC-3) behandlet med kontrolmedium eller medium indeholdende nisin ZP (400 ug /ml) i 24 timer. Celler blev derefter farvet med Annexin V og apoptose blev vurderet med flowcytometri. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05.

B

, Immunoblots viser calpain 1, caspase-8, caspase-3 og PARP proteinniveauer i HNSCC (UM-SCC-17B) og

C Salg, normale humane orale keratinocytter cellelysater efter behandling med nisin ZP i 18 timer.

D

, Immunoblots viser PARP og calpain 1 aktivering i HNSCC cellelysater efter behandling i 18 timer med kontrol- medier, medier indeholdende nisin ZP (400 ug /ml), medier indeholdende en calpaininhibitor (ALLN, 500 nM) eller medier, der indeholder både en calpaininhibitor (ALLN, 500 nM) og nisin (400 ug /ml).

D

, An immunoblot for ß-actin viser lastning kontrol.

Da vores tidligere fund, at nisin medierer calcium-afhængig apoptose, vi udforskede den potentielle inddragelse af calpain, en kendt calciumafhængig mediator af apoptose [9]. Faktisk nisin behandlet HNSCC celler udviste nedsat ekspressionsniveauer af calpain 1 lille underenhed, der indikerer calpain 1 aktivering (figur 2B). Den faldende ekspression af calpain 1 lille underenhed spejlede de stigende doser af nisin ZP 100-400 ug /mL, og således var dosisafhængig.

For yderligere at undersøge mekanismen for apoptose induceret af nisin ZP, caspase -8 og caspase-3 spaltning blev undersøgt i denne sammenhæng. Nisin induceret caspase-8-aktivering på en dosis-afhængig måde (figur 2B). Men behandling af HNSCC celler med nisin ZP induceret caspase-3 uafhængig apoptose (fig 2B). Western blotting for caspase-3 i nisin ZP behandlede celler viste stabile niveauer af caspase-3-ekspression og fraværet af caspase-3-spaltning uanset nisinen testede dosis (figur 2B).

Nisin ZP behandlede celler udviste også poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning, et kendetegn for apoptose (fig 2B). PARP-spaltning forøget dosisafhængigt som nisin ZP doser øges. For at bestemme om nisin-medieret PARP-spaltning var et calpain-afhængig mekanisme, blev en calpaininhibitor (ALLN) undersøges i denne sammenhæng (fig 2C). Behandling af HNSCC celler med både nisin ZP og en calpaininhibitor, faktisk formindskes PARP-spaltning, sammenlignet med celler behandlet med nisin alene. Normale humane orale keratinocytter udviste ikke aktivering af calpain, caspase-8, caspase-3 eller PARP som respons på behandling med nisin ZP (Fig 2D). Således nisin ZP induceret apoptose af HNSCC celler via aktivering /kløvning af calpain, caspase-8 og PARP, men uafhængigt af caspase-3 spaltning.

Nisin ZP og nisin AP reducere HNSCC celledeling tids- og dosis -dependently

virkningerne af nisin ZP og AP på HNSCC celledeling blev undersøgt næste, og vi fandt, at behandling med både nisin ZP og nisin AP væsentligt reduceret HNSCC celle (UM-SCC-17B) proliferation (fig 3A ). Virkningerne af nisin ZP og AP på HNSCC celleproliferation var dosisafhængig, idet spredning niveauer faldt som koncentrationen af ​​nisin ZP og AP steg fra 400 til 800 ug /ml. Desuden er forskellene i HNSCC celleproliferation induceret af nisin ZP versus nisin AP behandling var signifikant, således at virkningerne induceret af nisin ZP var mere udtalt. Således givet de større effekter af nisin ZP reducere spredning og i betragtning af den forbedrede opløselighed af nisin ZP løbet nisin AP blev nisin ZP udvalgt til yderligere undersøgelse. Virkningerne af nisin ZP på HNSCC celleproliferation var signifikant overalt i en bred vifte af doser fra 100 til 800 ug /ml og i flere HNSCC cellelinjer (Fig 3B). Også den nisin ZP-medieret reduktion i HNSCC celleproliferation var tidsafhængig, der viser signifikante virkninger på 6, 12, 24 og 48 timer (fig 3C). Den reducerede celleproliferation sandsynligvis afspejler til dels cellecyklusstandsningen medieret af nisin [9]; yderligere fremgår af nedsat fosforylering af cellecyklus checkpoint markør, cdc2 (S1 Fig).

A

. Grafer, der viser ændringer i celleproliferation i UM-SCC-17B-celler behandlet med kontrolmedium eller medium indeholdende nisin AP eller ZP (400 eller 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05. Sammenligning # mellem nisin AP og nisin ZP * p ≤ 0,05.

B

. Grafer, der viser ændringer i celleproliferation i HNSCC celler (UM-SCC-17B, HSC-3 og UM-SCC-14A) behandlet med kontrolmedium eller medier indeholdende stigende doser af nisin ZP (100 til 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05. ¶Comparison mellem 100 ug /ml gruppen i forhold til kontrollen for UM-SCC-17B-celler * pμ0.05.

C

. Grafer, der viser ændringer i celleproliferation i UM-SCC-17B-celler behandlet med kontrolmedium eller medium indeholdende nisin ZP (400 ug /ml) i 6, 12, 24 og 48 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05.

D

, Billederne er af UM-SCC-17B celler behandlet i 48 timer med kontrol medier eller medier indeholdende nisin ZP (400 eller 800 mikrogram /ml) og derefter dyrket i 10 dage, farves med krystalviolet og afbildet til evaluere klonogene kapacitet.

E

, Grafen viser procentdelen af ​​kolonier til stede i forhold til kontrol for analyser måler klonogene kapacitet. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p 0,05.

F

. Grafer, der viser ændringer i celleproliferation i normale humane orale keratinocytter behandlet med kontrolmedium eller medium indeholdende nisin ZP (100, 200, 400 eller 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p. 0,05

Nisin ZP reducerer HNSCC celle kolonidannelse

Vi nærmere virkningerne af nisin ZP på celledeling ved at måle de langsigtede effekter ved hjælp af koloni dannelse analyser. Efter aftale med de kortsigtede proliferationsassays, behandling med nisin ZP hæmmede koloni dannelse i HNSCC celler (Fig 3D og 3E). De hæmmende effekt på kolonidannelse var dosisafhængig, da kolonidannelse mindsket betydeligt som nisinen ZP dosis øges fra 400 til 800 mikrogram /ml. HNSCC celler behandlet med disse to doser udviste en 2 og 50 gange formindskelse i klonogene kapacitet. Nisin ikke hæmme proliferation i normale humane orale keratinocytter gerne, at i HNSCC celler (Fig 3F).

Nisin ZP blokerer orasphere dannelse

Vi fandt endvidere, at behandling med nisin ZP betydeligt blokeret orasphere dannelse eller forankringsuafhængig vækst (fig 4A og 4B). Orasphere dannelse eller ankerplads uafhængig vækst er en egenskab, der bidrager til tumorigent potentiale. Nisin ZP virkninger på orasphere dannelse var dosisafhængig, således at den samlede orasphere areal faldt støt efter behandling med nisin doser fra 100, 200, 400 og 800 mg /ml.

En

, Phase kontrast billeder og

B

, graf, der viser procentdelen af ​​orasphere hæmning (samlet areal) i HNSCC celler (UM-SCC-17B) dyrket under suspension betingelser og behandlet med kontrol medier eller medier, der indeholder nisin ZP (100 til 800 mg /ml) i 36 timer. Sammenligninger mellem grupper i forhold til kontroller blev analyseret ved ANOVA med signifikansniveau sat til * p. 0,05

Nisin ZP inducerer endothelceller apoptose og hæmmer angiogene spiring

Vi har tidligere viste at behandling med lavt indhold nisin inhiberede tumorvækst og resulterede i små blege tumorer, hvilket antyder, at nisin ramme udbuddet tumor blod. Vi har også tidligere rapporteret, at nisin s antitumorvirkninger blev medieret af CHAC1, en proapoptotiske inducer i endotelceller [9].