PLoS ONE: Kræft Gener hypermethyleret i humane embryonale Stem Cells

Abstrakt

Udviklingsmæssige gener tavshed i embryonale stamceller fra en bivalent histon-baserede kromatin mærket. Det er blevet foreslået, at dette mærke giver også en prædisposition for afvigende DNA promotor hypermethylering af tumorsuppressorgener (GTS) i cancer. Vi rapporterer her, at lyddæmpning af en betydelig del af disse GTS’er i humane embryonale og voksne stamceller er forbundet med promoter DNA hypermethylering. Vores resultater indikerer en rolle for methylering af DNA i kontrollen af ​​genekspression i humane stamceller og foreslå, at for gener undertrykkes af promotor hypermethylering i stamceller

in vivo

, det uregelmæssige proces i cancer kunne forstås som en defekt i oprettelse af et methyleret promotor under differentiering, snarere end som en unormal proces med

de novo

hypermethylering

Henvisning:. Calvanese V, Horrillo A, Hmadcha A, Suarez-Álvarez B, Fernandez aF , Lara E, et al. (2008) Cancer Gener hypermethyleret i humane embryonale stamceller. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10,1371 /journal.pone.0003294

Redaktør: Maarten M. S. van Lohuizen, Holland Cancer Institute, Holland

Modtaget: April 30, 2008; Accepteret: September 1, 2008; Udgivet: 29 September, 2008

Copyright: © 2008 Calvanese et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev primært støttet af den Europæiske Union (LSHG-CT-2006 til 018.739, ESTOOLS). MFF er finansieret af den spanske Ramon Cajal programmet og sundhedsmyndighederne i den spanske regering (PI061267). Den Cancer Epigenetik gruppen ved CNIO understøttes af Health (FIS01-04) og uddannelse og videnskab (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC og Consolider MEC09-05) Institutter for den spanske regering, den europæiske Grant TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, og den spanske sammenslutning Against Cancer (AECC). VC er en modtager af et stipendium fra FPU spanske forskningsprogram. CLL og BSA understøttes af Health Department for den spanske regering (PI051707). Den BACM er støttet af Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (0029 og 0030/2006 til PM) og det spanske sundhedsministerium til PM (FIS PI070026). CB er støttet af International José Carreras Foundation mod leukæmi (EDThomas-05) og ISCIII (FIS 3 + 3 kontrakten). Institut for rekonstruktionskirurgi neurobiologi modtaget yderligere støtte fra DFG og Hertie Foundation. BS, ABH og ANH understøttes af Fundación Progreso y Salud og Instituto de Salud Carlos III-Red Española de Terapia Mobilen (RD06 /0010/0025). PWA, NH og HDM understøttes også af MRC

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I løbet af fosterudviklingen. er celler indledningsvist totipotente men, efter et par divisioner, begynder at miste styrke og transformeres til pluripotente celler, endelig bliver terminalt differentierede somatiske celler. Den gradvise tab af styrke under differentiering har grundlæggende betydning for sygdom, fordi inddrivelse af pluripotens gennem nukleare omprogrammering er en af ​​de store udfordringer i regenerativ medicin [1], og fordi afbrydelse af den udviklingsmæssige proces, der giver anledning til en terminalt differentieret somatisk celle fra sin svarende progenitorceller kan resultere i malign transformation [2].

Differentiering af humane embryonale stamceller (hESCs) kræver undertrykkelse af transkriptionsfaktorer involveret i at opretholde pluripotens og aktiveringen af ​​udviklingsmæssige gener. Begge processer er instrueret af specifikke epigenetiske mekanismer. Et eksempel på den første type er promotoren hypermethylering-afhængige undertrykkelse af pluripotens-bevarende gener, såsom NANOG og OCT4 som stamceller differentierer [3]. Hidtil aktivering af udviklingsmæssige gener under stamcelledifferentiering ved DNA-methylering er blevet mindre grundigt undersøgt. I stedet har disse udviklingsmæssige gener blevet rapporteret som værende i en undertrykt tilstand under tidlige stadier af udvikling som følge af etableringen af ​​et bestemt mønster af histon modifikation, betegnet “bivalente domæner”, der består af store områder af H3 lysin 27 methylering huser mindre regioner af H3 lysin 4 methylering [4]. Denne chromatin-undertrykkende status medieres af Polycomb gruppe af proteiner [5], [6] og menes at prædisponere for afvigende promotor hypermethylering i cancer [7] – [9]. Konstateringen af, at behandlingen af ​​hESCs med demethyleringsmiddel narkotika 5′-Aza-2′-deoxycytidin forårsager hjerte-differentiering og gen-reaktivering [10] fik os til at overveje, om promotor DNA methylering kan bidrage til etablering og vedligeholdelse af specifikke-gen undertrykkelse i hESCs . At etablere sin eksistens og dens formodede forhold med afvigende promotor hypermethylering i kræft, vi sammenlignede promotor DNA methylering mønster af et panel af 800 kræftrelaterede gener mellem hESCs og forskellige typer af terminalt differentierede voksne væv og cancer cellelinjer.

Resultater

Promoter DNA methylering profilering i hESCs, normale differentierede væv og kræft prøver

Vi brugte Illumina Goldengate methylering Arrays © at sammenligne status DNA methylering af 1.505 sekvenser (fra 807 gener) i otte uafhængigt isolerede hESCs linjer, 21 normale humane primære væv (NPTs) svarende til seks normale vævstyper (NTTS) og 21 humane cancercellelinier (CCLS) (se fremgangsmåder). Generne inkluderet i de methylering arrays blev valgt på grundlag af deres betydning for cellulær adfærd og differentiering og inkluderet gener tidligere er rapporteret til at være differentielt methyleret, samt tumorsuppressorgener, onkogener og gener, der koder for faktorer involveret i cellecyklus kontrol punkt [ ,,,0],11]. Vi først udvalgt de autosomale gener (766) fra de arrays for at udelukke DNA-methylering-afhængig X kromosom inaktiveret gener. Som tidligere rapporteret, ukontrollerede klyngedannelse af prøverne udelukkende ved hjælp af methylering signalerne fra autosomale gener (1.421 sekvenser), der er indeholdt i de arrays aktiveret den korrekte klassificering af hver prøve inden for sit tilsvarende gruppe (embryonale, NPT, eller CCL) (figur 1A, og se figur S1 i de supplerende online data for denne artikel), hvilket bekræfter, at hver gruppe af prøver har en specifik DNA-methylering signatur [11]. Vi forsøgte derefter at klassificere generne i opstillingen i forhold til deres status for methylering i de tre typer prøve analyseret (embryonale, CCL, og NPT) (figur 1A, og tabel 1 og S1). Vi fandt, at 65,31% (928 /1.421) af sekvenserne ikke blev ofte hypermethyleret i hESCs (array signal≤0.7 in≥25% (2/8) af prøverne), og at halvdelen af ​​dem (464/928) blev ofte hypermethyleret i CCLS (matrix signal 0,7 in≥25% (6/21) af prøverne). Langt størstedelen af ​​disse sekvenser (99,78%, 463/464) var umethyleret i mindst én af NTTS analyseres (matrix signal 0,3 in≥1 /6 NTTS). Denne konstatering er i overensstemmelse med det synspunkt, at gener afvigende hypermethyleret i cancer (dvs. ikke hypermethyleret i normale væv) ikke hypermethyleret i hESCs [8]. Vi kaldes denne gruppe af gener klassisk klasse A cancer hypermethyleret gener (Tabel 1 og S1).

(A) methylering profiler af klasse AI (350), A-II (94), BI (20), og B-II (107) gener i hESCs (8), normal (21), og cancerpatienter (21) prøver opnået ved Illumina arrays. De methylering varierer fra fuldt methylerede (rød) til fuldt methylerede (hvid). De højre kolonner viser status methylering af histon H3 og Polycomb belægning af de samme gener opnået fra tidligere offentliggjorte oplysninger [5], [12], [16]. Blå, methylering ved K4 og K27; orange, methylering ved K4 alene; grøn, ingen methylering ved K4 eller K27; sort, tilstedeværelsen af ​​Polycomb protein SUZ12. (B) Tilsætning til Polycomb protein SUZ12, den bivalente kromatin signatur (K4 /K27) eller manglende begge varemærker (ingen) i A- og B-gener (øverste panel) og klasse I og klasse II-gener (nederste panel) .

Betydeligt, fandt vi, at 34,69% (493/1421) af sekvenserne ofte blev hypermethyleret i hESCs (matrix signal 0,7 in≥25% (2/8) af prøverne ). De fleste af disse (79,72%, 393/493) blev også hyppigt hypermethyleret i CCLS (matrix signal 0,7 in≥25% (6/21)) af prøverne). Igen, mange af dem (32.32%, 127/393) var umethyleret i mindst én af NTTS analyseres (matrix signal 0,3 in≥17% (1/6) NTTS) (figur 1, og tabel 1 og S1). I modsætning til klasse A cancer hypermethyleret gener, blev de af denne gruppe også ofte hypermethyleret i hESCs, så vi foreslår, at de kan betragtes som medlemmer af en anden kategori af kræft methylerede gener, som vi har kaldt klasse B kræft hypermethyleret gener. Af de 697 sekvenser ofte hypermethyleret i kræft og umethylerede i mindst én af NTTS analyserede, 444 (66,70%) og 127 (18,22%) blev henholdsvis klassificeret som A- og B-gener (figur 1 og tabel 1 og S1) , hvilket indikerer, mod forventning, at en væsentlig del (ca. 20%) af kræft methylerede gener er også ofte hypermethyleret i hESCs.

Interessant, ikke alle generne ofte hypermethyleret i CCLS var helt methyleret i alle NTTS analyseret (figur 1, og tabel 1 og S1). Hyppigheden af ​​hypermethylering i normale væv er kun af moderat betydning for klasse A klassisk kræft methylerede gener, som de fleste af dem (78,83%, 350/444 sekvenser) er umethyleret i NPTs. På den anden side, kun 20 sekvenser svarende til klasse B-generne var umethyleret i alle NTTS analyseres (tabel 1). Når et gen er methyleret i nogle, men ikke alle normale væv, er methylering sandsynligvis involveret i specifikationen af ​​en vævstype under udvikling [12]. Når genet ikke er hypermethyleret i hESCs skal vævstype-afhængig selektiv methylering forekomme. I modsætning hertil, når genet er hyppigt hypermethyleret i hESCs, det sandsynligvis bliver selektivt demethyleres efter differentiering som en epigenetisk mekanisme, der er i stand til at lette væv specifikation. Omvendt, når et gen umethylerede i alle normale differentierede celler og hypermethyleret i stamceller, tabet af promoter methylering, der nødvendigvis opstår under differentiering er mere tilbøjelige til at blive involveret i tidlige differentieringsprocesser end i væv specifikation [12]. Således har vi defineret to nye underkategorier for både klasse A og B-cancer methylerede gener: Underkategori jeg, for gener, der altid er umethylerede i normale væv, og underkategorien II, for gener, der undertiden methylerede i normale væv (figur 1 og tabel 1 og S1). Procentdelen af ​​klasse A-II og klasse B-II-gener er meget lig (7,53% og 6,61%) (tabel 1). Men andelen af ​​gener i klasse A-I (24.63%) er meget højere end den i klasse B-I (1,41%). Generne i disse fire kategorier (A-I, A-II, B-I og B-II) repræsenterer 58,2% af alle de sekvenser til stede i methylering arrays. Ved at betragte status methylering af de tre grupper af prøver (hESCs, NPTs, og CCLS) var vi i stand til at klynge fleste af de resterende gener i array i otte yderligere kategorier (tabel 1), som omfattede for eksempel to kategorier af gener, som vi definerer som værende konstitutivt methylerede (methyleret i hESCs, CCLS og alle NTTS; 11,19%) eller konstitutivt umethyleret (methyleret i hESCs, CCLS og alle NTTS; 28,43%) gener, hhv. Vi foreslår derfor, at DNA-methylering er ikke vigtigt for regulering af generne i disse kategorier. Klassificeringen af ​​gener efter deres status for methylering i hESCs, CCLS, og NTTS, og fortolkningen af ​​den biologiske rolle af methylering af DNA i generne i hver gruppe er sammenfattet i tabel 1. Tabel S1 angiver de gener i hver gruppe.

det er vigtigt at bemærke her, at alle de tidligere beskrevne procenter henviser til 807-generne indeholdt i methylering arrays, hvorimod den samlede procentdel af gener i hver gruppe kan være anderledes, hvis hele genomet blev overvejet. Klassificeringen tærskel, som vi anvendte til at identificere gener ofte hypermethyleret i hESCs (mere end 70% af promotor CpG-methylering i mere end 25% af de analyserede prøver) er den, som er almindeligt anvendt til at definere et gen som værende hyppigt hypermethyleret i cancer [13] . For at vurdere, om vores observationer gælde for tærskler astringerende klassificering vi genbehandlet vores data i jagten på: i) sekvenser hypermethyleret i de fleste af de hESCs analyserede (array signal 0,7 in≥75% (6/8) af det hESCs) og ii ) sekvenser “fuldt methylerede” i nogle af hESCs analyseret (array signal 0,8) in≥25% (2/8) af hESCs) (tabel S2). Vi fandt, at 5 BI og 84 B-II-sekvenser monteret det første kriterium, og 13 BI og 86 B-II-sekvenser monteret den anden (tabel S2), hvilket indikerer, at vores konklusioner fortsat gyldige selv med disse tærskler strengere klassificering.

Det er for nylig blevet vist, at langvarig

in vitro

kultur af hESCs er forbundet med DNA methylering ustabilitet [14], [15]. For at vurdere, om promotor hypermethylering af vores klasse B-gener er forbundet med

in vitro

kultur proces, vi sammenlignet vores data med de tidligere publiceret af Bibikova

et al.

[11]. Disse forfattere anvendte Goldengate methylering platform at sammenligne status methylering af 1505 bindingssteder for CpG indeholdt i arrays i ti hESC linjer ved lave og høje passager. De fandt, at selv om methylering forskydninger med passage nummer, sådanne ændringer var små sammenlignet med forskellene mellem celletyper. De fandt fem gener (

ASCL2

,

GALR1

,

MEST

,

NPY,

SLC5A8

), der skal konsekvent hypermethyleret med passagen nummer (stige i methylering niveau 0,34 i mindst to cellelinjer (20%)). Tre af disse gener (

ASCL2

,

NPY,

SLC5A8

) er medlemmer af klasse B-I, men interessant nok ingen var en klasse B-II-gen. Disse resultater tyder på, at langvarig

in vitro

kultur var kun ansvarlig for promotor hypermethylering af en lille fraktion (3/97, 3%) af vores klasse B-gener, og at effekten viste sig at være større i klasse BI gener.

som tidligere nævnt, er det for nylig blevet foreslået, at udviklingsmæssige gener stumme i embryonale stamceller ved en Polycomb-afhængig bivalent histon-baseret chromatin mark [4], [5], som menes at prædisponere til afvigende DNA promotor hypermethylering af GTS i kræft [7] – [9]. Som vi fandt, at en delmængde af cancer methyleret gener også kan methyleres i hESCs vi ønskede at undersøge forholdet mellem promotoren hypermethylering og Polycomb-afhængige histon modifikation mønster i hESCs. Til dette formål har vi sammenlignet vores methylering data for klasse AI, A-II, BI og B-II-gener med den tidligere rapporterede histon modifikation profil og Polycomb belægning af de samme gener i embryonale stamceller [5], [12] , [16] (figur 1 og tabel S3). I overensstemmelse med en tidligere rapport [9], fandt vi, at omkring 35% af sekvenserne ofte hypermethyleret i kræft og umethylerede i mindst én af de NTTS analyserede indeholdt kromatin-undertrykkende mærker på deres initiativtagere (228-277 /697 nærede meK27, og 236/697 indeholdt SUZ12). Interessant nok sammenligne vores methylering data med de Mikkelsen

et al.

[16] observerede vi, at langt størstedelen (96,4%) af gener, der huser meK27 også indeholdt meK4 og at kun omkring 30% af generne ofte hypermethyleret i kræft præsenterede den bivalente kromatin domæne (meK4 /meK27) i hESCs (tabel S3).

Når vi sammenlignede kromatin mønstre og Polycomb belægning i klasse AI, A-II, BI og B-II-gener vi fandt hver gruppe at have en specifik kromatin signatur (p 0.00001). Klasse A-gener var mere beriget i Polycomb og bivalente mærker (47,5% og 45,5 til 57,3% af gener, henholdsvis) end klasse B-gener (19,7% og 21,4 til 32,7%, henholdsvis) (p 0,00001) (Figur 1B og Tabel S4 ). Den berigelse af bivalente mærke i klasse A-gener skyldes primært de lave niveauer af denne kromatin signatur i klasse B-II-gener (Tabel S4). Faktisk klasse B-I-gener udviser lignende niveauer af meK4 /meK27 til klasse A-gener (Tabel S4) (p 0.00001). Interessant, klasse II-gener, blev langt mindre hyppigt besat af Polycomb proteiner og udstillet færre bivalente mærker (33,3% og 26,5 til 38,8% af gener, henholdsvis) (p 0,00001) end gjorde klasse I gener (45,7% og 47,6 til 59,3 %, henholdsvis), (figur 1B og tabel S4). De lavere niveauer af bivalente mærket i klasse II-gener var primært på grund af de lave niveauer af denne kromatin signatur i klasse B-II-gener (Tabel S4). Faktisk Klasse A-II-gener havde lignende niveauer af meK4 /meK27 til de af klasse I gener (Tabel S4) (p 0,00001).

GTS undertrykt af promotor hypermethylering i hESCs

Til teste hypoteser formuleret på grundlag af oplysningerne fra de methylering arrays, vi fokuserede vores opmærksomhed på fire B-gener (ofte hypermethyleret i kræft og hESCs), der tidligere var almindeligt rapporteret til at være gener med tumor suppressor egenskaber, og at der ofte hypermethyleret i kræft. Vi valgte to (MGMT og SLC5A8) [17], [18] fra klasse BI underkategori (methyleret i alle NTTS) og to (PYCARD og RUNX3) [19], [20] fra klasse B-II (methyleret i en række af NTTS). Vi først anvendes bisulfit sekventering af multiple kloner nøjagtigt at bestemme status promotor DNA-methylering af disse gener i hESCs og normale væv (figur 2A, og figur S2, S3, S4, S5). I alle tilfælde, bisulfit sekventeringsdata bekræftede resultaterne opnået fra grupperingerne og viste, at den observerede i hESCs hypermethylering påvirkede de fleste af de CpG’er der omgiver det transkriptionelle start site af de udvalgte gener. MGMT og SLC5A8 (klasse BI) præsenterede tæt promotor hypermethylering i hESCs men ikke i normale differentierede væv (figur 2A, og figur S2, S3), mens klasse B-II-gener blev ofte hypermethyleret i hESCs og undertiden i normale væv (Tal S4, S5 ). For at forstå bedre rolle i promoter hypermethylering af vores udvalgte GTS’er i hESCs og NTTS, vi brugte q-RT-PCR for at måle deres udtryk i både prøve grupper (figur 2B, og figur S2, S3, S4, S5). Vi fandt, at promotor hypermethylering altid var forbundet med genrepression, men dens fravær i somatiske primære væv ikke nødvendigvis indebærer opregulering af genet. For eksempel, mens

SLC5A8

blev hypomethylated i alle de normale væv analyserede (Figur S3A, B), var det kun overudtrykt i hjerne, lever, og kolon (figur S3C).

(A ) bisulfit genomisk sekventering af multiple kloner af MGMT promotor i hESCs (I3, H14), normal primære væv (pool lymfocytter, normalt bryst) og to CCLS af lymfoid og bryst oprindelse (U937 og MDA-MB-231, henholdsvis). Sort, methyleret CpG; hvid, methyleret CpG; rød, CpG ikke er til stede. Den grønne bjælke over diagrammet af MGMT CpG øen angiver placeringen af ​​anvendt i methylering arrays sonde. (B) Forholdet mellem MGMT promotor hypermethylering og udtryk i embryonale, normal, og kræft prøver. Det øverste panel viser den relative methylering signalet opnået med methylering arrays og det nederste panel ekspressionsniveauerne af MGMT mRNA i forhold til GAPDH.

Tab af promotor hypermethylering og gen-aktivering under

in vitro

differentiering af hESCs

for at vise endvidere, at differentieringen af ​​hESCs er forbundet med mindre DNA methylering ved promotor-regionen af ​​visse gener, vi inducerede

in vitro

differentiering af hESC linje Shef -1 i to cellelinier (fibroblastlignende celler og neurale prækursorer) (figur 3A). Vi vurderede afstamning specifikationen ved hjælp tidligere offentliggjorte markører [21] (figur 3A, højre paneler) og derefter bruges methylering arrays til at identificere gener, der blev hypomethylated under differentiering. Vi fandt, at 12,98% (37/285) af generne hypermethyleret i Shef-1 (som ikke var methylerede i alle NTTS analyseres) bliver methyleret under

in vitro

differentiering. Af disse 12 gener bliver methyleret under neuron differentiering og 25 under spontan differentiering (tabel S5). Tre af disse gener var fælles for begge grupper (figur 3B) og to af dem tilhørte klasse B-II. Det er særlig bemærkning, at selv 9/25 af generne methylerede under spontan differentiering var af klasse B-II, ingen af ​​de 12 gener umethylerede under neuron differentiering tilhørte denne kategori.

(A) Venstre- hand billeder, Shef-1 stamcellelinie (øvre) og de samme celler efter neural differentiering (midten) og spontan differentiering til fibroblastlignende celler (lavere). De højre paneler viser de relative mRNA-niveauer af pluripotens (NANOG, Oct4), neuroektodermal (Pax6, NEUROD1), og mesodermal (COL1A1, fn1) markører før og efter Shef-1 differentiering. (B) Antal sekvenser hypomethylated under Shef-1 neurale (rød cirkel) og spontan (blå cirkel) differentiering, og deres overlapning med klasse B-I og klasse B-II-gener (sorte cirkler). (C) bisulfit genomisk sekventering af multiple kloner af DLC1 promotoren i Shef-1 stamcellelinie (øvre) og de samme celler efter neural differentiering (midten) og spontan differentiering til fibroblastlignende celler (lavere). Farvekoden er som for figur 2. (D) Forholdet mellem DLC1 promoter hypermethylering og udtryk under differentiering af Shef-1 celler. Det øverste panel viser den relative methylering signalet opnået med methylering arrays og det nederste panel ekspressionsniveauerne af DLC1 mRNA i forhold til GAPDH.

For at vise, at nogle GTS, der ofte hypermethyleret i kræft og hESCs kan mister methylering under differentiering, vi fokuserede vores opmærksomhed på DLC1. Vi valgte dette gen, fordi methylering arrays havde vist, at det mistede promotor methylering under spontan differentiering af Shef-1, og fordi det er kendt for at være en TSG der ofte hypermethyleret i cancer (fig S6) [22], [23]. Bisulfit sekventering af multiple kloner bekræftede de opnåede resultater med methylering arrays og viste, at DLC1 promotoren hypermethyleret i Shef-1 og bliver methyleret under spontan, men ikke neural, differentiering (figur 3C). I q-RT-PCR eksperimenter DLC1 var dårligt udtryk i Shef-1 cellelinje og blev overudtrykt under spontan, men ikke neural, differentiering (figur 3D).

GTS undertrykt af promotor hypermethylering i hæmatopoietiske stamceller stamfædre

Efter at have vist, at nogle cancer gener hypermethyleret og undertrykt i hESCs og at de kan miste methylering under

in vitro

differentiering af hESCs, vi undersøgt, om dette fænomen er begrænset til fosterudvikling eller omvendt , er en epigenetisk mekanisme forbundet med stemness status uanset den ontogenetiske fase af cellen. Vi anvendte methylering arrays at identificere gener hypermethyleret i CD34 + somatiske stamceller progenitorer (figur S7) sammenlignet med perifere blodlymfocytter og neutrofiler, to typer af voksne primære celler afledt fra CD34 + hæmatopoietiske stamceller. Vi identificerede 362 betydeligt hypermethyleret sekvenser i CD34 + celler (matrix signal 0,7) (tabel S6). Langt størstedelen af ​​disse sekvenser (92,27%, 334/362) blev også methyleret i hESCs og mest hyppigt blev hypermethyleret i CCLS (83,43%, 302/362) (figur 4A og tabel S6). Disse resultater antyder, hypermethyleringen af ​​cancer-gener kan forekomme i stamceller uanset den ontogenetiske trin (embryo vs. voksen). Vi næste identificeret ni sekvenser, blev væsentligt hypermethyleret i CD34 + celler i forhold til perifere lymfocytter og 16 sekvenser, der blev hypermethyleret i disse progenitor celler i forhold til neutrofiler (tabel S7). De fleste af de identificerede sekvenser blev også hyppigt hypermethyleret i hESCs (8/9 for lymfocytter og 14/16 for neutrofiler) og CCLS (6/9 for lymfocytter og 13/16 for neutrofiler). Desuden var der ingen sekvenser fælles for lymfocytter og neutrofile og de fleste af dem var til tider hypermethyleret i NPTs. Interessant, 28 af disse sekvenser blev tidligere klassificeret som klasse B-II-gener, mens ingen af ​​dem var fra klasse BI (figur 4A).

(A) Den venstre panel viser antallet af sekvenser, der er hypermethyleret i de somatiske stamceller CD34 +, og hypermethylerede i hESCs og CCLS. Bemærk, at de fleste af de sekvenser hypermethyleret i somatiske stamceller er også hypermethyleret i embryonale stamceller. Den højre panel viser antallet af sekvenser hypermethyleret i CD34 + celler (sort cirkel) klassificeret som klasse B-II-gener (rød cirkel). Sekvenser hypermethyleret i CD34 + celler blev aldrig klassificeret som klasse B-I gener (blå cirkel). (B) bisulfit genomisk sekventering af multiple kloner af AIM2 promotoren i Shef-1 og I3 stamcellelinjer (øverste), CD34 + hæmatopoietiske stamceller-stamceller (midten), og terminalt differentierede hæmatopoietiske celler (perifere lymfocytter og neutrofiler). Farvekoden er som for figur 2. (C) Forholdet mellem

AIM2

og

RUNX3

promotor hypermethylering og udtryk i CD34 + somatiske hæmatopoietisk stamcelle stamfædre og terminalt differentierede hæmatopoietiske celler (perifere lymfocytter og neutrofile ). Det øverste panel viser den relative methylering signalet opnået med methylering arrays og det nederste panel ekspressionsniveauerne af

AIM2

og

RUNX3

mRNA i forhold til GAPDH.

Endelig, for at vise, at nogle kræftpatienter methylerede gener også ofte methylerede i somatiske stamfader stamceller, og at deres methylering er vigtig for afstamning specifikation, vi overvejet to gener:

RUNX3

AIM2

. Vi valgte

RUNX3

fordi, i overensstemmelse med tidligere publicerede data [24], viste vores methylering arrays, at i forhold til CD34 + celler,

RUNX3

blev hypomethylated i perifere lymfocytter, men ikke i de perifere neutrofiler.

AIM2

blev valgt, fordi det tidligere var anset for at være en TSG, der ofte hypermethyleret i kræft (figur S8) [25], og fordi, i modsætning til

RUNX3

, bliver det umethyleret specifikt i myeloide afstamning (figur 4B, C). De bisulfit sekventering data bekræftede resultaterne opnået med de arrays, der viser, at de CD34 + celler og perifere lymfocytter tæt blev methyleret ved promotoren for

AIM2

gen, mens de perifere neutrofiler var næsten ikke-methylerede (figur 4B). For at fastlægge den rolle, promotor hypermethylering af

AIM2

og

RUNX3

i hæmatopoietisk differentiering, vi brugte q-RT-PCR til at analysere deres udtryk i vore grupper af prøver (figur 4C). Vi fandt, at promotor hypermethylering var altid forbundet med gen-undertrykkelse i begge gener, og at tabet af promoter methylering i

AIM2

og

RUNX3

i perifere lymfocytter og neutrofile henholdsvis var forbundet med deres reexpression ( figur 4C).

diskussion

Afvigende promotor hypermethylering af GTS og differentieringsfaktorer er et centralt epigenetiske ændringer i kræft [26], [27]. Generne, der gennemgår sådanne ændringer i kræft er blevet rapporteret til at blive undertrykt i hESCs ved oprettelse af “bivalente kromatin domæner”, der består af aktivering (H3 lysin 27 methylering) og undertrykke (H3 lysin 4 methylering) histon mærker, der holder dem klar til aktivering, men , samtidig, prædisponerer dem til afvigende promotor hypermethylering hos voksne cancere [7] – [9]. Heri vi vise, at et andet niveau af kompleksitet eksisterer hvorved nogle af de gener, ofte afvigende hypermethyleret i kræft er også ofte hypermethyleret i hESCs. Vores resultater tyder på, at, som tidligere foreslået til museceller [28], kan promoter DNA methylering være en vigtig faktor i genregulering i hESCs.

På baggrund af status methylering i hESCs vi etableret to kategorier af cancer methylerede gener: klasse A gener, som ofte umethyleret i hESCs og klasse B gener, som ofte hypermethyleret i hESCs. Da vi uventet konstateret, at en væsentlig del af de gener, der indgår i begge grupper blev også hyppigt hypermethyleret i normale differentierede væv, vi etableret to nye underkategorier af cancer methylerede gener: underkategori I, for gener, som er for det meste ikke-methyleret i normale væv, og underkategori II for gener, der undertiden hypermethyleret i normale væv. Den biologiske fortolkning af afvigende methylering i klasse A og B cancer methylerede gener og deres to underkategorier er helt anderledes. Klasse A-I gener er ofte hypermethyleret i cancer, men ikke i normale væv eller hESCs. Disse gener er ikke meningen at blive reguleret af DNA-methylering under normal udvikling og dermed hypermethyleringen i cancer bør altid fortolkes som en afvigende proces. Klasse A-II-gener ofte methyleres i CCLS og undertiden i normale væv, men sjældent i hESCs. Methylering af disse gener kan være vigtigt for afstamning specifikation og bør overvejes afvigende i kræft, når det forekommer i en tumortype, i hvis tilsvarende normalt væv er det ikke hypermethyleret. Klasse BI gener (ekskl

ASCL2

,

NPY,

SLC5A8

gener, hvis promotor DNA hypermethylering i hESC linjer kan skyldes den

in vitro

kultur proces [11]) ofte hypermethyleret i hESCs og cancerceller linjer men aldrig i normalt væv, hvilket antyder, at tabet af methylering ved promotorerne for disse gener kan være en vigtig indflydelse på tabet af pluripotens under udviklingen. Deres hypermethylering i kræft bør altid betragtes som afvigende. Klasse B-II-gener ofte hypermethyleret i hESCs og kræftceller, men, som de også nogle gange methylerede i normale væv, kan deres hypermethylering i kræft kun anses afvigende i tumortyper i hvis normale modstykker de er helt umethyleret. Bortset fra dette, at ikke alle generne ofte hypermethyleret i cancer var helt methyleret i alle de normale analyserede væv er et yderst vigtigt resultat i cancerpatienter epigenetik [26], fordi promotoren hypermethylering af et gen i en bestemt tumortype bør ikke være