PLoS ONE: Silencing af ribosomprotein S9 fremkalder et væld af cellulære reaktioner hæmme væksten af ​​kræftceller Efterfølgende til p53 Activation

Abstrakt

Baggrund

Forstyrrelse af nucleolus ofte fører til aktivering af p53 tumor suppressor pathway gennem hæmning af MDM2, der er medieret af et begrænset sæt af ribosomale proteiner, herunder RPL11 og RPL5. Virkningerne af ribosomalt protein tab i dyrkede pattedyrceller ikke blevet grundigt undersøgt. Her karakteriserer vi det cellulære stress respons forårsaget af udtømning af ribosomale protein S9 (RPS9).

Metodologi /vigtigste resultater

Udtømning af RPS9 nedsat produktion af 18S ribosomale RNA og induceret p53 aktivitet. Det fremmet p53-afhængig morfologisk differentiering af U343MGa Cl2: 6 gliomceller som påvist ved intensiveret ekspression af glial fibrillært surt protein og dybtgående ændringer i celleform. U2OS osteosarcomaceller vises en begrænset ældning respons med øget ekspression af DNA skade responset markører, mens HeLa cervikale carcinomceller undergik celledød ved apoptose. Knockdown af RPL11 forringet p53-afhængige fænotyper i de forskellige RPS9 forarmet cellekulturer. Vigtigere, knockdown af RPS9 eller RPL11 også markant hæmmet celledeling gennem p53-uafhængige mekanismer. RPL11 binding til MDM2 blev bevaret trods nedsatte niveauer af RPL11 protein følgende nucleolar stress. I disse indstillinger, RPL11 var kritisk for opretholdelse p53-protein stabilitet, men var ikke strengt nødvendigt til p53-proteinsyntese.

Konklusioner

p53 spiller en vigtig rolle i den indledende begrænsning af celleproliferation, der forekommer i reaktion på lavere niveau af RPS9. Vores resultater udelukker ikke muligheden for, at andre nucleolar stress sensing molekyler handle opstrøms eller parallelt med RPL11 at aktivere p53. Inhibering af ekspressionen af ​​visse ribosomale proteiner, såsom RPS9, kunne være en effektiv måde at reinitiere differentiationsprocesser eller at inducere senescens eller apoptose i hurtigt prolifererende tumorceller

Henvisning:. Lindström MS, Nister M (2010) Silencing af ribosomprotein S9 fremkalder et væld af cellulære reaktioner hæmme væksten af ​​kræftceller Efterfølgende til p53 Aktivering. PLoS ONE 5 (3): e9578. doi: 10,1371 /journal.pone.0009578

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Januar 28, 2010; Accepteret: 11 Februar 2010; Udgivet: 8. marts, 2010

Copyright: © 2010 Lindström, Nister. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev muliggjort med økonomisk støtte til ML fra Åke Wiberg fundament, Karolinska Institutet midler og Magnus Bergvall fundament. ML er en modtager af et stipendium pris fra den svenske Cancer Society (Cancerfonden). Arbejdet blev udført i laboratoriet af MN, støttet af den svenske Cancer Society, Kræftens Bekæmpelse i Stockholm, Research Council svenske, den svenske Childhood Cancer Foundation og Karolinska Universitetshospital FoUU. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ribosom biogenese er en meget kompleks proces, hvor hundredvis af forskellige proteiner samarbejder i ribosomale RNA (rRNA) syntese, forarbejdning, ribosom subunit samling og transport [1]. Nucleoli er de faktiske steder for ribosom biogenese men disse strukturer har også været impliceret i andre cellulære processer såsom kontrol af cellecyklussen, viral replikation, mitogene signalering, nuklear eksport af p53, og stamcelledifferentiering, revideret i reference [1] – [4]. I det seneste årti har forbindelsen mellem tumor suppressor protein p53, nucleolus, og ribosom biogenese bliver veletableret. Ekspression af dominante negative mutanter af nucleolar protein Bop1 resulterede i defekter i rRNA forarbejdning udløser p53 induceret cellecyklusstandsning [5]. p53 ofte bliver aktiveret efter tavshed af nucleolar eller ribosomale proteiner (r-proteiner), og eksempler omfatter RPL23 [6], RPS6 [7], nucleostemin, [8] og TIF1A [9]. Desuden inhibitorer af rRNA syntese eller forarbejdning såsom actinomycin D og 5-fluorouracil aktivere også p53 [10]. Kollektivt disse betingelser benævnes nucleolar eller ribosomale stress. Montering beviser fra en række musemodeller beviser eksistensen af ​​denne p53-afhængige checkpoint

in vivo

. En musemodel afslørede, at ribosom biogenese er forringet, efter betinget sletning af en allel af

Rps6

[11]. Interessant, den embryonale dødelighed, der fandt sted i løbet af gastrulation i disse

Rps6

+/-

embryoer var forårsaget af en p53-afhængig checkpoint snarere end et generelt fald i translationel kapacitet [11]. Rpl22 mangel selektivt standset udvikling af alfa /beta-afstamningsceller T-celler, en reaktion medieret af aktivering af p53 [12]. Til gengæld p53 tab restaureret udviklingen af ​​Rpl22-deficient thymocytter.

mutationer er blevet fundet i forskellige R-proteiner hos patienter, der lider af et syndrom kendt som Diamond-Blackfan anæmi (DBA, MIM # 105.650), kendetegnet ved defekt erythropoiese, medfødte misdannelser og en øget risiko for cancer [13], [14]. Genet

RPS19

ofte muteret i DBA [15], men mutationer er også blevet fundet i

RPS24

,

RPS17

,

RPL35A

,

RPL5

,

RPL11

, og

RPS7

[16], [17]. Dyremodeller af DBA er skabt i mus og zebrafisk [18], [19]. Det blev konstateret, at tab af

Rps19

er embryonale dødbringende [20].

Rps19

mangel svækker ribosomale biogenese og aktiverer p53 i zebrafisk, og undertrykkelsen af ​​p53 og deltaNp63 kan mindske Rps19-mangelfuld fænotype i denne model [18]. Tab af andre R-proteiner i zebrafisk, såsom Rps8, Rps11, og Rps18 udløste også en p53 respons [18]. Rolle p53 i DBA forbliver uklar, men det er bemærkelsesværdigt, at mus, der bærer mutationer i

RpS19

Rps20

har lave erythrocyt tællinger, der kan genoprettes ved p53-mangel [21].

Hvordan p53 aktiveres efter nucleolar stress? Flere grupper har vist, at R-proteiner (RPL11, RPL5, RPL23 og RPS7) er frigivet fra nucleolus under stress og derefter binde MDM2 derved aktivere p53 [6], [22] – [29]. Det blev efterfølgende konstateret, at øget oversættelse af 5′-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNA, herunder at

RPL11

, forekommer som respons på forstyrret 40S ribosomale subunit biogenese hvilket fører til en stigning i RPL11 produktion [30]. Faktisk følgende tab af RPS6 eller RPL24 p53 tumor suppressor aktiveres på en måde, afhængig af RPL11 [30], [31]. Mens nedsat ekspression af nogle R-proteiner kan aktivere p53 som en del af et cellulært stress respons, er det også klart, at nogle andre R-proteiner har direkte og mere specifikke roller i

p53

mRNA-translation. Haploinsufficiency af en delmængde af R-proteiner i zebrafisk er forbundet med udviklingen af ​​maligne perifere nerve sheath tumorer [32]. Interessant, disse nerve kappe tumorer ikke producere p53-protein, trods tilstedeværelsen af ​​

p53

mRNA [33]. Desuden RPL26 spiller en rolle i at forbedre

p53

mRNA translation under DNA skade responset ved direkte interaktioner med både MDM2 protein og

p53

mRNA [34]. Derfor R-proteiner har mere dynamiske roller i reguleringen af ​​p53 tumor suppressor pathway, end man tidligere troede, anmeldt i [35] – [37].

For nylig RPS9 blev identificeret som en ny B23 (NPM /nucleophosmin ) interagerende protein [38]. Nedsatte niveauer af RPS9 var forbundet med ophobning af celler i G

1 /(G

0) og p21 induktion i U2OS osteosarkomceller [38]. Her satte vi os for yderligere at undersøge de forskellige cellulære stressreaktioner forårsaget af tab af RPS9. Udtømning af RPS9 fremkaldte en hurtig tab af nucleolar protein pool, forringet produktion af modne 18S ribosomale RNA og aktivering af p53 tumor suppressor pathway. Vi fandt, at kombinationen af ​​en defekt ribosom biogenese vej og p53-aktivering resulterede i uventet stærke anti-proliferative responser i humane tumorcellelinier i at de undergik ældning, differentiering, eller apoptose efter udtømning af RPS9.

Resultater

Hurtig Nedbrydning af nucleolar RPS9 Efter siRNA transfektion

for at sammensmelte R-proteiner med GFP har vist sig et nyttigt redskab til bedre at visualisere lokalisering og omsætning af R-proteiner i humane celler [39], [ ,,,0],40]. U2OS celler, der udtrykker RPS9-GFP tidligere var fastsat [38]. I disse celler den RPS9-GFP-fusionsproteinet blev lokaliseret til nucleolus og cytoplasmaet. For bedre at forstå dynamikken i RPS9 i forhold til knockdown fænotyper, vi brugte RPS9-GFP U2OS celler kombineret med RNA-interferens at visualisere knockdown af RPS9 i levende celler (figur 1A). Transfektion af U2OS celler med RPS9 siRNA angivet en hurtig omsætning af nucleolar RPS9-GFP. Allerede 24 timer efter transfektion et flertal af cellerne viste en slående tab af nucleolar RPS9-GFP (figur 1B). 72 timer efter transfektion fleste celler havde en GFP signal påviseligt kun i cytoplasmaet. Brug af immunoblotting RPS9-GFP blev påvist som et enkelt bånd med den forventede størrelse, som blev reduceret ved siRNA transfektion med to forskellige RPS9 siRNA’er # 1 og # 2, hvorimod knockdown med oligo # 0 var ineffektive, når sammenlignet med kontrollen siRNA, siCtrl (figur 1C). Puljen af ​​cytoplasmatisk RPS9-GFP protein forblev i flere dage efter aftale med den kendte stabilitet pattedyr cytoplasmatiske ribosomer. Vi har været i stand til helt at depletere celler af cytoplasmatiske GFP reaktivitet, som kunne være på grund af det faktum, at silencing med siRNA ikke er 100%, eller at et samlet tab af RPS9 er ikke kompatibel med vedvarende celleproliferation. For yderligere at bekræfte den cellulære fordeling af RPS9 blev U2OS celler farvet med et antistof mod human RPS9, som beskrevet [38], og en identisk nucleolar og cytoplasmatisk farvning blev observeret. Kernelegeme pulje af endogent RPS9 kunne hurtigt og effektivt stumme i U2OS ligner den i RPS9-GFP (fig S1A) celler, og dette blev bekræftet ved immunoblotting (figur S1B). Sammenfattende vi opnåede et komplet og specifik udtømning af nucleolar RPS9 hjælp siRNA.

(A) Effektivitet af RPS9-GFP knockdown i U2OS celler, der stabilt udtrykker RPS9-GFP ved brug af tre forskellige siRNAs målrettet menneskelig RPS9. Billeder af celler, der udtrykker RPS9-GFP blev udtaget efter 48 timer. (B) Procentdel af U2OS celler, der udtrykker detekterbare RPS9-GFP i nucleolus på forskellige tidspunkter efter transfektion af RPS9-1 siRNA eller siCtrl. (C) Samme antal celler fra eksperiment i (A) blev opsamlet og helcelleekstrakter fremstillet i buffer indeholdende 2% SDS. Proteinlysater blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer specifikke for EGFP, PCNA, β-actin, og RPL11 som angivet i figuren.

Induktion af en begrænset Ældning respons i U2OS Cells

Forstyrrelse af nucleolus ofte ses efter eksponering af celler for en række forskellige kemiske og fysiske midler, som inhiberer transkription eller rRNA forarbejdning [10]. En tæt inspektion af nucleoli afslørede, at de forblev intakt som respons på behandling med siRPS9 efter aftale med undersøgelser af RPS6 [11], [30]. Men, vi bemærkede, at nucleoli i RPS9 udtømte U2OS celler blev mere kontrast, rund, og fase-tæt end i siCtrl behandlede celler indikerer en omlægning af nucleolar struktur (figur S2A). Nucleolar tætte fibrillære centre var i nogle få celler re-lokaliseret til periferien af ​​nucleolus som afsløret ved farvning for fibrillarin, en markør for den tætte fibrillær rum i nucleolus. Disse nucleoli lignede det udvidede nucleoli observeret i U2OS celler udtømt for nucleostemin [8], en nucleolar protein involveret i ribosom biogenese [41].

Knockdown af RPS9 inducerede akkumulering af celler i G

1 og øgede niveauer af p21 i U2OS celler [38]. En mere grundig undersøgelse af cellerne afslørede, at en brøkdel viste en temmelig “alvorlig” fænotype ligner ældning med en groft ekspanderende cytoplasma fører os til yderligere at undersøge denne særlige reaktion (figur 2A). Udtømning af RPS9 inducerede en stigning i antallet af γ-H2A.X positive celler og celler med nuklear foci af phospho-ATM /ATR substratproteiner (figur 2B og C). Analyse afslørede en stigning på senescens associeret β-galactosidase-positive (SA-β-gal) U2OS celler fra 0,4% positive celler i siCtrl celler, til 7% i siRPS9 transficerede celler (figur 2D).

(A ) fase kontrast afslører morfologi af humane U2OS osteosarcomceller transficeret med siRNA rettet mod RPS9 eller p53. (B-C) Øget ekspression af DNA-skader og replikations stress markører i U2OS celler udtømt for RPS9 og analyseret 72 timer efter siRNA transfektion. U2OS celler blev fikseret og farvet med et antistof i retning γ-H2AX og en phospho-ATM /ATR substrat antistof. (D) Kvantificering af SA-β-gal positive U2OS celler i kulturer udtømt for RPS9. Vist er en repræsentativt forsøg ud af to. (E) Celler blev transficeret med siCtrl, RPS9, RPL11, p53 eller p21 siRNA som angivet. Cellerne blev inkuberet med BrdU ved 24 timer efter transfektion i yderligere 24 timer, og cellerne blev derefter fikseret og farvet med anti-BrdU-antistoffer og gennemsnittet af de BrdU-positive celler er vist (%). (F) Co-udtømning af RPL11, p53 eller p21 delvist svækket RPS9 knockdown-medieret inhibering af celleproliferation. U2OS celler blev transficeret med siCtrl, siRPS9, sip53, sip21 eller siRPL11 i kombinationer som angivet. Endelig koncentration af siRNA var 100 nM i hvert tilfælde og erstatning blev lavet med siCtrl. Celler blev talt 72 timer efter transfektion og vist er gennemsnit og SEM fra tre forskellige eksperimenter udført i triplikat ved uafhængige lejligheder og normaliseret til siCtrl sat til 100%. (G) Co-knockdown af RPL11 svækket induktion af p21 og MDM2 proteiner forårsaget af knockdown af RPS9. U2OS celler blev transficeret med kombinationer af siRNA som angivet. Cellelysater blev underkastet immunoblotting og ekspressionen af ​​p53, MDM2, p21, RPL11, RPL5 og RPS9 blev bestemt som angivet. Proteinet lysatet fra hver prøve blev delt i tre forskellige blots og hver probes med actin som en loading kontrol. (H) U2OS celler blev transficeret med siRPS9-1 eller siRPL11-2 i 48 timer eller behandlet med 5 nM actinomycin D i 18 timer, hvorefter cellerne blev høstet direkte i 2% SDS indeholdende lyseringsbuffer. Cellelysater blev underkastet immunoblotting under anvendelse af antistoffer mod RPL11 eller RPS9 (w.c.e = helcelleekstrakt). (I) Co-immunoudfældning af MDM2 og RPL11 i U2OS celler transficeret med siRNA målrettet RPS9. MDM2 blev immunpræcipiteret med N20 antistof efterfulgt af påvisning med SMP14 monoklonale eller et monoklonalt fremad RPL11. Bemærk, at forskellige eksponeringstider blev anvendt til RPL11 IP og input blots. (J) U2OS celler blev transficeret med siRPS9-1 alene eller i kombination med siRPL5-2 i 72 timer, hvorefter cellerne blev høstet, og niveauet af p21 som en udlæsning for p53-aktivitet blev analyseret ved immunblotting.

for at formelt demonstrere rolle p53 i mediering hæmning af U2OS celledeling vi co-udtømte p53 og RPS9 resulterer i en tilbagevenden af ​​ældning fænotype (figur 2A og D). Desuden RPL11, p53 eller p21 co-depletion i siRPS9-behandlede celler forøget BrdU-inkorporering i disse kulturer ved 24 timer efter transfektion (fig 2E), kombineret med en redning af senescens-lignende morfologi (fig S3). Vi ønskede at vide, hvordan denne “flygte” fra G

1 anholdelse relateret til cellevækst på længere sigt, så vi undersøgte også celledeling på et senere tidspunkt. Vi fandt, at siRPS9 behandlede kulturer var vokset 36% (± 9,2) henviser siRPS9 + sip53 behandlede celler var vokset 52% (± 6,5) sammenlignet med siCtrl som vurderet 72 timer efter transfektion (fig 2F). Silencing af RPL11 restaureret celletal til niveauet i celler co-transficeret med siRPS9 og sip53, men det kunne ikke gendanne celle nummer, der ses i siCtrl kulturer, dermed siRPS9 + siRPL11 behandlede celler var vokset 56% (± 4,4) i forhold til siCtrl (figur 2F). Dette viste, at nedregulering af RPS9 eller RPL11 også induceret suppression af celledeling i en p53-uafhængig måde. Dette blev bekræftet ved nedbrydende RPS9 i matchede WI38 og WI38-E6 fibroblaster samt i SaOS2 osteosarcomceller mangler p53 (figur S1D).

Regulering af p53 respons udløst af RPS9 Tab i U2OS Cells

nedsat ekspression af RPS9 i U2OS celler ikke mærkbart ændre niveauerne af p53 som vist før [38], men inducerede en stigning i p21-protein, der var afhængig af p53 (figur 2G). Induktion af p21 blev markant svækket af co-transfektion af celler med RPL11 siRNA (figur 2G). Knockdown af RPL11 hjælp siRPL11-1 resulterede i lavere niveauer af p53, MDM2, særlig p21, også under normale forhold i U2OS celler (figur 2G, bane 6). Interessant, udtømning af RPS9 førte til lavere niveauer af NP40-opløselige RPL11 (figur 2G, bane 2), men den del af RPL11 bundet til MDM2 forblev den samme og ikke falde (figur 2I). Vi ønskede at vide, om reduktionen i RPL11 også kunne ses i hele celleekstrakter og U2OS derfor celler blev transficeret med siRPS9 eller inkuberes i 5 nM actinomycin D i 18 timer. Denne koncentration af actinomycin D selektivt blokerer RNA Pol I-aktivitet og forhindrer ribosom biogenese. Vi kunne bekræfte de opnåede resultater ved brug af mildere lysisbuffer også i helcelleekstrakter dermed viser nedsat totale niveauer af RPL11 (Figur 2H). De fleste af de undersøgelser på området har påberåbt lyddæmpende RPL11 ved hjælp af en bestemt siRNA så vi fandt det vigtigt at sammenligne RPL11 med RPL5. Vi fandt, at udtømning af RPL5 kunne blokere p21 induktion identisk med RPL11 i RPS9 udtømte celler (Figur 2J). Silencing af RPL11 med morpholinoer inducerer en p53-afhængig apoptotisk respons i zebrafisk [42], og vi derfor ikke ønsker at udelukke, at RPL11 og RPL5 tab kan til en vis grad fremkalde p53 aktivitet eller engagere p53 relaterede veje

in vivo

. Vi lavede også en anden observation fra eksperimentet i figur 2G. For det første har knockdown af RPL11 forårsagede et fald i RPL5 proteinniveauet i samme omfang som for RPL11 (figur 2G, bane 6). Dette er formentlig fordi 28S rRNA ikke er effektivt bearbejdet i RPL11 eller RPL5 deficiente celler [43] fører til et overskud på stor underenhed R-proteiner, der hurtigt nedbrydes [44]. Det er for nylig blevet vist af andre grupper, udtømning af en individuel r-protein fra en ribosom subunit resulterer i nedregulering af andre proteiner fra den samme underenhed [45]. Dette fund kan have nogle konsekvenser, hvorfor reguleringen af ​​MDM2 af flere ribosomale proteiner synes at forekomme i en ikke-redundant måde, men det kan ikke være den eneste forklaring, fordi så ville vi finde, at knockdown af næsten hver r-protein kan blokere p53 stabilisering, som vi ikke ser. Sammenfattende konkluderer vi, at RPL11 er nødvendig for effektiv induktion af p53-afhængige reaktioner i RPS9 udtømte U2OS celler.

Er RPL11 Kræves til p53 mRNA Oversættelse Efter nucleolar Stress?

Hvordan RPL11 kontrol p53? Binding af RPL11 og RPL5 direkte til MDM2 protein fører til stabilisering af p53 via hæmning af MDM2 E3 ubiqutin ligaseaktivitet [46]. Men andre rapporter viser også kritiske roller for R-proteiner i

p53

mRNA oversættelse [33], [47]. Desuden er betydningen af ​​samspillet mellem MDM2 og RPL11 /RPL5 i form af mulige virkninger på

p53

mRNA oversættelse er forblevet noget uklart. Dette kunne være relevant at undersøge, da MDM2 kan øge

p53

mRNA oversættelse som er blevet beskrevet at forekomme i nogle indstillinger [48], [49]. Faktisk blev det foreslået, at interaktioner mellem RPL11 /RPL5 og MDM2 kan tjene et dobbelt formål at hæmme MDM2 E3-ligaseaktivitet og fremme

p53

mRNA translation samtidig [48], [49]. På den anden side, MDM2 binder til RPL26 og inhiberer RPL26 medieret stimulering af p53 mRNA-translation [15]. Derfor besluttede vi at genoptage p53 halveringstid og nedbrydning og undersøge

p53

mRNA translation efter nucleolar stress i U2OS celler med og uden RPL11. Vi først gennemført en p53-protein halveringstid assay for at bekræfte den forøgede stabilitet af p53 efter en lav dosis actinomycin D eksponering at inducere nucleolar stress. Faktisk blev en robust stigning i mængden og stabilitet af p53-proteinet ses, og i det væsentlige meget lidt, om nogen, nedbrydning af p53 forekom i actinomycin D behandlede celler under fire timers chase (figur 3A). I modsætning hertil hovedparten af ​​p53-proteinet i DMSO behandlede kontrolceller blev nedbrudt efter mindre end en time i cycloheximid (figur 3A). Vi derefter transficeret U2OS celler med kontrol eller siRPL11 i 24 timer og næste behandlet alle transfektanter med 5 nM actinomycin D natten efterfulgt af en CHX chase. Loading blev justeret til at give en sammenlignelig grundbeløb på p53 for at lette en direkte sammenligning. p53 var klart mere ustabil i RPL11 udtømte U2OS celler (figur 3B). Resterende stabil p53 i siRPL11 prøver på senere tidspunkter sandsynligvis stammer fra en population af celler, der har responderet på actinomycin D men som ikke er blevet transficeret med siRPL11. Vi næste begrundet, at små molekyler, der forstyrrer p53-MDM2 binding, blokere MDM2 transskription eller forhindre p53 nedbrydning af proteasomet hvorved p53 ophobning af “default” ville handle uafhængigt af ribosomale protein-MDM2 interaktion. Vi har derfor behandlet U2OS celler med Nutlin-3. Den Nutlin-3 forbindelsen forstyrrer p53-MDM2 interaktion, men ikke forhindrer binding af MDM2 til p53 mRNA [48], [49]. Transficerede vi celler med to forskellige RPL5 siRNA oligoer natten over efterfulgt af behandling af celler med 5 nM actinomycin D eller 10 uM Nutlin-3 i yderligere 18 timer (figur 3C). Hver af de to RPL5 siRNA’er effektivt kunne inhibere p53 akkumulering efter 5 nM actinomycin D, og ​​især induktion af p21 blev reduceret (figur 3C, bane 3 og 4). I modsætning hertil virkning på p53 og p21 proteinniveauer når vi forarmet RPL5 i nærvær af Nutlin-3 var marginal når normaliseret til actin. RPL5 var derfor ikke forpligtet til stabilisering af p53, samt induktion af MDM2 og p21 proteiner, i Nutlin-3 behandlede celler. Vi næste ønskede at se, om andre lille underenhed r-proteiner, herunder RPS9 er nødvendige for p53 stabilisering efter actinomycin D behandling. Vi udtømte celler RPS6, RPS9, RPS17 og RPS24 men lyddæmpning af disse proteiner ikke blokere p53 protein stabilisering forårsaget af actinomycin D (figur 3D). Dette viser, at RPL11 men ikke RPS9 spiller en kritisk rolle i p53 respons efter actinomycin D behandling.

(A) U2OS celler blev behandlet med 5 nM actinomycin D i 18 timer eller DMSO alene efterfulgt af en cycloheximid chase ( CHX) at estimere p53 protein nedbrydningshastigheder. Cellelysater fra hvert tidspunkt blev underkastet immunoblotting og ekspressionen af ​​p53 bestemmes i forhold til actin niveauer. (B) U2OS celler blev transficeret med siCtrl eller siRPL11 natten over efterfulgt af behandling med actinomycin D i yderligere 18 timer. Dette blev efterfulgt af CHX chase som ovenfor for angivne tid. I dette tilfælde belastning blev justeret til at give sammenlignelige grundbeløb for p53 lette analyse af nedbrydning, som er hurtigere i RPL11 transficerede celler. (C) U2OS celler blev transficeret med siRNA’er målretning RPL5 eller med siCtrl. Celler blev derefter behandlet med Nutlin-3 (10 pM) eller actinomycin D (5 nM) i 18 timer. Blottingmembranen blev probet for RPL5, MDM2, p53 og p21. (D) Udtømning af ribosomale proteiner RPS6, RPS9, RPS17 og RPS24 forhindrer ikke p53 ophobning og p21 induktion efter actinomycin D behandling, men udtynding af RPL11 gjorde. U2OS celler blev transficeret med angivne siRNA i 18 timer efterfulgt af behandling med actinomycin D (5 nM) i yderligere 18 timer og ekspressionsniveauer af p53 og p21 blev målt ved immunblotting. (E) p53-syntese i actinomycin D-behandlede celler med eller uden siRPL11. Total p53 og RPL11 er vist ved immunoblotting og nyligt syntetiserede p53 blev immunpræcipiteret med DO1 antistof og visualiseret ved autoradiografi. Eksperimentet blev udført 36 timer efter siRNA transfektion. (F) Vurdering af p53 mRNA translation i U2OS celler udtømt for RPL11, RPS9, RPS9 + RPL11, eller i celler behandlet med actinomycin D (5 nM) i nærvær eller fravær af RPL11 siRNA. Vist er mængden af ​​nyligt syntetiserede p53 løbet af 15 minutter i forhold til den totale mængde af p53, og sammenlignet med den samlede proteinniveau som detekteret med Ponceau S. Eksperimentet blev udført 36 timer efter siRNA transfektion.

Endelig ønskede vi at undersøge syntesen af ​​nye p53-protein under betingelser med actinomycin D eksponering eller efter silencing af RPS9, i nærvær eller fravær af siRPL11. Vi mærkede U2OS celler i 15 minutter og anvendt p53 immunopræcipitation at overvåge total og nyligt syntetiserede p53 men fandt ingen tegn på, at RPL11 er påkrævet for p53-proteinsyntese i denne eksperimentelle indstilling (fig 3E og F). En marginal stigning i nye p53 protein kunne ses i actinomycin D behandlede celler (figur 3E), men fortolkningen af ​​denne er vanskeligt, fordi actinomycin D kan også stabilisere den pulje af nyligt syntetiserede p53, og de samlede niveauer for oversættelse var lidt højere i denne prøve. Resultaterne taget alle sammen støtter den tanke, at RPL11 overvejende styrer p53 på en post-translationel niveau, og at RPL11 ikke er strengt nødvendig for p53 syntese i dette særlige eksperimentelle indstilling, men en ekstra mindre effekt på p53 produktion er ikke udelukket.

RPS9 Lyddæmpningsplader forringer Produktion af 18S rRNA og inducerer p53 i gliomceller

Indtil videre har de fleste undersøgelser af ribosomale protein-p53 signalering blevet gennemført i U2OS celler og det er fortsat uklart, om eller i hvilket omfang, denne reguleringsmekanisme opererer i andre celletyper. Vi fandt, at endogen RPS9 effektivt kunne stumme i U343MG og i U87MG gliomceller hvorimod ingen ændring i RPS9 ekspression blev set i U1242MG celler efter siRPS9 transfektion (figur 4A). Notatet er det allerede lave RPS9 i ubehandlede U1242MG celler. En tydelig reduktion i antallet af celler i kulturer behandlet med siRPS9 forhold til siCtrl behandlede kulturer blev set for U87MG, U343MG og U343MGa Cl2: 6 celler, men ikke for U1242MG (figur 4B). Som en yderligere specificitet kontrol, vi kontrolleret, at RPS9 siRNA oligonukleotid havde ingen effekt på mus NIH3T3 celledeling hvorimod en mus rps9 siRNA oligo effektivt hæmmede udbredelsen af ​​disse celler (Figur S1c). For at vurdere virkningen af ​​RPS9 knockdown på syntesen af ​​modne 28S og 18S rRNA vi mærkede knockdown og styre U343MGa Cl2: 6 celler med [

3H] -uridin i 2 timer og undersøgt det mærkede og isoleret rRNA efter gelelektroforese og blotting til en nylonmembran. Vi fandt, at meget lidt modne 18S rRNA i RPS9 Knockdown kulturer blev produceret i perioden mærkning (figur 4C), men den samlede cellulære RNA-syntese fortsat (figur 4D). Actinomycin D (5 nM) effektivt blokeret syntese og mærkning af rRNA (figur 4C og D). I et forsøg under anvendelse af [

3H] -L-methyl methionin til etiketten nyligt syntetiserede rRNA fandt vi, at produktionen af ​​18S rRNA klart var hæmmet (Figur 4E). Der var et marginalt fald i den nye syntese af 28S rRNA. Desuden udtømningen af ​​RPS9 i U343MGa Cl2: 6 celler faldt den samlede inkorporering af [

35S] -methionin i spirende protein med 30-50% (Figur 4F). Mekanismen for opretholdelse rRNA syntese ved høje niveauer på trods aktivering af p53 skal stadig bestemmes. Som foreslået af andre, kan dette være en generel udligningsmekanisme som reaktion på en mangel i ribosomer [50].

(A) RPS9 Knockdown effektivitet i gliomcellelinier U87MG, U343MG og U1242MG som bestemt ved immunoblotting for RPS9 i forhold til actin. (B) Cellelinier fra testen (A) eksperiment, og U343MGa Cl2: 6 celler blev transficeret med siCtrl eller siRPS9-1 og efter 72 timer blev antallet af levedygtige celler i forhold til siCtrl behandlede celler sat til 100% blev bestemt for hver cellelinie. Til dette assay blev lige antal celler udpladet i tre eksemplarer på dag 0, og kulturer transficeret på dag 1, og derefter trypsineret og talt 72 timer senere. (C) Total RNA fra eksperimentet i (C) blev separeret på en 1% agarose-formaldehyd-gel, overført til nylonmembraner og underkastet autoradiografi. Nysyntetiserede 18S rRNA er indiceret, mens det samlede niveau for 18S rRNA overført til membranen blev visualiseret ved methylenblåt-farvning. Actinomycin D i en slutkoncentration på 5 nM blev tilsat 3 timer før etikettering og tjente som en kontrol for inhibering af rRNA transkription. (D) U343MGa Cl2: 6 celler blev transficeret med siRNA’er som angivet og efter 72 timer blev cellerne mærket med [

3H] -uridin i yderligere 2 timer. Radioaktiv inkorporering blev målt ved anvendelse af væskescintillationstælling og udtrykt som cpm /ug total RNA og normaliseres derefter til niveauet i siCtrl transficerede celler sat til 100%. Resultaterne præsenteres er gennemsnit og SEM, der repræsenterer tre forskellige eksperimenter. (E) U343MGa Cl2: 6 celler transficeret med siRPS9-1 eller siCtrl i 72 timer blev inkuberet med [methyl-

3H] -L-methionin i 2 timer til den nyligt syntetiserede rRNA forstadier efterfulgt af isolering af total RNA. Lige mængder af total RNA blev dernæst separeret på en 1% agarose-formaldehyd-gel, overført til nylonmembraner og underkastet autoradiografi. Nysyntetiserede 18S rRNA er indiceret (venstre panel) og total 28S og 18S rRNA overført til membranen blev visualiseret ved methylenblåt-farvning (højre panel). En stjerne angiver tilsyneladende ophobning af et intermediært rRNA precursor. (F) U343MGa Cl2: 6 celler transficeret med siRNA’er i 72 timer som angivet blev mærket med [

35S] -methionin. Celler blev udsultet for methionin og cystein i 30 minutter før tilsætning af [

35S] -methionin. Efter mærkning i 2 timer protein ekstrakter blev fremstillet. Radioaktiv inkorporering blev målt ved anvendelse af væskescintillationstælling og udtrykt som cpm /ug total protein og normaliseres derefter med kontrolceller sat til 100%. Resultaterne præsenteres er gennemsnit og SEM, der repræsenterer tre forskellige eksperimenter.