PLoS ONE: udgår i leverkræft en (DLC1) Negativt Regulerer Rho /ROCK /MLC Pathway i hepatocellulært Carcinoma

Abstrakt

Mål

Slettet i leverkræft en (DLC1), et medlem af RhoGTPase aktiverende protein (GAP) familie, vides at have suppressive aktiviteter i tumorigenicitet og cancermetastase. Men de underliggende molekylære mekanismer i hvordan DLC1 undertrykker celle motilitet er ikke blevet fuldt belyst. Rho-kinase (ROCK) er en umiddelbar nedstrøms effektor af RhoA ved mediering cellulære cytoskeletale begivenheder og celle motilitet. I den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at undersøge virkningerne af DLC1 på Rho /ROCK signalvejen i hepatocellulært carcinom (HCC).

Metode /vigtigste resultater

Vi viste, at DLC1 negativt reguleret Rock- afhængig actomyosin kontraktilitet. Fra immumofluorescence undersøgelse fandt vi, at ektopisk udtryk for DLC1 ophævet Rho /ROCK-medieret cytoskeletal reorganisering herunder dannelsen af ​​stress fibre og fokale sammenvoksninger. Det nedregulerede også kortikal phosphorylering af myosin let kæde 2 (MLC2). Disse inhiberende begivenheder ved DLC1 var RhoGAP-afhængige, da RhoGAP-mangelfulde mutant af DLC1 (DLC1 K714E) afskaffede disse hæmmende begivenheder. Desuden fra vestlige undersøgelse, DLC1 inhiberede ROCK-relateret myosin let kæde phosphatasetargeting enhed 1 (MYPT1) phosphorylering på threonin 853. Ved at undersøge cellemorfologi under mikroskop, fandt vi, at ektopisk ekspression af dominant-aktive ROCK frigivet celler fra DLC1-induceret cytoskeletale sammenbrud og celle svind.

Konklusion

Vores data tyder på, at DLC1 negativt regulerer Rho /ROCK /MLC2. Dette implicerer en ROCK-medieret vej af DLC1 undertrykke metastase af HCC celler og beriger vores forståelse i de molekylære mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​hepatocellulært carcinom

Henvisning:. Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, Chan LK, Ching YP, Yam JW-P, et al. (2008) Udeladt i leverkræft en (DLC1) Negativt Regulerer Rho /ROCK /MLC Pathway i hepatocellulært carcinom. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10,1371 /journal.pone.0002779

Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: 20. april, 2008; Accepteret: 30 Juni 2008; Udgivet: 23 Juli 2008

Copyright: © 2008 Wong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af Hongkong Research Grants Rådet (HKU 7436 /04M), RGC Collaborative Reseaarch Fund (HKU 1 /06C), Michael og Betty Kadoorie Cancer Genetics Research Program 2004. IOL Ng er Loke Yew professor i patologi

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cell migration indebærer cykler af trin, som begynder fra. dannelse af celle fremspring på forkanten. På stederne for fremspring, der fokale adhæsioner dannet til at fastgøre cytoskelettet, hovedsagelig actin og myosin, til den ekstracellulære matrix. Cytoskelettet skaber spændinger, som resulterer i actomyosin kontraktilitet til at translokere cellelegemet. Endelig spændingen frigør adhæsioner fra cellens bagkant [1]. Deregulering i nogen af ​​de involverede i cellemigrering trin kan resultere i aberrerende celle bevægelighed og, i cancerceller, metastase [2]. Hepatocellulært carcinom (HCC) er én af de mest udbredte cancerformer i hele verden. Intrahepatisk metastase er den førende årsag til dødelighed hos patienter med denne cancer. Derfor mener vi en bedre forståelse for de molekylære mekanismer, der regulerer HCC cellemigration kan kaste lys på udviklingen af ​​nye målrettede terapeutisk intervention.

Slettet i leverkræft en (DLC1), et tumorsuppressorgen, blev første gang identificeret i primære HCC som en rotte p122RhoGAP homolog [3]. I HCC har DLC1 vist sig at have tumor undertrykkende evner [4] – [6] og underexpressed hovedsageligt gennem gendeletion og DNA-methylering [7] – [9]. Underekspression af DLC1 er også impliceret i andre cancere, såsom bryst-, lunge- og prostata [9] – [14]. DLC1 viste sig også at blive nedreguleret i metastatiske celler sammenlignet med ikke-metastatiske celler i brystet og HCC modeller [15], [16]. Ektopisk ekspression af DLC1 viste sig at undertrykke cellemigrering og invasion i HCC, ikke-småcellet lungecancer, brystcancer, lungecancer, ovariecancer cellelinje modeller [4], [15], [17] – [21], og overekspression af DLC1 i metastatisk brystcancer cellelinje kunne dæmpe størrelse og forekomst af pulmonale metastaser [15]. Men de molekylære mekanismer bag denne undertrykkelse af celle bevægelse og kræft metastaser fortsat uklare.

DLC1 er medlem af RhoGTPase aktiverende protein (RhoGAP) familie og besidder RhoGAP aktivitet specifik for RhoA [8]. DLC1 regulerer negativt aktiviteten af ​​RhoA ved at øge iboende GTP hydrolytisk aktivitet RhoA dermed katalysere omdannelsen af ​​RhoA fra dets GTP-bundet aktiv tilstand til BNP-bundne inaktiv tilstand [22]. Rho-kinase (ROCK) er den bedst kendte nedstrøms effektor af RhoA [23], [24]. Binding af RhoA frigiver ROCK fra sin autoinhibitory struktur og aktiverer ROCK-medierede cellulære begivenheder [23], [25] – [27]. ROCK er kendt for at regulere cellulære begivenheder relateret til celle motilitet. For eksempel blev ROCK vist at styre cellepolaritet ved at regulere PTEN /Akt-signalvejen i neutrofiler [28] og kontrollere hale tilbagetrækning i monocytter og prostatacancerceller [29] – [31]. ROCK også forbedret actomyosin kontraktilitet, en hovedstol trin cellemigration som beskrevet ovenfor [32]. Vigtigere er det, ROCK er en kinase, der phosphorylerer og aktiverer mange nedstrøms substrater såsom LIMK og myosin let kæde 2 (MLC2). Phosphorylering af disse substrater er vigtig i reguleringen cytoskeletal reorganisering og celle migration [33], [34]. Hyperaktivering af Rho /ROCK pathway vides at være forbundet med en mere aggressiv tumor egenskaber såsom metastase og invasion [35] – [41]. Deregulering af Rho /ROCK pathway kan være som følge heraf relateret til dens afvigende opstrøms regulatoriske pathway. Vi har tidligere vist, at DLC1 er en RhoGAP protein, og det er derfor logisk at spekulere, at DLC1 undertrykker kræftcelle metastase gennem negativ regulering ROCK-medieret cytoskeletal omlejring. Imidlertid har denne hypotese aldrig blevet testet eksperimentelt og det mekanistiske grundlag af, hvordan DLC1 undertrykker cancercelle metastase er ikke blevet afgrænset. Derfor er det strategisk at undersøge de mulige funktionelle forbindelser mellem DLC1 og ROCK vej og deres konsekvenser i HCC.

I denne undersøgelse viste vi, at DLC1 hæmmede ROCK-medieret cytoskeletale begivenheder, herunder dannelse af stress fiber og fokal kontakt netværk og phosphorylering af MLC2 på celle cortex. Betydeligt, disse inhiberende virkninger af DLC1 afhang dens RhoGAP aktivitet. Desuden har vi vist, at DLC1 fungerede som en negativ regulator af ROCK for cellens morfologi. Samlet set vi demonstreret, at DLC1 negativt reguleret ROCK undertrykke celle bevægelse i HCC.

Resultater

DLC1 afskaffet dannelsen af ​​ROCK-medieret stress fiber og fokal vedhæftning netværk

Først vi forespørges hvis dannelsen af ​​stress fibre og fokale sammenvoksninger i HCC celler var ROCK afhængig. Vi fandt, at, stress fiber bundling arrays (farvet med phalloidin plet) og fokale sammenvoksninger (paxillin), især i den centrale region, der var forbundet med stress fibre, blev afskaffet ved ROCK-hæmmer behandling (figur 1A). Dette resultat viser, at dannelsen af ​​stress fibre og fokale adhæsioner i HCC-celler er ROCK-afhængig.

(A) ROCK inhibitor undertrykt stress fiber og fokal adhæsionsdannelse i HCC-celler. SMMC-7721 celler blev podet på cover-slip en dag før behandlingen. Stress fibre blev farvet med phalloidin-farvning (rød) og fokale adhæsioner med paxillin farvning (grøn). Stress fibre klart kunne observeres som bundter strækker sig over cellerne og fokale sammenvoksninger blev knyttet til stress fiber bundling arrays i SMMC-7721 mock behandlet kontrol. Behandling med ROCK inhibitor Y27632 på 10 uM i 60 minutter undertrykte dannelsen af ​​stress fiber og fokal vedhæftning netværk i SMMC-7721. (B) og (C) DLC1 undertrykt ROCK-medieret stress fiber og fokal adhæsionsdannelse i HCC-celler. SMMC-7721 celler (i) og BEL7402 (ii) blev transficeret med myc-mærket ekspressionsplasmider, pCS2 + MT, pCS2 + MT /DLC1, og pCS2 + MT /DLC1 K714E, og genkendt af anti-myc antistoffer (9E10). Stress fibre og fokale adhæsioner blev farvet med phalloidin-TRITC og anti-paxillin antistof hhv. Wild-typen DLC1, men ikke RhoGAP-mangel mutant (DLC1 K714E), undertrykt stress fibre dannelse og reduceret antallet af stress fibre-linked fokale sammenvoksninger dannet i SMMC-7721 celler. Procentdel af forskellige DLC1 konstruktioner transficerede celler, der udviser stress fibre eller fokale adhæsioner blev præsenteret i et søjlediagram tilsvarende. For hver konstruktion blev de samlede 67-170 transficerede celler talt under mikroskop. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) af data fra to uafhængige forsøg.

For at undersøge regulerende funktion DLC1 på ROCK-medieret stress fiber og fokal vedhæftning dannelse i HCC, vi forbigående overudtrykt DLC1 i DLC1-mangelfuld SMMC-7721 og BEL7402 HCC celler og dens virkninger på det netværk af stress fibre og fokale sammenvoksninger blev undersøgt. Overekspression af vildtype DLC1 undertrykte signifikant dannelse af stress fibre og fokale adhæsioner i disse celler, som angivet ved phalloidin (figur 1B) og paxillin pletter (figur 1C-i og 1C-ii), henholdsvis. Analogt til ROCK inhibering (figur 1A), DLC1 afskaffet hovedsagelig stress fiber-linked fokale adhæsioner beliggende i den centrale region af celler (fig S1A). Tabet af fokale adhæsioner blev yderligere forværret med ektopisk ekspression af SAM-domæne-deleteret mutant af DLC1 (ΔSAM) (figur S1B), en DLC1 trunkeret konstrukt, der forårsagede en mere alvorlig celle svind og tab af stress fibre [4]. Derimod kan et RhoGAP-deficient mutant (DLC1 K714E) var ikke i stand til at inhibere både stress fiber og fokal adhæsionsdannelse (figurerne 1B og 1C). Disse resultater viste, at DLC1 inhiberede ROCK afhængig stress fiber og fokal adhæsionsdannelse via sin RhoGAP aktivitet.

DLC1 afskaffet ROCK-medieret kortikal myosin let kæde 2 phosphorylering

Aktiv ROCK specifikt phosphorylerer myosin let kæde 2 (MLC2) ved Ser 19; Derfor er dette ROCK-specifikke phosphorylering været almindeligt anvendt som en surrogatmarkør for ROCK aktivitet [36], [42] – [45]. Phosphorylering af MLC2 på Ser19 er vigtig for aktiviteten af ​​myosin som er ansvarlig for actomyosin kontraktilitet og dermed cellemigrering [46]. I denne undersøgelse observerede vi, at phospho-MLC2 farvning af BEL7402 HCC-celler var især fremtrædende på cellen cortex. Men når ROCK-aktivitet blev blokeret af enten Y27632 (figur 2A) eller ektopisk ekspression af en dominant negativ ROCK mutant (figur 2B), er denne perifere phosphorylering af MLC2 var helt afskaffet og phosphoryleringen af ​​MLC2 blev en overvejende cytoplasmatisk mønster. I modsætning hertil ektopisk udtryk for dominant-aktiv ROCK kulminerede i en betydelig stigning i MLC2 fosforylering på aktin bundter (figur 2B). Disse resultater viser, at denne særprægede phosphorylering mønster af MLC2 på celle cortex stramt og positivt er reguleret af ROCK aktivitet.

(A) BEL4702 HCC cellelinje behandlet med mock kontrol eller ROCK inhibitor (Y27632) blev testet med monoklonalt mus antistof mod phospho-MLC2 (Ser 19). Phospho-MLC2 (grøn) blev hovedsagelig detekteret ved cellen cortex af BEL7402 celler (som angivet med pilene), og dette kortikale farvningsmønster blev ophævet ved behandling med ROCK inhibitor Y27632. (B) BEL7402 celler blev transficeret med myc-tagget dominant negativ ROCK eller dominerende aktive ROCK konstruktioner og påvist med kanin-polyklonalt antistof mod myc-epitopen (A14) (rød). Dominerende aktive (DA) ROCK forårsagede intens phosphorylering af MLC2 (Ser 19) til actin bundter (procentsatsen af ​​celler, der udviser dette fænomen: 94,0% af DA ROCK-transficerede celler sammenlignet med 0% af vektor transficerede celler). Pile peger på aktin bundter af den dominerende aktive ROCK transficeret celle, hvor fosforylering af MLC2 (Ser 19) blev forbedret. Dominerende negativ (DN) ROCK undertrykt kortikal fosforylering af MLC2 (Ser 19) (Procent af celler, der udviser dette fænomen: 87,5% af DN ROCK-transfekterede celler sammenlignet med 7,3% af vektor transfekterede celler). Pile peger på cellen cortex af den dominante negative ROCK transficeret celle, hvor phosphorylering af MLC2 (Ser 19) var tabt. Som vist, blev en stram regulering og et optimalt niveau af ROCK aktivitet nødvendig for at opretholde cortical fosforylering af MLC2 (Ser 19) i BEL7402 celler.

Vi næste undersøgt, om DLC1 kunne afskaffe denne ROCK-specifikke MLC2 phosphorylering mønster i HCC-celler. Vi først evalueret, om den korticale phospho-MLC2 farvningsmønster var relateret til de endogene ekspressionsniveauer af DLC1 i forskellige cellelinier. Vi observerede iøjnefaldende phospho-MLC2 farvning på cellen cortex i SMMC-7721, BEL7402, og WRL HCC-cellelinier (figur 3C) og HeLa livmoderhalskræft cellelinje (figur 3C), som ikke havde nogen ekspression af DLC1 (figur 3A). På den anden side, HepG2 og Hep3B, de to HCC cellelinier med DLC1 ekspression (figur 3A), viste diffus cytoplasmisk phospho-MLC2 farvning uden nogen distinkt kortikal phosphorylering af MLC2 på celleperiferi (figur 3B).

(A) DLC1 mRNA og proteinekspression i HCC-cellelinier. (B) og (C) DLC1 ekspression blev associeret med phospho-MLC2 farvningsmønster. Repræsentative billeder fra DLC1-positive og DLC1-negative celler. DLC1-positive Hep3B og HepG2, viste diffus fosforylering af MLC2, mens DLC1 ikke-udtrykkende BEL7402 og HeLa, de viste udtalt kortikal fosforylering af MLC2 på celle cortex.

For at kontrollere, at hæmning af kortikal phospho-MLC2 var direkte relateret til DLC1, vi så forbigående udtrykte vildtype DLC1 og DLC1 RhoGAP-mangelfuld mutant (K714E), henholdsvis i DLC1-nul BEL7402 celler. Vildtype DLC1 væsentligt reduceret antallet af celler med phospho-MLC2 cortical farvning (figur 4A 4B), der betyder den undertrykkende rolle DLC1 på ROCK aktivitet. På den anden side, DLC1 RhoGAP-deficient mutant (K714E) var ikke i stand til at afskaffe phospho-MLC2 cortical farvning (figur 4A 4B). Vores observation foreslog derfor DLC1 hæmmede ROCK-specifikke MLC-2-phosphorylering i HCC celler via sin RhoGAP aktivitet.

(A) pCS2 + MT vektor alene, pCS2 + MT DLC1, og pCS2 + MT DLC1 K714E henholdsvis , blev transficeret ind BEL7402 celler. Anerkendelse af transficerede celler blev udført ved at probe celler med c-myc (A14) kanin-antistof efterfulgt af farvning med anti-kanin-antistof konjugeret med Texas Red. Celler transficeret med pCS2 + MT vektor alene viste markant kortikal phosphorylering af MLC2 som angivet ved pilene. Celler transficeret med DLC1 viste tab af kortikale fosforylering af MLC2. Celler transficeret med DLC1 K714E, den RhoGAP-deficient mutant, der stadig viste udtalt kortikal phosphorylering af MLC2 som angivet ved pilene. (B) Procentdel af forskellige DLC1 konstruktioner udviser kortikal fosforylering af MLC2 ved Ser 19 blev beregnet og præsenteret i et søjlediagram. For hver konstruktion blev 80-100 transficerede celler talt og cortical MLC2 phosphorylering blev registreret. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) af data fra tre uafhængige forsøg.

DLC1 svækket myosinphosphatase aktivitet ved at reducere phosphorylering af myosin fosfatase target subunit 1 (MYPT1) ved Thr 853

Foruden phosphorylering af myosin, ROCK øger også myosin phosphorylering med phosphorylering myosinphosphatase target subunit 1 (MYPT1) ved Thr 696 og Thr 853 og derved inaktivere det. Selv Thr 696 af MYPT1 kan phosphoryleres af andre proteinkinaser, Thr 853 phosphorylering på den anden side er selektivt reguleret af ROCK [32]. Desuden har MYPT1 Thr 853 phosphorylering vist sig at være en lovende surrogatmarkør der omvendt korrelerer med myosin phosphataseaktivitet [36], [42] – [45]. I denne undersøgelse fandt vi, at phosphoryleringsniveauerne af MYPT1 (Thr 853) ved Y27632 behandling blev reduceret i alle testede (figur 5A) HCC-cellelinier, mens de samlede MYPT1 niveauer forblev uændret. Tilsvarende overekspression af DLC1 svækket phosphorylering af MYPT1 på Thr853, hvilket indikerer tab af ROCK-aktivitet (figur 5B). Inaktivering af myosin phosphatase (som afspejlet ved forøget MYPT1 phosphorylering) og aktivering af MLC2 kombineres virkninger af ROCK, og disse virkninger kunne undertrykkes ved DLC1, hvilket fører til et samlet fald på myosin phosphorylering og en reduktion af cellesammentrækningsevne.

(A) ROCK inhibitor Y27632 undertrykt MYPT phosphorylering ved Thr 853 i alle HCC-cellelinier. (B) DLC1 undertrykt MYPT phosphorylering ved Thr 853 i 293 T-celler. Band intensitet blev analyseret ved AlphaEaseFC ™ og procent blev beregnet ud fra sammenligning med dens efter kontrol.

ROCK inhibitor undertrykt HCC celle motilitet

Ved ektopisk udtryk for DLC1 i HCC cellelinje, vi tidligere vist, at DLC1 signifikant undertrykt HCC cellevandring og invasivitet [4]. For at underbygge vores hypotese om, at DLC1 undertrykt cellemigration via negativt regulere ROCK aktivitet, vi undersøgte effekten af ​​ROCK inhibitor på HCC cellemigration med Transwell assay. Vi observerede, at ROCK inhibitor Y27632 undertrykt migration af HCC-celler, SMMC-7721 (figur 6A, venstre panel) og BEL7402 (figur 6B venstre panel), hvilket fremgår af nedsat antal af migrerede celler i Transwell assay. Dette fund tyder på, at ROCK aktivitet er afgørende for HCC celle migration. For at eliminere enhver fejlfortolkning på grund af celledød forårsaget af toksicitet af lægemidlet, udførte vi celleproliferationsassay på HCC-celler. Celleproliferationsassay viste, at Y27632 ikke påvirkede cellevækst, som bekræftede, at hæmning af ROCK påvirkes kun HCC migration celle (figur 6A og 6B højre panel).

ROCK inhibitor Y27632 undertrykt HCC cellemigration. Y27632 nedsat antal migreret (A) SMMC-7721 celler (

P

0,0001,

t

-test) og (B) BEL7402 celler (P 0,0001,

t

-test). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) af data fra tre mikroskopiske felter. Forsøg er blevet gentaget tre gange. Celleproliferationsassay blev vist til højre for at sammenligne væksten i mock kontrol celler og Y27632 behandlede celler.

ROCK vendt cellen morfologiske ændring af DLC1

Vi har tidligere vist, at DLC1 var stand til at inducere celle morfologisk ændring med reduceret stress fiber dannelse i HCC-celler og fibroblaster [4]. Da ROCK er en høvding modulator i cytoskeletal signalering og cytoskeletorganisation er en afgørende faktor for cellemorfologi, vi spekuleret på, at cellen morfologiske forandringer som følge af DLC1 var via ROCK. Til dette formål har vi observeret cellemorfologien af ​​DLC1 og Rock co-transficerede celler ved immunfluorescensfarvning. Vi tælles også antallet af celler, der udviste celle kollaps eller krympning forårsaget af kollaps af cytoskelet netværk (figur 7C), som beskrevet andetsteds [4], [47] – [49]. I denne undersøgelse har vi observeret, at overekspression af DLC1 i COS7-celler induceret cytoskelet kollaps eller celle krympning (figur 7A-i), svarende til vores tidligere fund [4]. Cell svind blev forstærket af ektopisk udtryk for SAM-domænet slettet mutant af DLC1 (ΔSAM) (Figur 7B-i). Co-transfektion af tomme pEGFP vektor kunne ikke redde DLC1-induceret celle morfologisk ændring, men celler med dominerende aktive ROCK kunne overvinde den inhiberende regulering fra DLC1 (figur 7A-ii) og endda DLC1ΔSAM (figur 7B-ii) og udgivet celler fra DLC1 -inducerede celle krympning. Dette eksperiment viste, at ROCK er en af ​​de nedstrøms effektorer af DLC1 i at koordinere de morfologiske ændringer i HCC celler.

COS7 celler blev cotransficeret med (A) DLC1 og ROCK eller (B) DLC1ΔSAM og ROCK, henholdsvis . Celler transficeret med pCS2MT DLC1 eller pCS2MT DLC1ΔSAM optrådte rød, mens celler transficeret med pEGFP eller pEGFP ROCK dukkede grønt. DLC1-induceret celle cytoskeletal kollaps eller celle krympning (A-i), som blev yderligere styrket og klart af SAM-deleteret konstrukt, pCS2 + MT DLC1ΔSAM (B-i). ROCK var i stand til at gendanne celler fra DLC1-induceret celle krympning (A-II) og endog fra DLC1ΔSAM-induceret intense celle krympning (B-ii). (C) Co-transficerede celler blev talt og registreret deres morfologier. Antallet af co-transficerede celler, som viser observerbar celle krympning (celle kollaps) blev divideret med det samlede antal af co-transficerede celler tælles, til at beregne procentdelen af ​​celler i at vise krympning som vist i søjlediagrammet. For hver kolonne blev 150-200 co-transficerede celler talt. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) af data fra tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Et af de vigtige roller DLC1 er dets evne til at undertrykke kræft celle migration og invasion. I denne undersøgelse at belyse de underliggende mekanismer i reguleringen af ​​HCC celle migration og invasion af DLC1, har vi vist, at DLC1 undertrykte HCC cellevandring gennem regulering af cytoskelettet og actomyosin sammentrækning. Vi har også vist, at DLC1 fungerede som en negativ regulator af ROCK i at kontrollere cellemorfologi.

DLC1 negativt reguleret ROCK medieret actomyosin kontraktilitet

kontraktile bevægelse af kræftceller er genereret af hinanden følgende sammentrækninger af actomyosin bundter sammensat af actin og myosin kaldet actomyosin. Disse actomyosin bundter, visualiseret som stress fibre strække sig over cellelegemet og skabe en spænding for at generere celle sammentrækning at drive cellebevægelse ved at forbinde med de fokale adhæsionsmolekyler [50]. Baseret på den tidligere undersøgelse om den hæmmende virkning af DLC1 på stress fibre, heri vi yderligere fundet, at dannelsen af ​​stress fibre og omdrejningspunkt sammenvoksninger netværk var afhængig af DLC1 RhoGAP og ROCK aktivitet i HCC celler. Dette fund yderligere belyser, at stress fibre og fokale sammenvoksninger arbejde hånd i hånd som beskrevet af Hall A. [51], og deres dannelse er indbyrdes afhængige og stramt reguleret af RhoGAP af DLC1 og ROCK aktivitet. Desuden DLC1 faldt ROCK-medieret phosphorylering af MYPT1 (Thr853) og phosphorylering af MLC2 (Ser19) og følgelig vil føre til et fald i den samlede myosin phosphorylering og forårsager en reduktion af stress fiber kontraktilitet [46]. Alle disse linjer af beviser konvergeret at forklare, at DLC1 kontrolleret en af ​​de pivotale vandrende mekanismer, actomyosin sammentrækning, svarende til et andet medlem af RhoGAP familien, p190-RhoGAP [52].

DLC1 afskaffet omdrejningspunkt vedhæftning dannelse og også lokaliseret til fokal vedhæftning komplekse

En spændende spørgsmål om dette fund om den hæmmende virkning af RhoGAP på fokale adhæsionsmolekyler er opstået. DLC1 og flere medlemmer af RhoGAP proteiner, herunder P122-RhoGAP og RC-GAP72 viste sig at være lokaliseret ved fokale sammenvoksninger [47], [49]. Faktisk andre, og vi har tidligere rapporteret, at DLC1 også lokaliseret til fokale adhæsioner og interageret med medlemmer af tensin familien [18], [53], [54]. I denne undersøgelse fandt vi, at DLC1 undertrykte stress fiber-linked omdrejningspunkt vedhæftning dannelse ved sin RhoGAP aktivitet. Fra immunfluorescens studie observerede vi, at i en del af DLC1 transficerede celler, DLC1 udviste en fokal adhæsion lokalisering mønster (fig S1A); henviser i nogle andre DLC1 transficerede celler, især dem udviser omfattende celle krympning, en intensiv tryktab fiber-koblede fokale adhæsioner blev observeret (fig. 1C). DLC1 lokalisering til fokale adhæsioner og dens hæmmende effekt på fokale adhæsioner udelukker ikke hinanden. Vi spekulere, at dosering effekt kan være en af ​​de involverede faktorer. Når en celle blev transficeret med en høj dosis af DLC1, ville DLC1 slukke alle stress fibre og stress fiber-linked fokale adhæsioner og resultere i omfattende celle kollaps (fig. 1C). På den anden side, når en celle blev transficeret med en lavere dosis af DLC1, ville DLC1 slukke meste stress fibre og stress fiber-linked fokale adhæsioner men spare nogle fokale adhæsioner ikke er forbundet med stress fibre og resulterer i en mildere celle sammenbrud ( Figur S1A). En anden spekulation var, at ligner RC-GAP72 [47], DLC1 kan lokalisere til fokal vedhæftning at smuldre de centrale vedhæftning komplekser.

cytoskeletal kollaps induceret celle svind og virkningen af ​​DLC1 på cytoskeletal kollaps

fokale adhæsioner og actomyosin stress fibre altid arbejde i indbyrdes afhængig måde, og de tilsammen konstruere et stillads til at understøtte en intakt morfologi af cellen [47]. De forstyrrelser af ovennævnte netværk forårsaget af DLC1 førte til en intensiv celle cytoskeletal sammenbrud resulterer i celle krympning. Dette fund var ligner Barberis D

et al.

‘S undersøgelse om p190RhoGAP at tab af fokale sammenvoksninger induceret af p190RhoGAP forud celle svind [48]. Vi observerede, at tab af fokale sammenvoksninger og stress fibre fandt sted en time efter ROCK hæmning af Y27632, men cellerne ikke kollapse straks (figur 1A), indtil langvarig behandling af Y27632 op til 24 timer (Figur S2). Fra denne observation, vi gætter, at celle sammenbrud forårsaget af Y27632 behandling var resulteret mod tab af fokal vedhæftning og stress fibernet. Ved inhibering af ROCK ved Y27632 kunne de cytoskeletale netværk, som ikke dannes, og cellerne kunne ikke længere udholde tabet af cytoskeletale netværk, og til sidst undergår celle kollaps, som vi observeret som celle krympning (figur 8). Den foreliggende undersøgelse viste, at den cytoskeletale sammenbrud induceret af DLC1, en RhoGAP som dets nedregulering er forbundet med HCC progression, delvis kunne vendes ved aktiv ROCK, yderligere antyder, at DLC1 reguleres negativt ROCK ved styring actomyosin kontraktilitet, cellemorfologi, og sekventielt cellemigration . Vores tidligere undersøgelse rapporterede, at DLC1 ikke kun undertrykt cellevandring men også celleinvasion som involverede ekstracellulær matrix barriere. Sahai E

et al.

Rapporterede, at kræft cellelinjer kan besidde forskellige måder celle motilitet og de afrundede morfologi kræft cellelinjer var mere følsomme over for ROCK inhibitor i 3-dimensionel matrix [55]. Men om denne model er gældende for HCC celler, og om andre ekstracellulære proteolytiske veje coorperate med DLC1 /Rho /ROCK /MLC-vejen er stadig ukendt, og ventede at blive behandlet.

(A) Stress fibre blev tilsluttet fokale adhæsioner danner et netværk. Stress fibre strækker sig over cellen for at tilvejebringe cellen en intakt morfologi. (B) DLC1 RhoGAP eller tab af ROCK aktivitet induceret tab af stress fibre og fokale sammenvoksninger. Et par fokale sammenvoksninger og bundter af stress fibre tilbage. (C) En langvarig eller alvorligt tab af stress fiber og fokal adhæsion netværk forårsaget af DLC1 RhoGAP eller undertrykkelse af ROCK aktivitet ville resultere i intensiv cytoskelet sammenbrud. Alle stress fibre og fokale sammenvoksninger blev afskaffet.

Vores undersøgelse viste, at ROCK-hæmmer, Y27632, ikke påvirkede HCC celledeling på en effektiv dosis, som undertrykte HCC celle migration. ROCK-hæmmere er ofte blevet brugt i dyremodeller, såsom rotter og mus-modeller, uden at forårsage alvorlig toksicitet til dyrene på effektive doser [35], [56]. Takamura et al. vist, at Y27632 kunne hæmme intrahepatisk metastase af HCC [35] og for nylig, en anden ROCK-hæmmer, fasudil, er blevet anvendt med succes i kliniske forsøg for patienter med hjerte-kar-sygdomme [57]. Disse undersøgelser viser, at toksiciteten af ​​ROCK-hæmmere til celler er begrænset [35]. Akkumulerende viden tyder på, at ROCK spiller en vigtig rolle i kræft metastase, og den foreliggende undersøgelse har beriget viden om ROCK signalvejen i HCC. ROCK hæmmere såsom Y27632 kunne være nyttigt at det kemoterapeutiske intervention i undertrykke intrahepatisk metastase, en væsentlig årsag til dødelighed i HCC patienter, uden at forårsage meget skadelige virkninger på patienterne. ventede Yderligere karakterisering af effektiviteter af ROCK inhibitorer og anti-ROCK behandlingsformer i behandlingen af ​​HCC stadig.

Materialer og metoder

Cellelinjer og plasmider

SMMC-7721 og BEL7402 var gaver fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences; 293T, COS 7, HepG2 og Hep3B blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293T, BEL7402, SMMC-7721, og COS7 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med højt glucoseindhold suppleret med 10% kalvefosterserum; Hep3B og HepG2 blev dyrket i minimalt essentielt medium (MEM) tilsat 10% føtalt bovint serum. Myc-mærkede ekspressionskonstruktioner (pCAG) bærer human vildtype ROCK, dominerende aktiv ROCK (1-725 aa), og dominant negativ ROCK mutant (K105A, I1009A) blev venligst stillet til rådighed af S. Narumiya (Det Medicinske Fakultet, Kyoto University) [27]. Den humane ROCK kinasedomænet (ROCK 76-338 a.a.) blev PCR-amplificeret og klonet i pEGFPC3 vektor under anvendelse Kpnl- og Xhol fordøjelse sites og blev anvendt som dominerende aktiv form af ROCK. Vildtype DLC1 og RhoGAP-deficiente mutanter blev klonet som beskrevet tidligere [4].

Drug behandling og transfektion

ROCK-specifik inhibitor Y27632 blev opnået fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). Til behandling blev celler tilsat Y27632 ved 10 pM og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. For transfektion blev 1 × 10

5 celler podet på dækglas i 35 mm plader en dag før transfektion. Angivne plasmider blev transficeret ind i celler med FuGene 6 reagens (Roche, Basel, Schweiz) ifølge producentens instruktioner.

immunfluorescensmikroskopi

Mus monoklonalt antistof mod phospho-myosin let kæde 2 (Ser 19) blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Muse monoklonalt antistof mod paxillin blev opnået fra Upstate (Lake Placid, NY). Monoklonalt muse (9E10) og kanin polyklonale (A14) antistoffer mod c-myc blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Red dye-konjugeret AffiniPure gede anti-mus IgG og fluorescein (FITC) -konjugeret AffiniPure gede anti-kanin IgG blev erhvervet fra Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). For immunfluorescensfarvning blev celler fikseret i paraformaldehyd, permeabiliseret med Triton, blokeret med bovint serumalbumin og derefter inkuberet med angivne primære og sekundære antistoffer.