PLoS ONE: Effekt af B7.1 Co-stimulering på T-Cell Based Immunitet mod TAP-Negativ Kræft kan lettes ved TAP1 Expression

Abstrakt

Tumorer mangelfulde i ekspressionen af ​​transportøren forbundet med antigen forarbejdning (TAP) sædvanligvis inducerer ikke T-celle-medieret immunitet og er resistente over for T-celle lysis. Vi har imidlertid fundet, at indførelsen af ​​B7.1-genet i TAP-negative (TAP

-) eller TAP1-transficerede (TAP1

+) murine lunge carcinoma CMT.64 celler kan forøge kapaciteten af ​​cellerne til inducerer et beskyttende immunrespons mod vildtype-tumorceller. Forskelle i styrken af ​​de beskyttende immunrespons blev observeret mellem TAP

– og TAP1

+ B7.1 udtrykke CMT.64 celler afhængigt af doser af γ-bestrålede celler immunisering. Mens mus immuniseret med enten høj eller lav dosis af B7.1-udtrykkende TAP1

+ -celler afvist TAP

– tumorer, kun højdosis immunisering med B7.1-udtrykkende TAP

– celler resulterede i tumorafstødning. Den inducerede beskyttende immunitet var T-celle-afhængig som vist ved dramatisk reduceret antitumor immunitet i mus depleteret for CD8 eller CD4-celler. Forøgelse af T-cellemedieret immunrespons mod TAP

– tumorceller blev også observeret i en viralt inficeret tumorcelle system. Når mus blev immuniseret med en høj dosis af y-bestrålede CMT.64 celler inficeret med vacciniavira transporterer B7.1- og /eller TAP1 gener, fandt vi, at cellerne co-udtrykkende B7.1 og TAP1, men ikke dem, der udtrykker B7. 1 alene, inducerede beskyttende immunitet mod CMT.64 celler. Desuden inokulering med levende tumorceller transficeret med flere forskellige gen (er) viste, at kun B7.1- og TAP1-co-udtrykke tumorceller signifikant nedsat tumorigenicitet. Disse resultater indikerer, at B7.1-provokeret antitumor immunitet mod TAP

– cancer fremmes ved TAP1-ekspression, og dermed begge gener bør overvejes til cancerterapi i fremtiden

Henvisning:. Li XL, Liu YY, Knight D, Odaka Y, Mathis JM, Shi R, et al. (2009) Effekt af B7.1 Co-stimulering på T-Cell Based Immunitet mod TAP-Negativ Kræft kan lettes ved TAP1 Expression. PLoS ONE 4 (7): e6385. doi: 10,1371 /journal.pone.0006385

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 24, 2009; Accepteret: 18 juni 2009; Udgivet: 24 Jul 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Louisiana Board of Regents, Feist-Weiller Cancer center, Louisiana State Gene Therapy Program og Institut for Cellulær Biology Anatomi på LSU Health Sciences center-Shreveport. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Qian-Jin Zhang besidder aktier fra TAPIMMUNE INC Xiao Lin Li blev delvist støttet hendes løn ved TAPImmune Inc gennem University of British Columbia, Canada fire år siden, da hun arbejdede i University of British Columbia, Canada. Aktuel arbejde har ingen støtte fra dette selskab.

Introduktion

En effektiv strategi mod kræft er induktion af CD8

+ T-celle immunitet [1]. Men tumorer deficiente i større histokompatibilitetskompleks klasse I (MHC-I) antigenpræsentation ofte unddrage immunmedieret destruktion [2], [3],. Mangel på TAP udtryk ofte observeres i human cancer [2], [3]. TAP er sammensat af TAP1 og TAP2 underenheder, hvis funktion er at transportere cytosoliske-genererede peptider ind i lumen af ​​det endoplasmatiske reticulum (ER) for MHC-I binding, efterfulgt af transport af MHC-I /peptidkomplekser til celleoverfladen. Mangel på TAP-ekspression (en eller begge underenheder) i tumorceller generelt inhiberer ekspression af TAP-afhængige peptidantigener på celleoverfladen, hvilket resulterer i svigt af CD8

+ T-celle genkendelse.

Selvom præsentation af TAP-afhængige peptid-antigener er begrænset, TAP-deficiente celler er i stand til at præsentere TAP-uafhængige antigener. For eksempel muse T-lymfom RMA-S-celler, som kun udtrykker TAP1 [6] og humane T og B hybrid T2-celler, der mangler både TAP1 og TAP2 gener [7] kan præsentere nogle MHC-I-begrænsede TAP-uafhængige antigener afledt fra proteiner beliggende i eller uden for ER lumen [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Forskellige kapacitet til antigen præsentation er også observeret mellem TAP-negative og TAP1-positive tumorceller. Gabathuler, R et al. rapporterer, at indførelsen af ​​TAP1 genet i TAP-negative tumorceller ændres tilstanden af ​​antigenpræsentation at ligne TAP1-positive RMA-S-celler, som angivet ved den kendsgerning, at et viralt afledt antigen effektivt kan præsenteres på overfladen af TAP1-possitive men ikke TAP-negative tumorceller [14]. Selvom TAP-uafhængige antigener kan præsenteres af TAP1-positive eller TAP-negative tumorceller, at svigt af cellerne effektivt fremkalde en stor population af tumor-antigen specifikke CD8

+ T-celle effektorer kan være en væsentlig årsag begrænser effekt af antitumor immunitet. Sådan antitumor immunitet kan øges ved at indføre en B7.1-gen i TAP-deficiente tumorceller som rapporter indikeret [13], [15].

B7.1 er et costimulerende molekyle, der interagerer med CD28 på T-lymfocytter og spiller en vigtig rolle i immune induktion. Tumorer transduceret med B7.1 kan fremkalde CD8

+ T-celle afhængige antitumor respons [16], [17], [18]. Især B7.1-transficerede TAP 1-udtrykkende RMA-S-celler kan fremkalde T-celle-kloner, der reagerer med TAP1 eller TAP2 deficiente tumorceller, men ikke med TAP-kompetente tumorceller [13]. En sådan T-celleklon genkender en ER-lokaliserede-Lass5-protein-afledte antigen, som udelukkende præsenteres af RMA-S og andre TAP1 eller TAP2 deficiente celler og beskytter mus mod RMA-S tumor udfordring [13]. Disse undersøgelser giver nyttige oplysninger om priming af T-celle baseret immunitet mod tumor immun escape varianter i kræft immunterapi. Men i mange tilfælde, human cancer udviser en TAP-negativ fænotype, og det er således stadig uklart, om B7.1 ekspression i disse tumorceller kan fremkalde den beskyttende T-celleimmunitet, eller om ekspression af begge B7.1- og TAP1 gener er kræves for at skabe en sådan immunitet.

I denne undersøgelse anvendte vi en murin lungecarcinom CMT.64 cellelinje som model cellesystem at behandle dette spørgsmål. De CMT.64 celler er defekte i både TAP1 og TAP2 på transkriptionelle og translationelle niveau og udtrykker lave niveauer af MHC-I-molekyler [14], [19]. Vi transficeres de CMT.64 celler med enten B7.1 gen alene eller B7.1 sammen med muse TAP1 gener, og fandt, at transfektanter inducerede forskellige antitumor immunresponser. B7.1 og TAP1 co-ekspression i tumorceller signifikant nedsætter deres tumorigenicitet mens B7.1-ekspression alene i cellerne har ingen ændring. Men begge B7.1-udtrykkende og B7.1 og TAP1 co-udtrykkende celler dramatisk forøget kapacitet til produktion af beskyttende immunitet ved den høje dosis af tumor immunisering. Ved den lave dosis af tumor immunisering kun B7.1- og TAP1 co-udtrykkende celler tilvejebragt beskyttende immunitet. Disse resultater antyder, B7.1 og TAP1 co-ekspression i tumorceller er vigtigt for T-celle priming.

Resultater Salg

B7.1 og TAP1 ekspression nedsætter tumorgenicitet af TAP-deficiente CMT. 64 celler kun i T-celle kompetente mus

for at vurdere virkningerne af B7.1 udtryk på TAP1-positive og TAP-negative tumorceller på antitumor immunitet, vi først analyseret udtryk for de indførte gener i CMT.64 transfektanter. CMT.64 /pp blev CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p, CMT.TAP1 /B7.1- og CMT.TAP1,2 cl.21 celler transficeret med to tomme vektorer, B7.1- + tom vektor , TAP1 + tom vektor, TAP1 + B7.1 eller TAP1 + TAP2 henholdsvis (se Materialer og Metoder til detaljer). Efter lægemiddel-selektion, transfektanterne udtrykte det relevante gen (er), bortset fra en CMT.64 /pp transfektant som ikke viste TAP1, TAP2 eller B7.1-ekspression (fig.1A og 1B). Genekspression var stabil i den tid af undersøgelsen. K

b og D

b udtryk i de fleste transfektanter svarede til vildtype CMT.64 celler, bortset fra CMT.TAP1,2 cl.21 celler, som udtrykte K

b og D

b molekyler på et niveau højere end det, som udtrykkes i de andre (fig. 1C).

TAP, B7.1, K

b og D

b udtryk i CMT.64 transfektanter blev bestemt. A) TAP1 og TAP2 proteiner blev påvist i CMT.64 transfektanterne og kontrol RMA celler ved Western blot ved hjælp af anti-TAP1 og TAP2 polyklonale antistoffer henholdsvis (se Materialer og metoder). blev påvist niveauer af ekspression af GAPDH protein i hver prøve som lastning kontrol. B) B7.1 ekspression i CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1-celler blev detekteret ved FACS assays under anvendelse FITC-konjugeret B7.1-specifikke mAb 16-10A1. Control er CMT.64 celler farvet med mAb 16-10A1. C) K

b eller D

b udtryk blev opdaget af FACS analyser anvender primær mAbs Y-3 mod H-2K

b eller 28-14-8S mod H-2D

b efterfulgt af farvning med et FITC-konjugeret ged anti-mus IgG sekundære Ab. CMT.64 celler farvet med et primært mAb 15-5-5S (mod H-2D

k) efterfulgt af farvning med et FITC-konjugeret gede-anti-muse-IgG sekundært Ab blev anvendt som en negativ kontrol. a: negativ kontrol; b: CMT.64; c: CMT.64 /pp; d: CMT.B7.1 /p; e: CMT.TAP1 /p; f: CMT.TAP1 /B7.1; og g:. CMT.TAP1,2 cl.21

For at vurdere, om B7.1 udtryk i tumorcellerne kunne falde tumorgenicitet blev C57BL /6 mus injiceret med levende CMT.64 celler eller transfektanter og overlevelsesrater og /eller tidspunkter blev registreret. Resultater er vist i fig. 2A. Alle mus injiceret i.p. med CMT.64 eller CMT.64 /pp-celler (2 kontrolpunkter grupper) døde før dag 27 efter inokulation af tumorceller. I modsætning til to kontroller viste CMT.TAP1 /B7.1-bærende mus en meget vigtig overlevelse (P«0.05), også sammenlignet med alle andre mus grupper (P«0.05). På dag 100, 30% af musene stadig i live. Imidlertid viste CMT.B7.1 /P-bærende mus ingen signifikant forskel sammenlignet med to kontrolgrupper (P 0,05). CMT.TAP1 /p-bærende mus viste signifikant overlevelsestid sammenlignet med de to kontroller (P 0,05), men ingen forskel fra CMT.B7.1 /P-bærende mus (P 0,05). Resultaterne af dette eksperiment viser, at et betydeligt fald i tumorgenicitet medieres ved ekspression af B7.1 sammen med TAP1 molekyler i CMT.64 tumorceller.

Tidspunktet for sygelighed blev registreret for mus (hver gruppe, n = 10) inokuleret med levende tumorceller eller immuniseret med y-bestrålede celler og efterfulgt af udfordring med CMT.64 celler. Statistik for mus overlevelse blev opnået ved hjælp af Kaplan-Meier log rank overlevelse test og forskelle blev betragtet som signifikante ved P 0,05. A) Tumorigenicitet blev påvist ved injektion af C57BL /6-mus i.p. med levende CMT.64 celler eller deres transfektanter (5 × 10

4 celler pr mus). B) Nøgne mus blev anvendt til bestemmelse af tumorigenicitet med betingelserne for tumorinjektion den samme som vist i A), P 0,05 for alle sammenligninger. C) C57BL /6-mus blev immuniseret i.p. med forskellige y-bestrålede tumorceller eller PBS ved en høj dosis (venstre, 5 × 10

6 celler per mus) eller en lav dosis (højre, 5 × 10

5 celler per mus). Efter en 20-dages immunisering blev musene udfordret i.p. med levende CMT.64 tumorceller (2,5 x 10

5 celler per mus). Forskellige overlevelsesrater og /eller tidspunkter blev observeret.

For at afgøre, om nedsat tumorgenicitet af CMT.TAP1 /B7.1 celler medieret af T-celler, nøgne mus blev podet med CMT.64 celler eller transfektanter blev og overlevelse bestemmes. Figur 2B viser, at alle mus døde på 25-27 dage, hvilket antyder, at T-celler spiller en vigtig rolle i immunresponset mod CMT.TAP1 /B7.1-celler, hvilket resulterer i et fald i tumorgenicitet.

CMT. B7.1 /p-immunisering ved en høj dosis inducerer et immunrespons så effektiv som CMTTAP1 /B7.1-immunisering, men er mindre effektiv ved en lav dosis

Antitumor immunreaktioner kan udvides med B7.1- udtrykker tumorceller immunisering [16], [17], [18]. For at vurdere om beskyttende immunitet mod TAP-negative tumorceller kan dannes ved immunisering med enten TAP 1-udtrykkende CMT.TAP1 /B7.1-celler eller TAP-negative CMT.B7.1 /p-celler, blev C57BL /6-mus immuniseret med forskellige mængder af y-bestrålede celler efterfulgt af udfordring med CMT.64 celler. Kontrolmus blev immuniseret med y-bestrålet CMT.64 /pp celler. Resultater indikerer en dosisafhængig beskyttelse. Ved den høje dosis af immunisering (5 × 10

6 celler per mus), både CMT.TAP1 /B7.1-immuniserede og CMT.B7.1 /P-immuniserede mus blev godt beskyttet mod levende tumor angreb (fig. 2C venstre-panel). De to mus udviste en meget signifikant overlevelsesraten (100% overlevende), sammenlignet med den CMT.TAP1 /p-immuniserede mus gruppe (60% overlevende, s 0,05). Sidstnævnte gruppe viste en overlevelsesrate signifikant højere end en kontrolgruppe immuniseret med TAP-negative CMT.64 /pp celler (P«0.05). Men ved den lave dosis af immunisering (5 × 10

5 celler per mus), CMT.TAP1 /B7.1-immuniserede mus havde en overlevelsesrate højere end CMT.B7.1 /P-immuniserede mus (fig. 2C højre panel, P 0,05). Der sås ingen forskel i overlevelsen mellem CMT.B7.1 /p-immuniserede og CMT.TAP1 /p-immuniserede mus (P 0,05). Resultater antyder, at ved den høje dosis af immunisering, B7.1 og TAP1 co-ekspression eller B7.1-ekspression alene gør tumorceller potente immunogener, mens lav dosis immunisering potent immunogenicitet kræver tumorceller co-udtrykkende både TAP1 og B7.1 molekyler.

CD8

+ T-celler spiller en vigtig rolle i muse beskyttelse

for at bestemme om den øgede beskyttelse efter B7.1-udtrykkende tumor immunisering blev medieret af en T-celle-baseret immunrespons, vi brugte mAbs at nedbryder CD8

+ eller CD4

+ T-celler i C57BL /6 mus før immunisering og tumorceller udfordring. Mus injiceret i.p. med relevante mAb hver anden dag i den første uge blev analyseret ved FACS assays til CD8

+ eller CD4

+ T-cellepopulationen i blod. Resultaterne viste, at behandling faldt dramatisk CD8

+ T-celle eller CD4

+ population T-celle (fig. 3A). Anti-CD8 specifik mAb-behandling reducerede CD8

+ T-celler fra 17,66% til 0,65%, og anti-CD4 specifik mAb-behandling reducerede CD4

+ T-celler fra 19,22% til 0,11%. T-celle-subpopulation depleterede mus blev injiceret med y-bestrålet CMT.64 transfektanter, efterfulgt af belastning med levende CMT.64 celler. Overlevelse Resultaterne er vist i fig. 3B. Den anti-CD8 specifikt mAb behandling faldt betydeligt overlevelsen af ​​tumorbærende mus. Der var ingen biologisk signifikant forskel mellem hver testet-gruppe og kontrolgruppen (CMT.64 /pp-immuniserede mus). Derudover anti-CD4 specifik mAb behandling delvist nedsat overlevelse af hver testet-gruppe, sammenlignet med kontrolgruppen (P«0.05). Resultater antyder, at beskyttelse af mus mod tumorprovokation fuldt afhang CD8

+ T-celler og delvist afhængig af CD4

+ T-celler.

Mus (hver gruppe, n = 10) blev injiceret i.p. med mAb’er GK1.5 for CD4

+ T-celler eller 2,43 for CD8

+ T-celler (0,1 ml per mus) hver anden dag i den første uge og én gang om ugen bagefter at depletere relevant T-celle subpopulation . A) Før γ-bestrålede tumorceller immunisering, udtømning af CD8

+ eller CD4

+ T celle-undergrupper blev vurderet i blod ved FACS assays under anvendelse FITC-konjugeret anti-muse CD8a (5H1-1) eller FITC-konjugeret anti-muse CD4 (RM4-4) sammen med PE /Cy5-konjugeret anti-muse CD3 (145-2C11). Frekvensen af ​​CD8

+ eller CD4 blev påvist

+ T-celler før mAb behandling (angivet som normalt), og efter første uge mAb behandling og før γ-bestrålede tumorceller immunisering (angivet som mAb-behandling). B) Efter en 20 dages immunisering med y-bestrålede tumorceller (5 x 10

6 celler per mus) blev musene udfordret i.p. med levende CMT.64 tumorceller (2,5 x 10

5 celler per mus). Tidspunktet for sygelighed blev registreret.

Præsentation af TAP-uafhængig Lass5 antigen ved TAP-deficiente tumorceller

Det faktum, at TAP-deficiente B7.1-udtrykkende tumorceller kan generere en CD8

+ T-cellemedieret immunrespons mod TAP-negative tumorceller tyder på, at tumorceller foreliggende TAP-uafhængige antigen (er) for T-celle priming. At afgøre, om dette er sandt, vi fokuseret på D

b-begrænset Lass5 epitop MCLRMTAVM, et antigen præsenteret af mange TAP-deficiente celler [13]. CMT.64 og CMT.TAP1,2 cl.21 celler udtrykker Lass5 genet som angivet ved real-time PCR (fig. 4A til venstre). Men TAP-negative og TAP1-transficerede CMT.64 celler, men ikke TAP-kompetent CMT.TAP1,2 cl.21 celler blev dræbt af en T-celle population genereret ved immunisering med Lass5 peptid pulsede RMA-S /B7.1 celler som bestemt ved en forlænget (12-16 h)

51Cr-frigivelsesassay (fig. 4A til højre). TAP-kompetent CMT.TAP1,2 cl.21 celler blev dræbt, når de blev pulset med Lass5 peptid (fig. 4A til højre), hvilket tyder på, at cellerne ikke effektivt præsentere denne epitop.

A) Venstre : RT-PCR blev udført for at opdage to splejset (lange og korte) Lass5 gen udskrifter [13] i CMT.64, CMT.TAP1,2, cl.2 og RMA-S-celler. Kun den lange transkript koder for et Lass5 epitop [13]. A) Til højre: Lass5 epitop præsentation af TAP-mangelfulde og TAP-dygtige CMT.64 celler blev opdaget af 12-16 h

51Cr-release assays. Lass5 specifikke T-celler blev dannet ved immunisering i.p. med y-bestrålede RMA-S /B7.1-celler pulseret med 5 pM Lass5 peptid. De immuniserede splenocytter blev restimuleret

in vitro Salg med Lass5 peptidpulserede y-bestrålede RMA-S /B7.1-celler i 5 dage. En af tre forsøg er vist. B) Venstre: 12-16 h

assays 51Cr-frigivelse blev udført for at bekræfte, at et NP

366-374 eptitope specifik T-cellepopulation dannet ved immunisering med y-bestrålede RMA-S /B7.1-celler pulset med 5 uM NP

366-374 peptid indeholdt ikke T-celle subpopulationer anerkender TAP-uafhængige epitoper præsenteret af CMT.64 og dets transfektanter. De

51Cr-labled mål blev vist i figur 4B. B) Til højre: Standard

analyser 51Cr-release blev udført for at bekræfte, at TAP-deficiente CMT.64 transfektanterne ikke til stede TAP-afhængige NP

366-374 epitop når cellerne blev inficeret natten over med VV transporterer NP

366-374 minigen ved infektionsmultiplicitet (MOI) på 3.

51Cr-labled mål blev vist i figur 4B. NP

366-374 epitop specifikke T-celler blev genereret ved immunisering med y-bestrålede RMA-S /B7.1 celler pulset med 5 uM NP

366-374 peptid og re-stimuleret med 5 uM NP

366-374-peptid in vitro. C) en ELISPOT-analyse blev udført for at påvise Lass5 specifikke IFN-y-secernerende forstadier. Mus blev immuniseret med γ-bestrålede CMT.64 /pp, CMT.TAP1,2, CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1 tumorceller. De immuniserede splenocytter blev stimuleret med eller uden Lass5 peptid. Antallet af Lass5 antigenspecifikke, IFN-y-secernerende forstadier blev bestemt. Forstadieforekomst rapporteres som IFN-γ-udskillende celler pr 10

6 splenocytter (IFN-γ-SC /10

6 splenocytter).

Da T-celle population blev genereret af RMA-S /B7.1-celler pulseret med Lass5 peptid, kan vi ikke udelukke muligheden af, at T-celle-population indeholder subpopulationer af andre epitop-specifikke T-celler, der dræber TAP-deficiente tumorceller. Dette skyldes, at RMA-S /B7.1-celler anvendt til immunisering er blevet rapporteret at være i stand til at generere mange forskellige K

B og D

b begrænsede T-cellekloner [13]. For at eliminere denne mulighed, vi genereret en D

b-begrænset influenza NP

366-374 (ASNENMDTM) epitop specifik T-celle populationen ved immunisering med RMA-S /B7.1 celler pulset med NP

366 -374 peptid under anvendelse af betingelser svarende til dem for Lass5 specifik T-celle-generation. Tumor celler udtrykker ikke influenza NP

366-374 epitop og dermed NP

366-374 epitop specifikke T-celler bør ikke genkende tumorcellerne. Hvis T-cellepopulationen indeholder NP

366-374 epitop irrelevante T-celler, kan en sådan T-cellepopulation enten dræbe TAP-deficiente tumorceller eller undlader at dræbe cellerne. Hvis T-cellerne dræber tumorcellerne dette antyder, at TAP-uafhængige epitop specifik T-celler, bortset NP

366-374 epitop, kan co-dannet ved immunisering med RMA-S /B7.1-celler pulset med NP

366-374 peptid. Hvis T-cellerne ikke dræber tumorcellerne Dette antyder, at peptid-pulserede RMA-S /B7.1-celler generere en T-cellepopulation indeholdende T-celler, som genkender fortrinsvis peptidepitopen anvendt til immunisering. Resultaterne viser, at de genererede T-celler ikke kan dræbe enten TAP-mangel eller TAP-kompetent tumorceller bortset CMT.64 celler pulset med NP

366-374 peptid (fig. 4B til venstre). Således er vores resultater bekræfter, at TAP-deficiente tumorceller foreliggende Lass5 epitop for T-celle genkendelse. I modsætning til TAP-uafhængige Lass5 epitop præsentation, TAP-deficiente tumorceller var ude af stand til at præsentere TAP-afhængige og D

b-begrænset NP

366-374 epitop når celler blev inficeret med VV bærer NP

366-374 minigen (Fig.4 B højre).

For at afgøre, om CMT.TAP1 /B7.1, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p og CMT.64 /pp celler er i stand til at fremkalde Lass5 specifikke T-celler, blev cellerne injiceret ip i C57BL /6-mus, og IFN-γ secernerende splenocytter blev kvantificeret ved anvendelse af en ELISPOT-analyse. Som vist i fig. 4C, en stor stigning i antallet af Lass5 specifik IFN-y udskillende splenocytter blev observeret hos mus immuniseret med enten CMT.TAP1 /B7.1 eller CMT.B7.1 /p-celler sammenlignet med mus immuniseret med CMT.TAP1 /p eller CMT.64 /pp celler. Disse resultater viser, at TAP-negative og TAP1-udtrykkende tumorceller kan præsentere TAP-uafhængige antigener, herunder Lass5 antigen og at B7.1-ekspression i tumorcellerne giver bedre T-celle priming.

Immunisering med CMT. 64 celler inficeret med både VV-B7.1 og VV-TAP1 øger beskyttelsen af ​​mus mod tumorprovokation

en potentiel fremgangsmåde til mere pålidelige cancerimmunterapi er anvendelse af en viral-baserede gen-bærende vektor til at inficere celler for immunisering. Da immunisering med en høj dosis af B7.1 eller B7.1 + TAP1 transficerede celler dramatisk beskyttede mus mod tumor udfordring (Fig. 2C venstre), bestemmes vi hvis immunisering af mus med y-bestrålede CMT.64 celler inficeret med VV-B7 .1 + VV-CR19 (vildtypevirus) eller VV-B7.1 + VV-TAP1 har beskyttelse svarende til mus immuniseret med gen-transficerede tumorceller. Vi analyserede først B7.1 og TAP1 ekspression i CMT.64 celler inficeret natten over med VV-B7.1 + VV-CR19 eller VV-B7.1 + VV-TAP1. Vi observerede, B7.1 og TAP1 blev højt udtrykt i celler inficeret med relevante VVS (fig. 5A).

CMT.64 celler blev inficeret natten over med en kombination af to VVS på MOI på 3 for hver VV . A) B7.1-ekspression blev detekteret ved FACS-assay ved anvendelse af FITC-konjugeret B7.1-specifikke mAb 16-10A1. CMT.64 celler uden virusinfektion blev anvendt som en negativ kontrol. TAP1 ekspression blev påvist ved Western blot under anvendelse af et gede-anti-muse TAP1 polyklonalt Ab. RMA-S-celler blev anvendt som kontrol. B) Standard

analyser 51Cr-release blev udført for at opdage, hvis viralt inficerede tumorceller påvirket præsentation af endogene tumorantigener. CMT.64 tumorceller blev inficeret natten over med VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, eller VV-B7.1 + VV-TAP1, og anvendt som målceller. Kontrol cellelinjer var CMT.64, CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1. Tumor antigenspecifikke T-celler blev frembragt ved immunisering med y-bestrålede CMT.B7.1 /p-celler. Target og effektor-forholdet blev anvendt ved 1:100. a: CMT.64; b: CMT.B7.1 /p; c: CMT.TAP1 /B7.1; d: CMT.64 + VV-GFP + VV-GFP; e: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-GFP og f: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-TAP1. ** Angiver statistisk signifikans (P«0.05) ved anvendelse af ANOVA-analyse.

Vildtype VV infektion kan inhibere antigenpræsentation i dendritiske celler [20] og mindske inficeret celle levedygtighed. For at undgå disse virkninger, anvendte vi en rekombinant VV-GFP at erstatte vildtype-VV-CR19 for viral-baserede celle infektion og immunisering. Mus blev immuniseret i.p. med CMT.64 celler (5 x 10

6 celler /mus) inficeret med VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, eller VV-B7.1 + VV-TAP1, efterfulgt af udfordring med levende CMT.64 celler og overlevelse blev bestemt. Resultater er vist i tabel 1. Mus immuniseret med VV-B7.1 + VV-TAP1 inficerede CMT.64 celler viste en signifikant forøget overlevelsesrate sammenlignet med mus immuniseret med celler inficeret med VV-GFP + VV-GFP (kontrolmus ; P 0,05), mens der ikke blev observeret nogen forskel mellem kontrolmus og mus immuniseret med celler inficeret med VV-B7.1 + VV-GFP (P & 0,05). Disse resultater indikerer, at til immunisering med en viralt inficeret cellesystem, co-ekspression af B7.1 og TAP1 i celler er nødvendig for at forøge beskyttende anti-tumor-immunitet.

Da immunisering med celler der udtrykker B7. 1 alene viste forskellige beskyttende T-cellemedieret immunresponser mellem en viralt inficeret cellesystem og et gen-transficerede celle systemet i en dosis på 5 × 10

6 celler per mus immunisering vi spekuleret på, at viralt afledte antigener påvirker præsentationen af ​​TAP -uafhængige iboende tumorantigener, derved reducere kapaciteten af ​​tumorceller for T-celle priming. For at evaluere denne mulighed blev standard

51Cr-frigivelse assays udføres under anvendelse af cytolytiske T-celler frembragt ved immunisering med y-bestrålede CMT.B7.1 /p-celler (5 x 10

6 celler /mus). CMT.64 celler inficeret med VV-B7.1 + VV-TAP1, VV-B7.1 + VV-GFP eller VV-GFP + VV-GFP natten over blev anvendt som mål og VV-inficerede CMT.64, CMT.B7. 1 /p og CMT.TAP1 /B7.1-celler blev anvendt som kontroller. Som vist i fig. 5B, anerkendelse af viralt inficerede celler ved T-celler var signifikant reduceret i forhold til relevante kontroller.

Samlet set konkluderer vi, at en effektiv vaccination med virusinficerede TAP-negative celler kræver både B7.1 og TAP1 samarbejde ekspression i tumorcellerne.

Discussion

Denne undersøgelse viser, at B7.1 og TAP1 co-ekspression i TAP-negative CMT.64 celler gør tumorceller potente immunogener i stand til effektivt at inducere en CD8

+ T-cellemedieret immunrespons mod TAP-negative tumorer. Induceret CD8

+ T-celler sandsynligvis genkende TAP-uafhængige antigener præsenteret af TAP-deficiente tumorceller. Tre vigtige faktorer, TAP1, B7.1- og mængden af ​​antigen (er) synes at bidrage til CMT.64 tumorcelle priming af T-celler.

Vores resultater viser, at med en lav dosis af γ-bestrålede celle immunisering de TAP1 og B7.1 co-udtrykkende CMT.TAP1 /B7.1-celler genereret et antitumor immunrespons større end den induceret af TAP-negative og B7.1, der udtrykker CMT.B7.1 /p-celler (fig. 2C højre). Dette indikerer, at TAP1 udtryk spiller en afgørende rolle i at forbedre T-celle priming, som tyder på, at TAP1 udtryk kan lette en effektiv præsentation af TAP-uafhængig tumorantigener. Muligheden for effektiv præsentation af antigen (er) er støttet af fig. 5B (bane b og c), der viser, at CMT.B7.1 /p-induceret T-celler dræbt CMT.TAP1 /B7.1 mål ved bedre end CMT.B7.1 /p mål. En mulig mekanisme for øget antigen præsentation ved TAP1 er, at dens udtryk ‘støtter’ præsentation af nogle antigener (andre end ER-lumen-afledte antigener, som kan præsenteres af både TAP-negative og TAP1-positiv celler), som udtrykkes på cellen overflade til T-celle genkendelse og /eller T-celle priming. Denne mulighed understøttes af dokumentation for, at en vesikulær stomatitis-virus nukleocapsidprotein afledt epitop VSV-Np kan præsenteres

52-59, som er genereret i cytoplasmaet ved TAP1 udtrykke CMT.64 celler mere effektivt end TAP-negative CMT.64 celler [14]. Vores resultater fremhæve mangfoldighed af immunresponser mod tumorer, som er indbygget i det cellulære immunsystem. Betydningen af ​​disse resultater, bør undersøges nærmere, især til identifikation af TAP-uafhængige epitoper, som veldokumenteret og for karakteristika for epitop-specifikke T-celler.

B7.1 ekspression i tumorceller kan spille en rolle i faldende tærsklen for antigen-specifik T-celle-priming [21], [22], [23]. Denne mulighed understøttes af vores observation, at T-celle-medieret anti-CMT.64 tumorimmunitet kan forøges ved B7.1, der udtrykker tumorceller sammenlignet med B7.1 negative tumorceller (fig. 2C venstre). Mekanismer involveret i priming af T-celler mod CMT.64 tumorer ved B7.1 udtrykker TAP-deficiente celler kan være fortrinsvis gennem tumor direkte priming stedet for dendritiske celle (DC) krydspriming. Dette forklarer, hvorfor immunisering med B7.1, der udtrykker CMT.64 celler induceret et højt niveau af anti-CMT.64-tumor immunitet mens immunisering med B7.1-negative CMT.64 celler billede signifikant mindre immunitet. Krydspriming kræver professionel antigen-præsenterende DC’er at fange antigene proteiner fra apoptotiske celler og til at bearbejde og præsentere de genererede epitoper for T-celle priming i en TAP-afhængig måde [24]. Således kan TAP-uafhængige epitoper, der udtrykkes på CMT.64 cellerne ikke indgives på den DC overflade for T-celle priming, fordi disse epitoper svarer til peptiderne præsenteres på TAP-deficiente RMA-S-celler [25] generelt udviser lav evne til MHC-i-binding, og kan derfor ikke konkurrere med TAP-afhængige epitoper for MHC-i-binding og DC overflade-ekspression.

mængden af ​​antigen (er) anvendt til immunisering direkte påvirker styrken af ​​genererede antitumor immunitet som bekræftet af vores resultater med hensyn dosisafhængig immunisering med y-bestrålede celler (fig. 2C venstre og højre). Med en høj dosis celle immunisering blev stærkt beskyttende immunitet frembringes af både CMT.TAP1 /B7.1 og CMT.B7.1 /p-celler. Dette antyder, at både y-bestrålet cellelinjer leveret effektive mængder af TAP-uafhængige antigener til T-celle-induktion. Med en lav dosis immunisering, TAP1-positive CMT.TAP1 /B7.1-celler stimuleret immunsystemet til at generere beskyttende immunitet bedre end TAP-negative CMT.B7.1 /p-celler. Dette antyder, at TAP1 og B7.1 co-udtrykkende CMT.TAP1 /B7.1 celler giver TAP-uafhængige antigener til T-celle priming mere end der tilbydes af B7.1 udtrykker CMT.B7.1 /p celler.

En nylig rapport vist, at immunisering med B7.1-transficerede TAP 1-udtrykkende RMA-s-celler fremkaldte T-celle-baseret beskyttende immunitet mod RMA-s-celler [13]. Vores resultater viser endvidere, at immunisering med enten TAP 1-udtrykkende eller TAP-negative tumorceller, som udtrykker B7.1 kan fremkalde en effektiv T-cellemedieret immunrespons mod TAP-negative tumor udfordring. I en sådan beskyttende immunitet, CD8

+ T-celler spiller en stor rolle i svaret til TAP-negative tumorceller, mens CD4

+ T-celler haft en betydelig rolle. Da CMT.64 celler udtrykker ikke MHC klasse II-molekyler, en vigtig funktion af CD4

+ T-celler kan være at understøtte CD8

+ T-cellereaktioner på tumorceller [26], [27], [28