PLoS ONE: MACC-1 Fremmer Endothelium-Dependent angiogenese i Gastric Cancer ved Aktivering TWIST1 /VEGF-A Signal Pathway

Abstrakt

Endothel-afhængig angiogenese menes at være et afgørende skridt i udviklingen af ​​kræft. Vi har tidligere rapporteret, at metastase-associeret i tyktarmskræft-1 (MACC1) bidrog til vaskulogen mimicry i gastrisk cancer (GC), men det er stadig uvist, om MACC1 fremmer endotel-afhængig angiogenese af GC, og om TWIST1 er involveret i denne proces. I den foreliggende undersøgelse, detekteret vi MACC1 ekspression og mikrokar densitet (MVD) ved immunhistokemi i 159 patienter med trin I-III GC, og undersøgt den rolle, TWIST1 og vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGF-A) i MACC1-induceret endothelium- afhængig angiogenese ved anvendelse nøgne mus med GC xenotransplantater, og humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er), som blev co-dyrket med konditionerede medier fra overekspression og interferens MACC1 GC-celler. Vi fandt, at MACC1 udtryk var positivt korreleret med en øget MVD og tumor tilbagefald i GC patienter. Ved GC xenograftmodeller, MACC1 forhøjet MVD og opreguleres ekspressionen af ​​VEGF-A samt accelereret tumorvækst. Desuden MACC1 tydeligvis øget ekspression af TWIST1 og induceret rørlignende dannelse af HUVEC’er, hvorimod dæmpningen af ​​TWIST1 undertrykt proteinet ekspression af VEGF-A og ophævede effekten af ​​MACC1 på dannelse rør. Vores resultater belyse funktionen af ​​MACC1 i endotel-afhængig angiogenese af GC og foreslå potentielle prognostiske og terapeutiske værdi

Henvisning:. Wang L, Zhou R, Zhao Y, Dong S, Zhang J, Luo Y, et al. (2016) MACC-1 Fremmer Endothelium-Dependent angiogenese i Gastric Cancer ved Aktivering TWIST1 /VEGF-A Signal Pathway. PLoS ONE 11 (6): e0157137. doi: 10,1371 /journal.pone.0157137

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 8. februar 2016 Accepteret: 25. maj 2016 Udgivet: Juni 9, 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af National Natural Science Foundation for Unge Forskere i Kina (No.81302155), National Natural Science Foundation of China (nr 31271564), formand Foundation of Nanfang Hospital (No.2015B007), og nøglen Klinisk specielle Disciplin Construction Program Kina (til The Onkologisk afdeling, Nanfang Hospital)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at ingen eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

Kontinuerlig blodforsyning er nødvendige for en hurtig vækst af tumorer [1]. Udover den velundersøgte endotel-afhængig angiogenese, de seneste undersøgelser har afsløret flere nye mønstre herunder vaskulogene efterligning og mosaik fartøjer [2, 3]. Vi har tidligere rapporteret, at metastase-associerede i koloncancer-1 (MACC1) bidrog til vaskulogen mimicry (VM) i humant gastrisk cancer (GC) [4]. Men det er stadig uvist, om MACC1 er involveret i den sande endotel-afhængige angiogenese af GC.

MACC1, som en central regulator af hepatocytvækstfaktor (HGF) /c-Met /mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK ) signalvejen [5-7], fremmer proliferation, migration og invasion af GC celler [8], samt at påvirke tumor glycometabolismen [9] og mikromiljø [4, 10, 11], omsider forudsige dårlig klinisk resultat for GC-patienter [8]. Tidligere undersøgelser rapporterede, at flere regulatorer af VM [12, 13] deltog i angiogenese [14, 15]. Derfor vi stærkt spekulere at MACC1 spiller en vigtig rolle i endothelium-afhængig angiogenese af GC.

Det er rapporteret, at angiogenese er tæt forbundet med post-kirurgi tumortilbagevenden [16]. Men det er ikke klart, om kombinationen af ​​MACC1 og høj tæthed af mikrokardannelse (MVD) yderligere indflydelse sygdomsfri overlevelse (DFS) i GC patienter, eller den molekylære mekanisme MACC1-induceret angiogenese. I vores indledende undersøgelse viste vi, at TWIST1 var nødvendigt for MACC1-induceret VM i GC [4], mens TWIST1 fremmes ekspressionen vaskularisering af mammacancer [17, 18] og støttede vaskulær udvikling ved opregulering vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) – A [19], som er den første form af identificerede pro-angiogen faktor [20, 21]. Disse resultater antyder kraftigt, at TWIST1 /VEGF-A angiogen akse har en central rolle i endotel-afhængig angiogenese af tumorer. Vigtigt er det, de tidligere rapporter om analysen af ​​offentliggjorte microarray datasæt viste, at MACC1 mRNA-niveauer var signifikant korreleret med VEGF-A udtryk i GC væv (TCGA, n = 387, r = 0,224, P 0,001) (S1 Fig). Frem for alt er vi hypotesen, at MACC1 fremmer endothel-afhængig angiogenese via aktivering TWIST1 /VEGF-A signal- akse i GC.

I denne undersøgelse har vi undersøgt, om MACC1 var positivt associeret med endotel-afhængig angiogenese. Vi har detekteret om MACC1-positivt udtryk og høj MVD forudsagde korte DFS i patienter med GC efter radikal resektion. Derefter undersøgte vi rolle MACC1 i angiogenese in vivo og in vitro. Endelig har vi fastslået, om TWIST1 /VEGF-A angiogene akse repræsenterede den underliggende mekanisme af MACC1-induceret endotel-afhængig angiogenese.

Materialer og Metoder

Patienter og tumorvæv Prøver

paraffinindstøbte patologiske prøver blev indhentet fra 159 patienter med trin i-III GC, der undergik radikale kirurgisk resektion på Nanfang Hospital of Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina) mellem 2005 og 2010. Alle patienterne blev diagnosticeret efter 7 th edition American Blandede Udvalg foreslog om kræft Manual (AJCC) 2010 iscenesættelse system GC. Vi bekræftede, at alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og informeret samtykke blev opnået fra alle fag. Studieprotokollerne blev godkendt af de etiske komitéer på Nanfang Hospital og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

dyremodeller

Male NOD-SCID nøgne mus af 5 uger gamle blev opnået fra Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina). Stabil overekspression af MACC1 gen (oxMACC1) og vektor-kontrol celler eller dæmpning af MACC1 (shMACC1) og scramble-kontrol GC-celler (1 x 10

7 celler /mus, n = 6) blev injiceret subkutant i venstre og højre sider af ryggen som tidligere beskrevet [8]. Tumorknuder blev overvåget hver 3. dag ved caliper målinger af længden og bredden af ​​tumorerne. Tumorvolumener blev beregnet efter formlen: Volumen = bredde × længde × (bredde + længde) /2. Alle mus blev opstaldet i en SPF-facilitet i microisolator bure med fri adgang til autoklaveret mad og syrnet vand suppleret med sulfamethoxazol-trimethoprim. Alle dyreforsøg blev godkendt af Laboratory Animal Administration Komité Nanfang Hospital (Permit nummer: NFYY-2015-10) og i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af det amerikanske National Institutes of Health. Tumorer fik lov til at vokse til 0,5-1 cm i størrelse i den største dimension og blev høstet på dag 18, fordi enorme tumor volumen var tilbøjelig til central nekrose af tumorer, der ramte resultaterne i de følgende forsøg [8]. Derefter blev procedurer indsamling væv iværksættes efter dyr var blevet aflivet ved cervikal dislokation. Mus blev fjernet fra deres bure og forsigtigt behersket, mens de hviler på benchtop. Cervikal dislokation blev udført manuelt og resulterede i eutanasi inden for ca. 10 sekunder. De subkutane tumorer blev anvendt til immunhistokemisk (IHC) farvning.

human vaskulær endotelcelle Tube Formation Assay

HUVEC’er dannelse rør blev udført ved pipettering 200 pi Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ , USA) i hver brønd på 24-brønds plade, der derefter blev polymeriseret i 1 time ved 37 ° C. HUVEC’er (1 × 10

5) med 200 pi konditioneret medium blev tilsat til hver brønd og inkuberes i 12 timer. Billederne blev taget med et lyst-felt mikroskop ved en forstørrelse på 100 ×. Kapillarrørene blev kvantificeret ved at tælle det gennemsnitlige antal gennemførte tubulære strukturer i tre tilfældigt udvalgte felter.

cellelinier og cellekulturer Salg

OxMACC1 og shMACC1 gastrisk adenocarcinom cellelinier blev udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [8]. Celler blev holdt med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA), og 0,5 ug /ml puromycin [8]. Cellelinjer blev bekræftet af kort tandem repeat og genotypebestemmes på re-udvidelser, og blev udført med lave passage kulturer af disse bestande. HUVEC’er blev fremskaffet fra Yiyuan Biotechnology Company (Guangzhou, Kina), og dyrket i endotelcellevækst medier (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 0,1 mg /ml heparin og 20% ​​FBS (HyClone) ifølge leverandørens forslag. Til forsøg blev celler anvendt mellem 2 og 5 passager.

plasmider og celletransfektion

Humant TWIST1 blev amplificeret ved PCR og klonet i pcDNA3.1-vektoren (Primersekvenser i S1 tabel) ( Invitrogen), og det rekombinante plasmid pcDNA3.1 /TWIST1 blev konstrueret. Den silencing effektivitet af tre par TWIST1-specifik siRNA (Sigma, St. Louis, MO, USA) i ORF-regionen blev undersøgt ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR, Primersekvenser i S2 tabel). GC-celler blev transficeret med pcDNA3.1 /Twist1 og TWIST1-specifikke siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen).

Immunhistokemi Farvning

IHC-farvning blev udført ifølge standardprotokollen [8]. Snittene blev inkuberet med en række primære og sekundære antistoffer (S3 Table). Farvning scoringer blev evalueret af tre uafhængige bedømmere, og den halve kvantitative pointsystem blev bestemt som rapporteret andetsteds [8]. Kort fortalt, for MACC1 farvningsintensitet, snit blev scoret som 0 (negativ), 1 (svag), 2 (middel) eller 3 (intens). Mens farvningen udstrækning blev scoret efter området procenter: 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), eller 4 (76% -100%). Produkterne fra de farvning intensitet og omfang scoringer var den endelige farvning scores (0-12) for MACC1 udtryk. Tumorer af endelige farvning score ≥ 3 blev betragtet som positivt udtryk, fordi 95% af normale gastriske væv udtrykte lave MACC1 med en IHC score på 3 i vores indledende undersøgelse [8]. Vi definerede yderligere 3 ~ 7 så lav udtryk og 8 ~ 12 som høj ekspression for at udføre kvalitativ analyse.

mikrokar Density

MVD blev bestemt som beskrevet af Weidner et al. [22] . MVD blev vurderet i henhold til blodplade endotel celleadhæsionsmolekyle-1 (CD31) IHC farvning af tumor fartøjer. Sektionerne blev oprindeligt scannet ved lav effekt mål (forstørrelse 100 ×) for at vælge de mest vaskulariserede (hot-spots) områder. De mikrokarrene i hot-spots blev derefter talt ved en forstørrelse på 200 ×, og den gennemsnitlige fartøj tæller i seks hot-spots blev beregnet som MVD. Alle tællinger blev uafhængigt gennemgået af tre observatører, der var blindet til de tilsvarende clinicopathologic data. Den MVD blev klassificeret som enten høj (≥ 36,8) eller lav ( 36,8); 36,8 var medianværdien af ​​MVD.

enzymmaerket Assay

Koncentrationen af ​​TWIST1 og VEGF-A blev kvantificeret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig TWIST1 (Sandwich, Levetid Biosciences, CA, USA) og VEGF-A (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Elevation af MVD og VEGF-A er relateret med Tumor Gentagelse i GC Patienter

For at vurdere neovaskularisering indekset, MVD blev bestemt af IHC farvning af CD31 i 159 væv af patienter med trin i-III GC. Repræsentative eksempler på farvning med høje og lave forstørrelser blev angivet i fig 1A. Medianværdien af ​​MVD, defineret som afskæringsværdi, var 36,8. Vi definerede værdier højere end cut-off så højt MVD, ellers så lav MVD. Blandt de 159 GC patienter, 106 (66,7%) blev inddelt i MVD-høj gruppe og 53 (33,3%) blev inddelt i MVD-lav gruppe (figur 1A). Sammenhængen mellem MVD og de forskellige klinisk-patologiske parametre blev opført i S5 tabel. Vi fandt, at MVD-høj var hyppigere hos GC patienter med tilbagefald (P = 0,001, Fig 1C og 1D). Der var ingen signifikant sammenhæng med henvisning til køn, alder, histologisk differentiering kvalitet, dybde invasion (T stadier), lymfe metastaser (N stadier), og den samlede TNM stadier mellem to grupper. vores videre analyse viste dog, at MVD var højere i fase III end i både fase II (P = 0,009) og fase I (P = 0,007) (Fig 1F), mens dette ikke var tilfældet overvejer individuelle T eller N scenen.

(A) repræsentant immunfarvning af CD31 i GC væv. (B) Repræsentative billeder af VEGF-A farvet i humane GC væv. (C-E) Repræsentative fotomikrografier (C) og søjlediagram, som viser MVD (D) og VEGF-A udtryk (E) var højere i tilbagefald GC patienter end hos ikke-tilbagefald GC patienter. Scale bar = 50 um.

#P 0,01, n = 65 og n = 94 for ikke-gentagelse og gentagelse patienterne. (F 0,01 versus den tilsvarende kontrolgruppe, N.S., Ingen betydning; n = 26, n = 50 og n = 83 for fase I, II og III, henholdsvis.

Det er dokumenteret, at VEGF spiller en central rolle i at stimulere tumor blodkar dannelse og biologisk korrelater med MVD [20, 23]. VEGF-A blev den mest undersøgte af VEGF-familien [20, 21]. I betragtning af den vigtige rolle, som VEGF-A i tumorangiogenese gennemførte vi den immunfarvning i 159 GC væv (Fig 1B). Ifølge VEGF-A farvning scoringer blev patienterne inddelt i grupper af negative (score 0-2), lav (score 3-7) og høje udtryk (score 8-12). Der var 108 VEGF-A positive patienter, der fandt flertallet (positives 67,9% vs. negativer 32,1%). Blandt dem var 47 (29,6%) patienter defineret som lav udtryk, og 61 (38,4%) var så høj ekspression. Forholdet mellem VEGF-A udtryk og tilbagefald blev yderligere vurderet i GC. Som et resultat blev VEGF-A sig at være positivt korreleret med tumor gentagelse af GC patienter (P 0,001, Fig 1C og 1E). Desuden, selv om der ikke var nogen statistisk signifikant (P 0,05), VEGF-A udtryk tendens til at være højere i fase II-III end i fase I dømme fra box-plot (fig 1G), der foreslog en positiv regulatorisk rolle VEGF-A på MVD i GC progression.

MACC1 Positivt korrelerer med MVD og VEGF-A i human GC

for yderligere at præcisere, hvilken rolle MACC1 i neovaskularisering af GC, vi satte sig for at afgøre, om MACC1 var korreleret med MVD og angiogene faktor VEGF-A. Derefter blev IHC-farvning for at afsløre MACC1 ekspression i GC vævssnit (Fig 2A). Som angivet i fig 2B viste MACC1 højere ekspression i GC patienter med recidiv end dem uden. Især MACC1 var positivt korreleret med MVD (r = 0,258, P = 0,001, Fig 2C) og øget VEGF-A ekspressionsniveauet i GC væv (P = 0,008, Fig 2D). Heri disse resultater viste, at MACC1 korreleret med MVD og VEGF-A i human GC.

(A) Repræsentant MACC1 farvede billeder i GC væv. Scale bar = 50 um. (B) Hyppigheden af ​​negative, lav og høj MACC1 udtryk i GC patienter kategoriseret efter gentagelse. (C) MACC1 ekspressions scoringer var positivt korreleret med MVD (r = 0,258, P = 0,001, og n = 159). (D) VEGF-A var højere i MACC1 positivitet tumorer.

#P 0,01, n = 23 og n = 136 for MACC1-negative og MACC1-positive tumorer, hhv. MACC1 positivt udtryk inkluderet MACC1-lav og -high udtryk.

MACC1 og MVD Angiv Short DFS for GC Patienter

Ifølge den multivariate analyse ved hjælp af Cox modellen, MVD (P = 0,043, HR = 1,737) og overordnede TNM stadier (P 0.001, HR = 2,559) var uafhængige prognostiske parametre forudsige risikoen for recidiv efter radikal resektion i fase i-III patienter (S6 tabel). Kaplan-Meier overlevelseskurve blev plottet med tidligere nævnte prognostiske faktorer. Blandt de 159 patienter, 94 (59,1%), recidiverende og den mediane tid til tilbagefald var 27,0 måneder. DFS var væsentligt kortere hos patienter med fremskreden TNM stadie (P 0,001, figur 3A). Desuden er det ikke kun MACC1-positive eller MVD-high alene påvirket DFS kunne kombination af begge også forudsige den korte DFS i GC-patienter (Fig 3B-3D). Slående, den 3-årige DFS sats for kombinationen af ​​MACC1-positive og MVD-høje patienter var kun 34,5%, mens den var 55,3% for patienter med tumorer, der var MVD-lav og negativ for MACC1 (Fig 3D).

(A) Kaplan-Meier analyse af GC patienter DFS tid i undergrupper af fase i-III. (BD) Kaplan-Meier plot, der viser MACC1 positivt udtryk og forhøjet MVD angivet korte DFS af GC patienter kategoriseret efter MACC1 ekspression (B), MVD niveau (C) og ved en kombination af MACC1 positivitet og MVD-høj (D).

MACC1 Fremmer GC Endothel-Dependent angiogenese i vivo og in vitro

angiogenese er så vigtigt for tumorvækst. Oprindeligt testede vi, om ændring af MACC1 ekspression kan påvirke væksten af ​​tumor in vivo. Vi succes etableret BGC-823 cellelinier med oxMACC1 og shMACC1 som tidligere beskrevet [8], så celler blev injiceret subkutant i NOD-SCID nøgne mus (n = 6 /gruppe). Som et resultat (fig 4A og 4B), ektopisk ekspression af MACC1 lettet tumorigenese in vivo: den gennemsnitlige størrelse af de oxMACC1 tumorer var markant større end den for vektor-kontrol på dag 18, og shMACC1 injicerede mus viste signifikant minimal tumorvolumen. Som vist i fig 4C og 4D, ekspressionen af ​​VEGF-A blev øget væsentligt i de oxMACC1 grupper sammenlignet med vektoren-kontrolgrupperne (P = 0,007). I modsætning hertil VEGF-A score i shMACC1 grupperne var signifikant lavere end i de scramble-kontrolgrupperne (P 0,001). I begge cellelinjer, blev mængden af ​​MVD fundet at være fremmes af oxMACC1 og hæmmes af shMACC1 (P = 0,025 og P = 0,002, Fig 4C og 4E).

(A) Repræsentative billeder af subkutan implanteret overekspression af MACC1 (oxMACC1) og dæmpning af MACC1 (shMACC1) tumorer af GC xenotransplantater. (B) tumorvolumenet kurver for GC xenotransplantater på 18 dage efter inokulering. * P 0,05;

#P 0,01, n = 6. (C-E) Repræsentant immunfarvning af MACC1, VEGF-A, CD31 (C) og kvantificering (D 0,05;

#P 0,01, n = 6 vs. den tilsvarende kontrolgruppe. (F) Repræsentative billeder af dannelse rør i tredimensional kultur (venstre panel) og kvantificering (højre panel) af HUVEC’er behandlet med konditionerede medier fra BGC-823 eller MKN-28 GC-celler i 12 timer. WT, vildtype. V, vektor. Ox, oxMACC1. S, scramble. Sh, shMACC1. Scale bar = 50 um. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3.

For at bekræfte rolle MACC1 i angiogenese in vitro, vi brugte en veletableret tredimensionelle (3D) kultur model i indirekte co-kultur-systemet. Som vist i fig 4F, tætheden af ​​vaskulære rørlignende strukturer blev dramatisk forøget i HUVEC’er co-dyrket med konditionerede medier fra oxMACC1 BGC-823 og MKN28 celler (P = 0,05 og P = 0,003), mens der var væsentligt reduceret fra shMACC1 BGC-823 og MKN28 celler, sammenlignet med de tilsvarende vektor- og scramble-kontrol celler ved 12 timer (P = 0,006 og P = 0,02). Tilsammen disse resultater viste, at MACC1 accelererede tumorvækst og induceret endotel-afhængig angiogenese af GC.

MACC1 Fremmer angiogenese ved opregulering TWIST1 Expression

Vi har tidligere rapporteret, at TWIST1 var en afgørende faktor i MACC1 -inducerede VM of GC-celler. MACC1 kunne transkriptionelt opregulere TWIST1 [4]. Det fik os til at undersøge, om TWIST1 engageret i MACC1-induceret endotel-afhængig angiogenese af GC. Resultaterne viste i fig 5A og 5B foreslog, at ekspressionen af ​​TWIST1 naturligvis blev opreguleret i oxMACC1 GC cellelinier (P 0,001 og P = 0,024), men var signifikant nedreguleret i shMACC1 GC cellelinjer sammenlignet med de tilsvarende kontrolceller (P = 0,002 og P 0,001). Lignende konklusioner er nået i ELISA-assayet (S2 Fig). Dernæst detekteres vi proteinet ekspression af VEGF-A i to GC cellelinjer (Fig 5A og 5B), blev VEGF-A stærkt forøget ved MACC1 opregulering (P 0,001 og P = 0,008), men blev reduceret med shMACC1 (P = 0,039 og P = 0,041). Lignende resultater blev opnået ved ELISA-assayet (fig 5C og 5D). Desuden IHC farvning i subkutane tumorer med GC xenografter viste, at TWIST1 og VEGF-A var signifikant større for oxMACC1 celler versus vektor-kontrol, og blev markant nedsat for shMACC1 celler versus kapløbet-kontrol (P = 0,003 og P = 0,026, Figner 4C og 5E)

(A . B) Western blot analyse (øverste panel) og kvantificering (nederste panel) af MACC1, TWIST1, og VEGF-A udtryk som reaktion på overekspression eller dæmpning af MACC1 (oxMACC1 og shMACC1) i BGC-823 og MKN-28 GC-celler. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3. WT, vildtype. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (C 0,05;

#P 0,01, n = 3.

Indtil nu ser det ud til, at TWIST1 er involveret i MACC1-induceret endotel-afhængig angiogenese, så der kommer en anden mulighed:? Er TWIST1 nødvendigt angiogenese induceret af MACC1

TWIST1 er nødvendig for MACC1-induceret angiogenese i GC celler

for at bestemme om TWIST1 er vigtigt for MACC1-induceret angiogenese i GC, vi overudtrykt den ektopisk TWIST1 genet (oxTWIST1) i shMACC1 celler og bankede ned endogene TWIST1 (siTWIST1) i oxMACC1 celler. Tre uafhængige siRNA-konstruktioner mod Twist1 i ORF-regionen blev anvendt (S2 tabel). I mRNA-niveauer, alle de tre siTWIST1 held undertrykt TWIST1 ekspression og den mest effektive en blev anvendt til transfektion af GC-celler (S3 Fig). Effektiviteten af ​​overudtrykkende eller dæmpning blev verificeret ved QRT-PCR og Western blot.

Dernæst vi opdaget protein ekspressionsniveauet af VEGF-A ved Western blot i GC cellelinier. I begge cellelinier, blev ændringer i VEGF-A proteinekspression naturligvis forøget med oxTWIST1 (P = 0,015 og P = 0,02, Fig 6A), men der var signifikant reduceret med siTWIST1 (P = 0,022 og P = 0,01, Fig 6B). I røret dannelse assayet blev densiteten af ​​formationen rør fremmes af oxTWIST1 (P = 0,007 og P 0,001) og blev inhiberet af siTWIST1 (P 0,001 og P 0,001, figur 6C). Kollektivt resultaterne fra disse komplementære sæt af overekspression og knockdown forsøg viste, at TWIST1 var nødvendig og tilstrækkelig til at deltage i MACC1-induceret endotel-afhængig angiogenese, hvilket betyder, at MACC1 induceret angiogenese via aktivering af TWIST1 /VEGF-A angiogen akse i GC.

(A B) Western blot analyse (øverste panel) og kvantificering (nederste panel) af VEGF-A udtryk i nedregulering af MACC1 (shMACC1) GC celler, overeksprimeres TWIST1 (oxTWIST1) og overekspression af MACC1 (oxMACC1 ) GC celler, tavshed TWIST1 (siTWIST1). * P 0,05;

#P 0,01, n = 3. (C) Repræsentative mikrografier af vaskulær rørlignende formation i tredimensionale kulturer af HUVEC’er behandlet med supernatanterne af shMACC1 /oxTWIST1 eller oxMACC1 /siTWIST1, og med tilsvarende kontroller ved 12 timer. Scale bar = 50 um. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3 i hver gruppe.

Diskussion

Angiogenese menes at være et afgørende skridt i kræft progression, og flere undersøgelser har vist sine roller i aggressive maligniteter [24] . Trods at tidligere undersøgelser har fundet flere effektive regulerende faktorer fremmer endotel-afhængig angiogenese [14, 15, 18, 25], den potentielle rolle MACC1 i GC angiogenese fortsat ukendt. I denne undersøgelse har vi hovedsagelig undersøgt den rolle, MACC1 på endotel-afhængig angiogenese af GC. Resultaterne viste, at opregulering af MACC1 havde signifikant sammenhæng med højere MVD og VEGF-A ekspression i GC. Kombinationen af ​​MACC1 positivitet og høj MVD forudsagde korte DFS i GC patienter. fandt desuden, vi, at MACC1 øget ekspression af TWIST1 i GC cellelinjer og lettet rør dannelsen af ​​HUVEC’er. MACC1 ikke kun forhøjede VEGF-A-niveau in vitro, men også fremskyndet tumorvækst og inducerede mikrokardannelse in vivo. Derfor angår den foreliggende data fra vores undersøgelser viser, at MACC1 er et onkogent forstærker for endotel-afhængig angiogenese og tumorprogression i GC.

Vi har tidligere rapporteret, at MACC1 nedskrevet med metabolisk stress via AMP-aktiveret protein kinase (AMPK ) aktivering, og involveret i tumor energiomsætning ved at forbedre Warburg effekten [9]. MACC1 fremmes GC celleproliferation og invasion ved at inducere epitel-mesenkymale overgang (EMT) gennem aktivering af HGF /c-Met-signalvejen [8], og induceret VM dannelse af GC ved HGF /c-Met-TWIST1 /2-VELUX cadherin /VEGFR2 signalering akse [4]. Desuden er det blevet rapporteret, at MACC1 deltager i forskellige signalveje net, herunder Akt /β-catenin [26] og Ras /Erk [27], hvis aktivering blev også rapporteret at øge TWIST1 udtryk [28-30]. I bugspytkirtelkræft cellelinjer, har HGF /c-Met blevet viste at transmittere intracellulære signal via MAPK pathway [31], og er afgørende for at phosphorylere og stabilisere TWIST1 i brystkræft [28]. Vores tidligere undersøgelse forudsat den første bevis på, at MACC1 transkriptionelt opreguleret TWIST1. I mellemtiden viste vi, at HGF lettet nukleare translokation af MACC1 og opregulering af TWIST1 at fremme VM i GC, mens en c-Met-inhibitor antagoniserede denne proces [4]. Men [5], er endnu ikke blevet fundet, MACC1 som den centrale regulerende faktor for HGF /c-Met /MAPK signalvej dets forhold til TWIST1 i endothelium-afhængig angiogenese af GC. I den foreliggende undersøgelse, vores resultater vist, at MACC1 opreguleres TWIST1 ekspression og inducerede vaskulære rør-lignende formation i HUVEC’er. Derfor kunne MACC1 som en transkriptionel faktor transkriptionelt modulere endotel-afhængig angiogenese og mægle TWIST1 opregulering, som er ansvarlig for angiogenese og tumor progression af GC.

Til dato menes den dominerende rolle TWIST1 i tumor progression at inducere EMT [32]. Meget få undersøgelser afslørede, at TWIST1 fremmet endothel-afhængig angiogenese hos brystcancer [33] og i hepatocellulært carcinom [34] ved at rekruttere makrofager, ændring metalloproteinase 9 ekspression og aktiverende af VEGF-signalering [19]. For yderligere at undersøge om TWIST1 er også som en kritisk mediator i MACC1-induceret endotel-afhængig angiogenese i GC, identificerede vi, at ekspressionen af ​​TWIST1 blev øget betydeligt i tilstedeværelse af MACC1. Desuden tavshed TWIST1 stærkt undertrykt MACC1-medieret rør dannelsen af ​​HUVEC’er, tyder på, at TWIST1 er nødvendig for MACC1-medieret angiogenese af GC.

De mekanismer der ligger til grund VEGF-A-induceret angiogenese af kræftceller i både grundlæggende og kliniske undersøgelser forskning er blevet intensivt undersøgt [35-37]. Det er blevet foreslået, at VEGF-A fungerer som en omskifter til at fremme angiogenese [38]. Overensstemmelse med den kritiske rolle af VEGF-A i angiogenese, den foreliggende undersøgelse validerede at ekspressionen af ​​VEGF-A og MVD samt tumorvækst blev signifikant forøget i MACC1 overekspression GC-celler. Samlet indikerer disse resultater, at VEGF-A-signalvejen er involveret i MACC1 /TWIST1-induceret endotel-afhængig angiogenese af GC.

Konklusioner

Som konklusion vores undersøgelse billede både klinisk og eksperimentelt bevis for funktionen af ​​MACC1 i endotel-afhængig angiogenese af GC. Ektopisk ekspression af MACC1 fremmet tumorproliferation, signifikant opreguleret TWIST1 ekspression in vivo og inducerede vaskulære rør-lignende formation in vitro. Disse resultater viser, at MACC1 fremmer endotel-afhængig angiogenese i GC ved signalvejen vises i figur 7. Forstå, hvordan MACC1 er involveret i GC patogenese vil være nyttig for at udvikle potentielle terapeutiske mål i forvaltningen af ​​GC.

Opsummering diagram af denne undersøgelse, MACC1 overekspression i gastrisk cancer (GC) aktiverer TWIST1 angiogene akse, hvilket fører til opregulering af VEGF-A, og letter angiogenese. Derefter angiogenese fremmer GC cellevækst. * P