PLoS ONE: Promotor Methylering-medieret Silencing af β-Catenin Forbedrer invasiv af ikke-småcellet lungekræft og forudser Adverse Prognose

Abstrakt

β-Catenin spiller dobbeltrolle i vedhæftning kompleksdannelse og Wnt signalvejen. Selvom β-catenin-ekspression synes at være opreguleret og Wnt-signalering pathway aktiveres i størstedelen af ​​cancere, dets ekspressionsniveau synes at gå tabt i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Vi har tidligere rapporteret, at promotoren af ​​β-catenin blev hypermethyleret i to NSCLC cellelinier. I den aktuelle undersøgelse, vi udvidet vores analyse for status for methylering af β-catenin-promotorområdet og dens proteinekspression i syv NSCLC cellelinjer og en række af 143 tilfælde af primær human lungecancer med tilstødende ikke neoplastiske væv. Kvantitativ methylering specifik PCR (qMSP) analyse viste methylering af β-catenin promotorregion i fem NSCLC cellelinier, med øgede β-catenin-proteinniveauer ved 5′-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) behandling. status methyleringen i SPC (methyleret) og A549 (methyleret) blev bekræftet ved bisulfit sekventering PCR. 5-Aza-dC behandling hæmmede invasiv af SPC, men ikke A549. Immunofluorescens analyse viste membranøs β-catenin-ekspression tabt i produktresuméet og kunne genetableres med 5-aza-dC, mens Wnt3a behandling førte til nuklear translokation af β-catenin i både SPC og A549. Dual-luciferaseassays indikerede, at 5-aza-dC-behandling forårsagede ingen signifikant stigning i Wnt-signalering aktivitet sammenlignet med Wnt3a behandling. Virkningen af ​​demethylering middel i SPC kan vendes ved β-catenin udtømning, men ikke E-cadherin udtømning som indikerede, at methylering medierede β-catenin silencing kan forbedre NSCLC invasion og metastase i en E-cadherin uafhængig måde. Efterfølgende immunhistokemi resultater bekræftede yderligere, at β-catenin promotor hypermethylering korreleret med tab af immunoreaktivt protein ekspression, positive lymfeknudemetastaser, høj TNM stadie og dårlig prognose. Den foreliggende undersøgelse implicerer β-catenin-promotor hypermethylering i mekanismen for epigenetiske ændringer underliggende NSCLC metastase og progression, hvilket således indikerer potentialet i β-catenin som en ny epigenetisk mål for behandling af NSCLC-patienter

Henvisning:. Miao Y, Wang L, Zhang X, Xu X, Jiang G, Fan C, et al. (2014) Promotor Methylering-medieret Silencing af β-Catenin Forbedrer invasiv af ikke-småcellet lungekræft og forudser negative prognose. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10,1371 /journal.pone.0112258

Redaktør: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italien

Modtaget: 17. april, 2014 Accepteret: 9 okt 2014; Udgivet: November 14, 2014

Copyright: © 2014 Miao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.000.942 til Yuan Miao og nr 30.900.562 til Yang Liu) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er fortsat en stor klinisk udfordring på grund af dens dårlig prognose og begrænset behandlingsmuligheder [1]. Den høje dødelighed af lungekræft skyldes i høj grad svigt af tidlig diagnose og metastase hyppigt observeret på tidspunktet for diagnosen [2]. Analyse af de biologiske ændringer ligger til grund for patogenesen af ​​denne malignitet, identifikation i de tidlige stadier, og forebyggelse af metastaser, kan derfor være de primære muligheder for at forbedre den overordnede dystre prognose af denne kræftform.

Tumor invasion og metastaser opstår, når tumorceller få mulighed for at løsne sig fra den primære tumor og indgå omkringliggende væv eller lymphovascular kanaler, en proces, der er kritisk afhængig af afbrydelsen af ​​vedhæftning forbindelser mellem tumorceller [3]. β-Catenin er særlig interessant i denne proces, da det ikke kun deltager i denne adhæsion kompleks, men også en integreret del af Wnt signalvejen [4] – [6]. Et stort flertal af cancere herunder colorectal, hepatocellulær, skjoldbruskkirtel, og ovariecancere, harbor β-catenin mutationer og ændringer i andre gener, såsom APC-genet, hvilket fører til nuklear akkumulering af β-catenin og aktivering af Wnt signalvejen [ ,,,0],4], [7], [8]. tyder imidlertid på, at nuklear udtryk for β-catenin er sjælden og Wnt signalering aktivitet nedreguleres i lungekræft [5], [9] – [11]. Et stigende antal undersøgelser har beskrevet og analyseret sammenhængen mellem tab af β-catenin udtryk og klinisk-patologiske parametre i patienter med lungecancer [9], [11]. Ikke desto mindre er de underliggende mekanismer forbliver kontroversiel. En nylig rapport viste, at niveauet af β-catenin protein ikke var påvirket af E-cadherin udtømning [12]. Derfor skal der være andre mekanismer, der er ansvarlige for nedreguleret β-catenin udtryk i NSCLC.

Aberrant promotor methylering kan resultere i gendæmpning i forskellige maligne tumorer, herunder lungekræft [13], [14]. Selvom Wnt-signalering blev aktiveret og β-catenin-ekspression blev opreguleret i primær gastrisk karcinom, Ebert

et al.

Viste, at promotoren af ​​β-catenin blev hypermethyleret hvilket førte til tab af β-catenin ekspression i cellen linje stammer fra levermetastaser af mavekræft, men ikke de primære kræftformer [15]. Taget sammen, vi spekuleret på, at methylering af β-catenin promotorer kan spille en rolle i reguleringen af ​​invasivitet af cancerceller. Vores seneste rapport fandt, at hypermethylering af β-catenin promotorer blev set i to primære NSCLC cellelinier, som afveg fra den i gastrisk cancer [16]. Da aktiviteterne i Wnt signalvej var lavere i NSCLC end det, der i andre cancere, vi den hypotese, at hypermethylering af β-catenin promotorer i NSCLC kan forklare den høje metastase frekvens og dårlig prognose i NSCLC-patienter.

Her vi studerede effekten af ​​β-catenin promotor methylering statuson tumor progression og invasion, ved at udnytte både lungekræft cellelinjer og patienternes prøver som vores eksperimentelle modeller.

Materialer og metoder

Menneskelig vævsprøver og cellelinjer

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af den institutionelle gennemgang bord på China Medical University (Shenyang, Kina). Skriftligt samtykke blev givet af deltagerne for deres oplysninger, der skal lagres i databasen i deres enheder, der skal anvendes i denne undersøgelse hospital. Alle kliniske undersøgelse er blevet udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Et hundrede og fyrre-tre tilfælde af primære humane lungecancer med tilsvarende tilstødende ikke-neoplastiske væv, som gennemgik kirurgisk resektion med helbredende hensigt, blev indsamlet fra First Affiliated Hospital i Kina Medical University mellem oktober 2004 og juli 2006. Patienternes overlevelse blev defineret som tiden fra operationsdagen til slutningen af ​​opfølgningen eller dag for død på grund af tilbagefald eller metastaser. Ingen af ​​patienterne modtog strålebehandling eller kemoterapi før kirurgisk resektion, og alle patienter fik rutinemæssig kemoterapi efter operationen. Undersøgelsen patientpopulation er rapporteret i vores tidligere litteratur [17]. Den histologiske diagnose og differentiering klasse blev evalueret i hæmatoxylin og eosin farvede snit, ifølge retningslinjer [18] fra 2004 WHO klassificering. Alle 143 prøver blev revurderet med hensyn til den histologiske subtype, differentiering og tumor fase. Tumor iscenesættelse blev bestemt i henhold til den syvende udgave af Den Internationale Union mod Kræft (UICC) TNM for lungekræft [19]. Prøverne omfattede 44 tilfælde af planocellulært lungecarcinom og 99 tilfælde af lunge adenocarcinom. Enoghalvtreds tumorer blev stærkt differentierede og 92 tumorer blev moderat eller dårligt differentieret. Lymfeknudemetastaser var til stede i 70 tilfælde og fraværende i 73 tilfælde. Tumorerne omfattede 81 tilfælde af fase I-II sygdom og 62 tilfælde af fase III

A-III

B sygdom.

Seven NSCLC cellelinjer, der almindeligvis anvendes i vores laboratorium, blev udvalgt til celle eksperimenter. De HBE, A549 og H1299 cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), blev SPC-A-1 (SPC), og LTEP-A-2 (LTE) cellelinier fås fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina). Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), og 100 pg /ml streptomycin ( Sigma). Cellerne blev dyrket i sterile petriskåle og passeret hver 2 dage under anvendelse af 0,25% trypsin (Invitrogen).

DNA ekstraktion og kvantitativ real-time methyleringsspecifik polymerasekædereaktion

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellelinjer og 10-um-tykke sektioner af 10% neutral formalin-fikserede, paraffinindlejrede tumor- vævsblokke ved hjælp QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA blev behandlet med natriumbisulfit ved anvendelse af en EZ DNA-methylering kit (D5005, Zymo Research, Orange, CA, USA). Methylering realtids-polymerasekædereaktion (PCR) blev udført i ABI 7900HT Hurtig Real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primerpar var som følger: β-catenin fremad, 5′-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 ‘og revers, 5′-TCCCCTATCCCAAACCCG-3′, med TaqMan probe 5’-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 ‘; p-actin fremad, 5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ‘og revers, 5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′, med TaqMan probe 5’-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 ‘. Husholdning β-actin gen (ACTB) blev anvendt til at normalisere en methylering uafhængig kontrol reaktion. For relativ kvantificering, blev mængder af den methylerede DNA (procentdel af methyleret reference) ved en β-catenin promotorregion normaliseret til methylering værdi kalibratoren, som blev defineret som 100%. Universal methyleret DNA (QIAGEN) blev anvendt som kalibratoren. Procentdelen af ​​methyleret henvisning blev defineret som 100 X 2

(sampleACTB (ct) – sampleβ-catenin (ct)) /2

(calibratorACTB (ct) – calibratorβ-catenin (ct)) [20]. For at skelne mellem de enkelte methylering niveauer blev en cutoff værdi på 4% eller mere defineret som “methylerede” og en cutoff-værdi på mindre end 4% som “ikke-methylerede” baseret på en tidligere undersøgelse [21].

Bisulfite sekventering PCR (BSP) af β-catenin initiativtagere

Vi brugte Methyl Primer Express v1.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) til at analysere

CTNNB1

genpromotorregion -1,124-11,114 bp. DNA fra lungecancerceller blev ekstraheret og derefter behandlet med natriumbisulfit ved anvendelse af en EZ DNA-methylering kit (Zymo Research) ifølge producentens instruktioner. De β-catenin promotor–specifikke primere til bisulfit sekventering blev konstrueret ved anvendelse promotorsekvens data og primer design software (Primer Premier 5; Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA); primersekvenserne er vist i tabel 1. Primerne blev designet til at opformere et CpG-rig region af promotoren spanning 189 bindingssteder for CpG (19 CpGCpG sites). PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af multifunktionelle DNA oprensning ekstraktion kit (DP1501, BioTeke Corporation, Beijing, Kina) og ligeret ind i Pum-T enkel vektor (DP6803, BioTeke Corporation, Beijing, Kina), og mindst fem separate kloner blev hver valgt til sekvensanalyse af BiQ Analyzer.

Behandling med 5-aza-dC og Wnt3a

dyrkede lunge cancer celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) (Sigma) opløst i dyrkningsmedium hver 24 timer. Med q-MSP og MTT-assays, blev lægemidlet koncentration, der kræves for β-catenin-promotoren CpG island demethylering uden nogen signifikant virkning på cellevækst valgt (7 pM), og celler blev opsamlet efter fortsat dyrkning i 48 timer (Figur S1).

Cellerne blev behandlet med 500 ng /ml rekombinant Wnt3a (R Santa Cruz Biotechnology), β-catenin (610.154, 1: 500; BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA ) eller GAPDH (sc-365.062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Efter inkubation med peroxidase koblet anti-mus IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer, blev bundne proteiner visualiseret under anvendelse af ECL (Pierce) og påvist under anvendelse Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative proteinniveauer blev beregnet på grundlag af GAPDH protein som en loading kontrol.

Matrigel invasion assay.

celleinvasion assays blev udført under anvendelse af en 24-brønds transwell kammer med en porestørrelse på 8 um (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, USA), og inserterne blev overtrukket med 20 ul Matrigel (1:03 fortynding, BD Biosciences). Derefter 48 timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og overført til den øvre Matrigel kammer i 100 pi serumfrit medium indeholdende 3 × 10

5-celler og inkuberet i 16 timer. Medium suppleret med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer som kemoattraktant. Antallet af indtrængende celler blev talt i 10 tilfældigt udvalgte høj effekt mikroskopfelter. Forsøgene blev udført in triplo.

immunfluorescensfarvning.

Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd, blokeret med 1% BSA og derefter inkuberet med β-catenin monoklonalt antistof (610.154, 1 : 400; BD Transduction Laboratories) natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubation med fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugerede sekundære antistoffer (1: 200, Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) ved 37 ° C. Kernerne blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Epifluorescens mikroskopi blev udført ved anvendelse af et omvendt Nikon TE300-mikroskop (Melville, NY, USA) og konfokal mikroskopi blev udført ved anvendelse af en Radiance 2000 laser scanning konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Dual-luciferase assays.

Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Celler blev udpladet i 24-brønds plader i 24 timer før transfektion med pGL3-OT eller pGL3-AF (0,5 mg) reportergen plasmider, sammen med kontrolgruppen plasmid pRL-TK (50 ng). Efter inkubering i 30 timer ved 37 ° C blev reportergenekspression detekteres af Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). TCF-medieret gentranskription blev bestemt ved forholdet mellem pGL3-OT til pGL3-luciferaseaktivitet, som blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet fra kontrolområdet plasmidet pRL-TK. Alle forsøg blev udført i to eksemplarer, et minimum af tre gange. For at analysere effekten af ​​5-aza-DC og β-catenin siRNA om Wnt signalering, blev 5-aza-dC tilføjet og β-catenin siRNA var cotransficeret med pGL3-OT eller pGL3-AF til luciferaseassays.

Immunhistokemi (IHC)

Immunohistokemisk analyse af β-catenin-ekspression blev udført under anvendelse af en β-catenin-specifikt monoklonalt antistof (610.154, 1: 200; BD Transduction Laboratories) som tidligere beskrevet og blev evalueret i henhold til vores tidligere rapport [17], [22].

Statistisk analyse.

SPSS-version 13.0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) blev anvendt til alle analyser. Chi-square og Spearmans korrelation tests blev anvendt til at undersøge mulige korrelationer af β-catenin status methylering i NSCLC med dets status methylering i tilstødende normale lungevæv og clinicopathologic faktorer. Mann-Whitney U-test blev anvendt til at analysere resultaterne af q-MSP, Western blot, Matrigel invasive assays og Dual-luciferaseassays. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere sandsynligheden for patientens overlevelse, og forskelle i overlevelse undergrupper af patienter blev sammenlignet ved anvendelse Mantel log-rank test. Data blev præsenteret som gennemsnit af eksperimenter udført i triplikat.

P

. 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikante forskelle

Resultater

Analyse af status for methylering af promotorregionen af ​​β-catenin-genet i lungecancerceller

β-catenin-promotor methylering niveauer blev testet i lungekræft cellelinier. Som vist i figur 1A, fem cellelinier (LH7, BE1, SPC, LTE og H1299) udviste høje niveauer af methylering, mens to cellelinier (HBE og A549) var umethyleret. Analyse af CTNNB1 genpromotorregion -1124 – 11.114 bp i NSCLC cellelinier afslørede tilstedeværelsen af ​​to CpG-øer i positionerne -1,124 – 876 og 10,676 – 11.114 hhv. Disse sekvenser indeholdt 189 enkelt CG sites, hvoraf 19 var CG-dinucleotider. Brug af natriumbisulfit genomisk sekventering metode, vi designet primere til at analysere de første CpG-øer i en 1.331 basepar region (-614-717) indeholdende en del af β-catenin promotorregion over dens transkriptionelle startsted i SPC og A549-cellelinier . Flere methylering sites blev identificeret i SPC celler, hvorimod der ikke blev observeret kun få 5-methylcytosin-rester i flere sekventerede kloner afledt af A549 celler (Fig. 1B og 1C).

(A) Kvantitativ MSP analyse af β catenin promotorregion i NSCLC-cellelinier. (B) promotorregionen af ​​β-catenin-gen: Placering af CpG-øer og primer design er angivet med linierne og pilene. (C) Methylering af en af ​​de 19 CG-dinukleotider i område -614 bp til -270 bp af både A549 og SPC. Udfyldte cirkler repræsenterer denatureret CG sites, ubesatte cirkler repræsenterer umethylerede CG sites.

Behandling af celler med 5-aza-dC restaureret β-catenin udtryk og hæmmede lungekræft celle invasiv gennem genindførelse membranøs β-catenin ekspression snarere end ved aktivering af Wnt signalvejen

den kemiske 5-aza-dC har været anvendt både in vitro og in vivo for at inhibere DNA-methylering. I denne undersøgelse blev alle syv cellelinjer (HBE, LH7, BE1, SPC, A549, LTE og H1299) behandlet med 5-aza-dC (fig. 2A, 2B). Ekspression af β-catenin blev restaureret i de fem cellelinier (LH7, BE1, SPC, LTE og H1299), hvor β-catenin-promotor methylering tidligere var blevet bekræftet. Imidlertid blev ingen signifikante ændringer ses i HBE og A549 cellelinier (umethylerede). Vi undersøgt yderligere effekten af ​​5-aza-dC behandling på invasionen kapacitet lunge cellelinier. Som vist i figurerne 2C og 2D, 5-aza-dC behandling resulterede i markant hæmning af invasivitet i SPC-celler, mens der ikke var nogen målelig virkning i A549-celler (se figur S2 for Matrigel resultater i andre cellelinjer). Efterfølgende blev evnen af ​​5-aza-dC at aktivere Wnt signalvejen undersøgt under anvendelse Wnt3a protein-simuleret celler som en positiv kontrol. Sammenlignet med Wnt3a-behandlede celler, afslørede dual-luciferaseassays at 5-aza-dC behandling resulterede i ingen signifikante ændringer i Wnt signaling aktiviteter (fig. 2e). Immunofluorescensanalyse viste, at behandling med 5-aza-dC restaureret membranøs β-catenin-ekspression i SPC, men ikke A549-celler. Endvidere blev β-catenin udtryk påvist i kernen i Wnt3a-behandlede celler, hvorimod blev en membranøs fordeling observeret i ubehandlede celler (fig. 2F). Taget sammen foreslår disse data, at i modsætning til andre carcinomer, methylering af β-catenin-promotoren var et almindeligt fænomen i NSCLC, og kan være ansvarlig for nedregulering af β-catenin ekspressionsforstærkende invasivitet af lungecancer celle.

(A) Protein niveauer af β-catenin efter 5-aza-dC behandling (7 pM) i NSCLC-cellelinier. (B) Kvantificering af proteinekspression efter 5-aza-dC behandling. (C) Repræsentative billeder af celler på bunden af ​​Transwell membraner viser ændringerne i invasive celleantal (× 400, Scale bar = 50 um). (D) Antal celler invaderer på den nedre overflade af filtret blev målt, hver udført in triplo. (Bars repræsenterer SD *

P

. 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). (E) Dual-Luciferase Assay resultater viser, at 5-aza-dC behandling resulterede i ingen signifikante ændringer i Wnt signalering aktiviteter sammenlignet med Wnt3a behandlede celler. Hver af forsøgene blev gentaget tre gange. (D) immunfluorescensfarvning viser, at β-catenin er primært lokaliseret på membranen i SPC og A549-cellelinier. Behandling med 5-aza-dC ændrede mængder af membranøs β-catenin udtryk. Imidlertid blev β-catenin translokeres til kernen efter Wnt3a behandling (Scale bar = 20 um, β-catenin antistof blev erstattet af normalt muse-IgG som en negativ kontrol).

5-Aza-dC behandling restaureret β-catenin-ekspression i en E-cadherin uafhængig måde

for yderligere at bekræfte funktionen af ​​promotoren methylering af β-catenin, blev β-catenin-specifikt siRNA indført i SPC og A549-celler. Sammenlignet med celler transficeret med kontrol scrambled siRNA, udviste celler transficeret med β-catenin siRNA reduceret β-catenin og E-cadherin ekspression, som ikke kan genoprettes ved 5-aza-dC behandling (fig. 3A, B). Dernæst vi slået ned E-cadherin med E-cadherin-specifikt siRNA i disse to cellelinier. E-cadherin ekspression blev reduceret i både SPC og A549 celler, mens β-catenin udtryk ikke var synligt reduceret med E-cadherin udtømning sammenlignet med kontrolgruppen. Med 5-aza-dC behandling blev β-catenin-ekspression signifikant opreguleret i SPC-celler uanset ekspressionen af ​​E-cadherin (fig. 3C, D). Vi undersøgt yderligere effekten af ​​5-aza-dC behandling, når den indføres med β-catenin-siRNA og E-cadherin-siRNA på invasionen kapacitet lunge cellelinier. Som vist i figurerne 3E og 3F, enten β-catenin eller E-cadherin udtømning førte til en betydelig stigning i den invasive kapacitet både SPC og A549-celler. Ved 5-aza-dC behandling, blev antallet af de migrerende celler faldt betydeligt i E-cadherin-udtømte SPC celler, som ikke blev observeret i A549 celler. Imidlertid blev de invasive kapacitet β-catenin-udtømte celler SPC og A549 ikke åbenbart hæmmet af 5-aza-dC behandling. Desuden afslørede dual-luciferase assays, at hverken 5-aza-dC behandling eller β-catenin-udtømning resulteret i væsentlige ændringer i Wnt signalering aktiviteter sammenlignet med Wnt3a-behandlede celler (Fig. 3G). Følgelig inhibering af β-catenin-ekspression med dets promotor methylering synes at nedregulering invasiviteten af ​​lungecancer celle i en E-cadherin uafhængig måde. Immunfluorescensfarvning viste, at den membranøs β-catenin forstærkes af 5-aza-dC behandling kun i SPC-cellelinie, men ikke i A549-cellelinje. Udtømning af β-catenin dæmper membranøs β-catenin i begge SPC og A549-cellelinier, men udtømning af E-cadherin har ingen effekt på membranøs ekspression af β-catenin i enten SPC eller A549-cellelinje. Behandling med 5-aza-dC ændret lidt mængderne af membranøs β-catenin udtryk efter β-catenin eller E-cadherin udtømning i SPC cellelinie, men ikke i A549-cellelinje.

Efter knockdown af β-catenin ( A) eller E-cadherin (C), protein ekspression af SPC og A549-cellelinier blev undersøgt 48 timer efter 5-aza-dC behandling under anvendelse af de viste antistoffer. (B, D) Grafer viser kvantificering af protein ekspression efter 5-aza-dC behandling og siRNA transfektion. GAPDH blev anvendt som kontrol. (E) Repræsentative billeder af celler på bunden af ​​Transwell membraner viser ændringerne i invasive celleantal (× 400, Scale bar = 50 um). (F) Antal celler invaderer på den nedre overflade af filtret blev målt, hver udført in triplo. (Bars repræsenterer SD *

P

. 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). (G) Dual-luciferase assay resultater viser, at både 5-aza-dC behandling og β-catenin udtømning medførte ingen væsentlige ændringer i Wnt signalering aktiviteter sammenlignet med Wnt3a behandlede celler. Hver af forsøgene blev gentaget tre gange. (H) immunfluorescensfarvning viser, at membranøs β-catenin forstærkes af 5-aza-dC behandling kun i SPC-cellelinie, men ikke i A549-cellelinje. Udtømning af β-catenin dæmper membranøs β-catenin i begge SPC og A549-cellelinier, men udtømning af E-cadherin har ingen effekt på membranøs ekspression af β-catenin i enten SPC eller A549-cellelinje. Behandling med 5-aza-dC lidt ændret mængderne af membranøs β-catenin-ekspression efter β-catenin eller E-cadherin udtømning i SPC-cellelinie, men ikke i A549-cellelinje. (Scale bar = 20 um, blev β-cateninantistof erstattet af normal mus IgG som en negativ kontrol).

Hypermethylering af β-catenin promotor korreleret med dets tab af membranøs udtryk i NSCLC prøve

Derefter undersøgte vi, status for methylering af β-catenin-promotoren i prøver kliniske væv. p-catenin blev hovedsageligt udtrykt på cellemembranen i normal lunge vævsprøver (83,9%, 120/143;. figur 4A) med reduceret membranøs ekspression i NSCLC væv (18,9%; 27/143;. figur 4B, C). Efterfølgende blev β-catenin promotor- methylering niveauer kvantificeres ved realtid methyleringsspecifik PCR. Ved hjælp af en hypermethylering-værdi på mere end 4% som et cutoff, hypermethylering af β-catenin (gennemsnit ± SD, 8,60% ± 11.41%; range, 0-100%) blev fundet i 74 (51,7%) af de 143 NSCLC prøver, hvilket var betydeligt højere end i det tilstødende normale lungevæv (13,3%, 19/143, gennemsnit ± SD, 2,66% ± 2,63%, interval, 0-100%;

P

0,001;. fig 4D ). Tilsammen vores undersøgelse antydede, at β-catenin methylering signifikant korreleret med tab af membranøs β-catenin-ekspression (

P

= 0,001).

(A) β-catenin-ekspression i normale lunge epitel med stærk membranøs farvning. Membranøs β-catenin-ekspression blev tabt i lunge pladecellecarcinom (B) og lunge adenocarcinom (C). Scale bar = 20 um. (D) Kvantitative methylering resultater af q-MFP. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. Mann-Whitney U-test blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans. **

P

0,001. (E) overlevelseskurverne for patienter med eller uden β-catenin-promotor-methylering. Mantel log-rank test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans.

Korrelationen mellem β-catenin promotor methylering og klinisk-patologiske faktorer

Kliniske og patologiske karakteristika hos patienter med NSCLC blev analyseret i henhold til deres status for methylering. Som vist i tabel 2, β-catenin hypermethylering positivt korreleret med lymfeknudemetastaser og TNM fase i de 143 tilfælde af NSCLC (

P

= 0,001 og

P

= 0,046, henholdsvis). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem β-catenin methylering og køn, alder, histologisk type, eller differentiering i NSCLC. Kaplan-Meier test afslørede, at den samlede overlevelsestid for NSCLC-patienter var kortere hos patienter med β-catenin-methylerede tumorer end i dem med β-catenin-methyleret tumorer (

P

0,001, Fig. 4E).

diskussion

β-catenin som en vigtig del af både adherensovergange og Wnt signalvejen, mentes at være omplantes til kernen ved sin exon mutation og /eller APC mutationen i forskellige tumortype undtagen lungekræft [4], [7], [8]. Men akkumulerede vidnesbyrd viser, at i lungekræft, er β-catenin tabt og Wnt-signaleringsaktivitet nedreguleres. Den underliggende mekanisme er stadig unelucidated [5], [9] – [11]. Vores seneste undersøgelse viste, at promotoren for β-catenin gen altid blev methyleret i lungekræft-cellelinjer [16]. For at klarlægge funktioner β-catenin i NSCLC, vi udvidet vores undersøgelse af status promotor methylering på syv lungekræft-cellelinjer. Vi fandt, at demethylering agent 5-aza-dC restaureret β-catenin-proteinniveauer i fem ud af syv cellelinier, som var blevet bekræftet at være methyleret i den foreliggende undersøgelse. Blandt disse blev status methylering af SPC og A549 bekræftes yderligere af bisulfit genomisk sekventering. Det er velkendt, at optagelse af β-catenin til kernen kunne øge Wnt signalering aktivitet og dermed fremme invasiv af flere menneskelige kræftformer. Imidlertid blev β-catenin-ekspression tabt i fjerne metastaser af gastrisk karcinom og tabet af β-catenin-ekspression kan skyldes hypermethylering af β-catenin-promotor, trods at β-catenin-ekspression blev opreguleret og Wnt signalvejen blev aktiveret i de fleste af de primære gastrisk cancer [15]. Vi spekuleret på, at tabet af β-catenin kan udløse andre signaleringskaskade (er) stærkere end Wnt signalering aktivering ved styring af invasivitet af cancerceller. Da lungekræft viser lavere baseline af Wnt signalering aktivitet end mavekræft, kan den vigtigste mekanisme til at regulere invasiv være uafhængig af Wnt signalvej. aktivering af Wnt signalvejen, invasionen kapacitet og subcelluar fordeling af β-catenin i lunge cellelinier. Resultaterne indikerede, at demethylering med 5-aza-dC kunne restaureret β-catenin-ekspression og inhiberede lungecancer celle invasionsevne gennem genindførelse membranøs β-catenin-ekspression, snarere end af aktivering af Wnt signalvejen. Den foreliggende undersøgelse tilbudt en ny forklaring på, hvorfor β-catenin-ekspression nedreguleret i NSCLC og indikerede, at promotor methylering af β-catenin kan regulere invasiv gennem en sti uafhængig af Wnt signalering i lunge kræftceller. Som catenins sammen med cadheriner og dannede adherensovergange, vores resultater viste, at tab af β-catenin-ekspression kan tilintetgøre adherensovergange af dets reducerede membranøs ekspression.

E-cadherin spiller en afgørende rolle i adherensovergange. Gennem sin intracellulære domæne, blev E-cadherin forbundet med β-catenin. Selv om methylering af E-cadherin genet methylering blev fundet i forskellige cancerformer, er det stadig kontroversiel som for i lungecancer [23] – [25]. Russo

et al

.