PLoS ONE: 15-lipoxygenase metabolitter af docosahexaensyre Inhibit prostatakræft Cell Proliferation og Survival

Abstrakt

En 15-LOX, foreslås det, undertrykker væksten af ​​prostatakræft delvist ved at konvertere arachidonsyre, eicosatrienoic, og /eller eicosapentaensyrer til N-6 hydroxymetabolitter. Disse metabolitter hæmmer proliferation af PC3, LNCaP, og DU145 prostatacancerceller men kun ved ≥1-10 uM. Vi viser her, at de 15-LOX-metabolitter af docosahexaensyre (DHA), 17-hydroperoxy-, 17-hydroxy-, 10,17-dihydroxy-, og 7,17-dihydroxy-DHA inhiberer proliferationen af ​​disse celler ved ≥0.001 , 0,01, 1 og 1 uM. Til sammenligning er den tilsvarende 15-hydroperoxy, 15-hydroxy, 8,15-dihydroxy, og 5,15-dihydroxy metabolitter af arachidonsyre samt DHA selv kræve ≥10-100 uM til at gøre dette. Ligesom DHA, DHA metabolitter a) inducerer PC3-celler for at aktivere en peroxisomproliferatoraktiveret receptor-γ (PPARy) reporter, ekspres syndecan-1, og blive apoptotisk og b) er blokeret fra aftagende celleproliferation med farmakologisk inhibering eller knockdown af PPARy eller syndecan-1. DHA metabolitter således langsom prostatacancer celleproliferation ved at engagere PPARy /syndecan-1-vejen af ​​apoptose og derved kan bidrage til prostata cancer-undertrykkende virkninger af ikke kun 15-LOX men også kosten DHA

Henvisning.: O’Flaherty JT, Hu Y, Wooten RE, Horita DA, Samuel MP, Thomas MJ, et al. (2012) 15-lipoxygenase metabolitter af docosahexaensyre Inhibit prostatakræft Cell Proliferation og overlevelse. PLoS ONE 7 (9): e45480. doi: 10,1371 /journal.pone.0045480

Redaktør: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, Brasilien

Modtaget: Marts 12, 2012; Accepteret: August 20, 2012; Udgivet: 20 September, 2012

Copyright: © O’Flaherty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud PO1CA106742 (JTO, YH og Ije), RO1CA115958 (Ije), RO1AI064609 (DAH) og center Grant NIH CA1207 (MJT) og to golfspillere ‘Against Cancer tilskud (JTo). National Science Foundation tilskud BIR-9414018 forudsat midlerne til at købe massespektrometer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

metabolismen af ​​kosten fedtsyrer er af særlig interesse i prostatacancer, den hyppigst diagnosticerede cancer og en førende dødsårsag i amerikanske mænd. Epidemiologiske undersøgelser antyder, at indtag af n-3 marine polyumættede fedtsyrer (PUFA), eicosapentaensyre (EPA, 20:05, n-3) og docosahexaensyre (DHA, 22:06, n-3) reducerer risikoen for prostatacancer [ ,,,0],1], [2]. Desuden blev vævsniveauer af n-3 PUFA omvendt associeret med prostatacancer progression [3], [4], [5]. Desuden har cellekultur og dyremodeller vist, at n-3 PUFA er beskyttende henviser n-6 PUFA fremme denne kræft [6], [7], [8]. PUFA inkorporeres i celle membranphospholipider og er substrater for oxygenase (cyclooxygenase og lipoxygenase) enzymer, der skal metaboliseres til bioaktive lipider. En foreslået mekanisme for det tumor-inhiberende aktivitet af n-3 PUFA er kompetitiv hæmning af de oxygenaser anvendes af n-6 PUFA for at danne tumorfremmende metabolitter (gennemgået i [9], [10]). Vore undersøgelser [11], [12] og andres [6], [13] har vist, at DHA er en stærk hæmmer af prostatakræft cellevækst, en egenskab, der reguleres af en 15-lipoxygenase (15-LOX) ( upublicerede studier).

Tidligere undersøgelser har vist, at to isoformer af 15-LOX identificeret hos mennesker kan spille modsatrettede roller i udviklingen og progressionen af ​​prostatakræft gennem metabolisme af n-6 PUFA. 15-LOX-1 er mere stærkt udtrykt i ondartet end almindelig human prostata væv og dets niveauer korrelerer positivt med sygdommens sværhedsgrad [14], [15], [16]. Den foretrækker linolsyre (LA) til arachidonsyre (AA) og saaledes foretager hovedsagelig LA metabolit, 13-hydroxy-octadecaenoic syre (HODE) [14], [17], [18]. Prostatacancer har højere niveauer af 13-HODE og konverterer LA til 13-HODE i højere grad end normalt prostatavæv [14], [15], [16]. 15-LOX-2 derimod foretrækker AA i LA, gør hovedsageligt AA metabolit, 15-hydroxy-eicosatetraensyre (15-HETE), er under-udtrykt eller fraværende i prostatacancer, og dets niveauer korrelerer negativt med sygdommens sværhedsgrad [14], [17], [18], [19], [20]. Human prostatacancer har relativt ringe evne til at konvertere AA til 15-HETE [15]. Eksperimentelle undersøgelser har støttet og udvidet disse kliniske observationer

Mus lavet til at udtrykke i deres prostata kirtler human 15-LOX-1 udvikle prostata intraepitelialneoplasi (PIN) [21].; når tilsvarende manipuleret til at udtrykke menneskelige 15-LOX-2, de udvikler prostata forstørret med senescentceller [22]. Korrelerer med disse resultater, tvungen ekspression af humane 15-LOX-1 hastigheder og 15-LOX-1 knockdown forsinker udbredelsen af ​​dyrkede og eksplanterede humane prostatacancerceller [23]. Tvungen ekspression af human 15-LOX-2 forårsager disse celler til at stoppe prolifererende og bliver senescent [24], [25]. Virkningen af ​​15-LOX-1, forekommer på grund af sin produktion af 13-HODE, der forbedrer evnen af ​​vækstfaktorer til at stimulere prostatacancer celleproliferation [23], [26], [27]. Virkningen af ​​15-LOX-2 er dels tilskrives produktionen af ​​15-HETE, som hæmmer prostatacancer celleproliferation [24], [25], [26] gennem aktivering af peroxisomproliferatoraktiveret-aktiverende receptor (PPAR) -γ [26], [28], [29]. Disse resultater antyder, at udviklingen af ​​prostata epitelceller i malignitet involverer opregulere 15-LOX-1 og nedregulere 15-LOX-2 at skabe et miljø fremmer vækst, dvs. én rigere i pro-proliferative og fattigere på antiproliferativ PUFA metabolitter. Der er problemer med denne 15-LOX /n-6 PUFA model. AA selv forårsager prostatacancerceller at proliferere [30] og ligesom andre n-6 foreslås PUFA at fremme i stedet for at undertrykke prostatacancer i nogle epidemiologiske undersøgelser [31], [32], [33]. Desuden antiproliferative virkning af 15-HETE på dyrkede prostatacancerceller kræver ≥10-100 pM [25], [26], [34]. De tilsvarende primære metabolitter af n-6 PUFA, γ-linolensyre (GLA), og n-3 PUFA, eicosapentaensyre (EPA), er også mindre tilbøjelige mediatorer af 15-LOX-2 anti-cancer virkning, idet både 15-hydroxy-eicosatriensyre og 15-hydroxy-eicosapentaensyre kræver ≥1-5 uM at bremse spredning af prostata cancer celler [35], [36]. De eksisterende data dermed garanterer søger efter andre 15-LOX /PUFA metabolit modeller.

Vi her undersøge aktiviteten, potens, og virkningsmekanismen af ​​15-LOX metabolitter af DHA. Disse metabolitter er af særlig interesse, fordi 1) DHA er et medlem af n-3 PUFA familien foreslået at undertrykke prostatacancer hos epidemiologiske undersøgelser [31], [32], [33]; 2) DHA er en vigtig bidragyder til den anti-proliferative effekt af n-3 PUFA i prostata kræftceller [11], [12] og 3) aktiviteten af ​​kortere kæde n-3 PUFA, herunder EPA, kan være irrelevant for DHA s aktivitet, da mænd [37] samt dyrkede prostatacancerceller [11] kan let konvertere kortere kæde n-3 PUFA til EPA, men er næsten ude af stand til at konvertere EPA til DHA.

Materialer og Metoder

DHA og AA (NuChek Prep); sojabønne 15-LOX typen 1a (SLOX), natriumborat, og natriumborhydrid (Sigma); HPLC kolonner (Waters); HPLC eller optima karakteren organiske opløsningsmidler og diethylether (Fisher); anti-SDC-1 (H-174) antistof (Santa Cruz Biotechnology, Inc); anti-HRP-konjugeret sekundært antistof mod kanin-antistof (Cell Signaling Technology); og CellTiter 96® Vandig One Solution celleproliferationsassay og Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) blev købt. PC3, DU145, og LNCaP human prostatacancer-cellelinier (American Type Culture Collection (Manassas, VA) blev dyrket i avanceret Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Invitrogen) indeholdende 1% føtalt bovint serum (PC3-celler), Eagles minimale essentielle medium med Earles salte medium (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt bovint serum (DU145 celler), eller RPMI 1640-medium (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (LNCaP-celler) som beskrevet [34], [38].

metabolit Præparater

Vi forberedt 15S-hydroperoxyfedtsyrer-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-ensyre (15-HPETE), 15S-hydroxy-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-ensyre (15-HETE), 5S, 15S-dihydroxy-eicosa-tetra-6E, 8Z, 11Z, 13E-ensyre (5,15–DIHETE), og 8S, 15S-dihydroxy-eicosatetra-5Z, 9E, 11Z, 13E-ensyre (5,15- -DIHETE) syrer ved omsætning af arachidonsyre (AA) med SLOX [39] og brugt denne samme fremgangsmåde til fremstilling af DHA metabolitter. Kort fortalt, DHA (10

-4 M) omsat med 0,8 mg SLOX i 50 ml beluftet natrium boratpuffer (50 mM; pH 9; 4 ° C, 30 min). Reaktioner blev ekstraheret med diethylether; De 17S-hydroperoxy-docosa-hexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoat (17-HpDHA) produkt blev oprenset ved gravimetrisk kiselsyre kromatografi, isokratisk C18 u-Bondapak HPLC (1,5 x 300 mm; methanol: H

2O: iseddike 750/250 /0,1, v /v; 3 ml /minut; eluerede ved ~34 min), og isokratisk μ-porasil HPLC (1,5 x 300 mm; hexan: isopropanol: iseddike syre, 950:50: 1, v /v; 5 ml /min; eluerede ved -6 min). Eluering UV spektre blev overvåget med en G1315A diode array spektrometer løb med ChemStation 51 software (Agilent Technologies). 17-HpDHA blev omsat med natriumborhydrid i methanol og genoprenset ved μ-Bondapak HPLC til opnåelse 17S-hydroxy-docosahexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoat (17-HDHA). For dihydroxy produkter, blev DHA (10

-4 M) i 500 ml reaktioner omsat med 10 mg SLOX tilsat ved 0, 45, 90, 150, og 240 min. Efter 300 min blev reaktionen behandlet ligesom 17-HpHDA selvom μ-Bondapak HPLC trin; peak eluering i dette system på ~ 10 min med en trien absorbansspektre (maksima: 280, 270, og 261 nm) dominerer sin venstre side og 5,15–DIHETE-lignende absorbansspektre (maksimum: 243; adiabatisk pukkel: ~223 nm) dominerer sin højre side blev indsamlet; reduceret med natriumborhydrid; og, efter Butovich et al. [40], [41], opløst ved isokratisk 5SW HPLC (3 x 250 mm, hexan: isopropanol: iseddikesyre (974:26: 1, v /v; 1 ml /min) ind toppe ved ~17 og 22 min med respektive UV spektre for 10S, 17S-dihydroxy-docosahexa-4Z, 7Z, 11E, 13Z, 15E, 19Z-enoat (10,17-diHDHA også betegnes protectin DX [42]; maksima: 280, 270, og 260 nm) og 7S, 17S-dihydroxy-docsahexa-4Z, 8E, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoat (7,17-diHDHA [eller protectin D5] maksimum: 222 nm; adiabatisk pukkel: 242 nm) [40], [ ,,,0],41], [43]. Ud over deres HPLC elueringstider og UV-spektre, strukturerne i AA-metabolitter blev bekræftet ved MS [39] og de DHA metabolitter ved MS og kernemagnetisk resonans (NMR). 17-HDHA og 10,17-diHDHA gav elektrospray spektre (Quattro II MS, MassLynx 3,5 software, negativ ion-mode) svarer til dem offentliggjort [40], [41], [43], [44], [45], [46]. Den molekylær ion for 17-HpDHA var 16 AMU større end for 17-HDHA NMR spektre (1D og 2D dobbelt-kvante-filtreret COSY i d

4-methanol, 25 ° C; Bruker 699 MHz Avance NMR-spektrometer). for 17-HDHA og 10,17-diHDHA havde kemiske skift og koblingsmønstre matchende offentliggjorte rapporter [40], [41], [44]; de udledte konjugerede dobbeltbindingsgrupper geometrier var for 17-HDHA, 13Z, 15E; til 10,17-diHDHA, 11E, 13Z, 15E; og for 7,17-diHDHA, 8E, 10Z og 13Z, 15E. De fire DHA metabolitter manglede resonanser ved 6.1-6.2 ppm indikerer fravær af en trans-trans konjugeret dobbeltbinding. PUFA’en og metabolitter blev opbevaret i methanol under en argonatmosfære ved -80 °; befriet for methanol ved en strøm af nitrogen; taget op i dyrkningsmedier; og sat til cellekulturer. På grund af deres ustabilitet [40], [41], 15-HPETE og 17-HpDHA blev brugt inden for 3 ugers forberedelse.

spredning og Caspase Analyser

Proliferation blev analyseret med Cell Titer96 Vandig En løsning celleproliferationsassays (Promega) som beskrevet [47]. For at måle apoptotisk aktivitet blev celler podet i 96-brønds plader ved en densitet på 1000 celler /brønd i 24 timer, derefter behandlet med forbindelserne i 48 timer før måling af caspase aktivitet ved anvendelse af Caspase-Glo® 3/7 assay ( Promega) ifølge producentens instruktioner.

PPARy Activation Assay

2 × 10

5 PC3-celler blev podet på 35 mm skåle i 1 ml avanceret DMEM med 1% FBS, for 24 timer og transficeres med 1 ug af lacZ og 1 ug PPRE DNA (PPAR responselement-luciferase reporter) [34], [38] under anvendelse af FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche). I nogle undersøgelser blev celler cotransficeret med en vektor (1 ug), som koder dominant negativ (d /n) -PPARγ (L468 /E471) [34] [38] eller tom vektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 24 h eller blev behandlet i 30 minutter med PPARy-antagonist, GW9662. Cellerne blev derefter udfordret med en DHA metabolit eller en PPARy-agonist, troglitazon, i 24 timer. Celler blev skrabet ind Reporter Lysis Buffer (Promega). Prøver blev frosset i 18 timer og centrifugeret (200 g, 4 min, 20-C). Supernatantvæsker blev analyseret for luciferaseaktivitet og β-galactosidase (Promega Luciferase og β-galactosidase enzymassay Systems). Luciferase blev korrigeret for transfektionseffektivitet baseret på β-galactosidase som i [34], [38].

SDC-1 Assay

For at detektere SDC-1 besked, total PC3 celle-RNA blev forberedt og amplificeret i tre eksemplarer ved anvendelse af Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Primere til human SDC-1 var 5′-ggagcaggacttcacctttg (frem) og 5′-ctcccagcacctctttcct (tilbage). Data blev normaliseret til husholdning kontrol peptidyl-prolylisomerase B og præsenteres som i forhold til at styre. For at detektere SDC-1-protein, PC3-celler blev homogeniseret og lyseret i iskold puffer (25 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1 mg /ml phenyl-methansulfonyl fluorid, 1 × proteinase, og 1 × phosphataseinhibitorer [Roche Applied Science]), dialyseret mod 100 mM Tris og 30 mM natriumacetat, pH 8,0, i 24 timer ved 4 ° C, og fordøjet med chondroitinase ABC (Seikagaku, Ijamsville, MD) og heparinase III (Sigma -Aldrich) ved 37 ° C natten over. Proteinekstrakter blev fremstillet til Western blot-analyse som beskrevet under anvendelse af angivne antistof [12]. Band tætheder på fotografiske film blev analyseret ved hjælp af billede J 1.37v (National Institutes of Health, Bethesda, MD). At lukke munden SDC-1, 1 x 10

5 PC3 celler per brønd blev udpladet i 96-brønds plader, transficeret med et lille interfererende RNA (siRNA) for den humane SDC-1-genet (Ambion, katalog nr. AM16708) eller en negativ kontrol siRNA uden kendt mål under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) for at opnå en knockdown effektivitet 75% som beskrevet [12]. Kulturer blev inkuberet i 18 timer og derefter udfordret med en DHA metabolit i 3 dage.

Statistiske analyser

Data er udtrykt som middelværdi ± SD når data er vist, er fra et eksperiment, der blev gentaget med lignende resultater eller SEM hvor resultater er vist som middelværdien af ​​uafhængige forsøg. Resultaterne blev analyseret ved ANOVA (enkelt eller to måde som tiltalt) og Bonferroni Multiple Sammenligning indlæg test med GraphPad Prism-version 4.00 til Windows, GraphPad Software, San Diego CA. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

P

. 0,05

Resultater

17-HpDHA, 17-HDHA, 10,17-diHDHA, og 7,17-HDHA bremset proliferationen af ​​PC3-celler med 25% ved ca. 0,1, 1, 8, og 10 uM (fig. 1A). Under de samme betingelser, DHA påkrævet 60 pM at opnå denne effekt [12] og de analoge AA-afledte 15-LOX metabolitter, 15-HPETE, 15-HETE, og 8-15–DIHETE, havde langt mindre eller ingen aktivitet mens 5,15–DIHETE svagt stimuleret proliferation (fig. 1B). De sammenlignelige 15-hydroxy metabolitter af EPA og GLA sigende kræve ≥5 uM at bremse spredning med 25% [35], [36], mens 15-LOX-afhængige metabolitter af LA, 13-HODE og 9-HODE, manglede anti- proliferativ aktivitet ved 100 pM og faktisk stimuleret proliferation ved ≥0.1 og 1 nM (upublicerede observationer). 17-HpDHA og 17-HDHA viste sig også mere potent end 15-HPETE eller 15-HETE bremse udbredelsen af ​​LNCaP og DU145 prostata cancer celler (Fig. 1C og 1D). Tilsvarende resultater forekom i de tre cellelinier, når de inkuberes med metabolitterne i 48 eller 96 timer (resultater ikke vist). Under identiske betingelser, DHA kræves ≥30 pM for at inhibere proliferationen af ​​disse celler [12].

De angivne celletyper blev inkuberet i 3 dage med den angivne metabolit og deres proliferation præsenteret som gennemsnit ± SEM (≥ 3 uafhængige forsøg) fraktioner af denne findes i celler behandlet med køretøjet (dyrkningsmedier) for metabolitterne.

for at undersøge mekanismen (er) ligger til grund for metabolitter ‘anti-proliferativ aktivitet, vi fokuserede på PC3-celler og fulgte tidligere undersøgelser, som fandt, at DHA inhiberer prostatacancer celleproliferation ved at aktivere PPARy at inducere ekspressionen af ​​syndecan (SDC) -1. Denne transmembrane proteoglycan har apoptose-inducerende aktivitet for prostata og andre kræftceller [12], [38], [48], [49]. 17-HpDHA og 17-HDHA, ved ≥0.01 og 1 uM, forårsaget PC3-celler for at aktivere caspase-3, en markør for apoptose (fig. 2A). Statistisk analyse (tovejs ANOVA) viste, at dosis-respons-variabel signifikant (p 0,0001) og de to metabolit variabel signifikant (p 0,001) påvirket resultaterne med 17-HpDHA være mere potent, at 17-HDHA. Disse samme to DHA metabolitter forårsagede også cellerne til at aktivere en PPARy reporter gen; denne effekt var den samme som i den farmakologiske PPARy aktivator, troglitazon (fig. 2B), samt DHA [38], [48]. Både 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA var svage aktivatorer af PPARy i denne undersøgelse inducerer henholdsvis en 69% og 68% stigning i aktivitet i kontrol, trended mod men opnåede ikke statistisk signifikans (P 0,1) (Fig. 2B). Vi har tidligere vist, at både 15-HETE og 5,15–DIHETE (1-200 uM) undlod at aktivere denne reporter [34]. Endelig er DHA metabolitter stimulerede PC3 celler udtrykker SDC-1-mRNA (figur 2C.), Som resulterede i øget SDC-1protein (figur 2D.); disse virkninger også matches dem af troglitazon og DHA [12], [38], [48], [49]. De relative styrker af metabolitter i at producere disse reaktioner tilnærmet deres relative styrker bremse PC3 celleproliferation. Forskellen mellem svag aktivering af PPARy ved 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA (Fig. 2B) og deres mere robust effekt på akkumulering af SDC-1 protein i løbet af 72 timer (fig. 2D) kan foreslå en langsommere optagelse og /eller metabolismen af ​​disse to mere polære produkter af cellerne.

A. Celler blev inkuberet med den angivne koncentration af 17-HDHA eller 17-HpDHA i 24 timer og caspase-3-aktivitet blev målt ved Caspase-Glo® 3/7 assay. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD (n = 3) i forhold til kontrol-celler behandlet med mediet for metabolitterne. Svar på alle doser på og over 10

-8 M for 17-HpDHA og på eller over 10

-7 M for 17-HDHA var signifikant større end for kontrol celler (tovejs ANOVA, P 0,05) . B. Celler transficeret med luciferase PPARy-reportergenet blev stimuleret i 24 timer med 10 pM af den angivne metabolit (den laveste dosis, hvor alle havde en klar effekt på cellevækst) eller 5 uM troglitazon og analyseret for luciferaseaktivitet. Værdier repræsenterer middel ± SD (n = 3). Bars mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (én-vejs ANOVA, P 0,05) C. Celler blev behandlet med medium (kontrol) eller 10 uM af den angivne metabolit til 8 eller 24 timer og deres SDC-1-mRNA var målt. Værdier repræsenterer middel, ± SD (n = 3). Inden for hver gang gruppen, barer mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (én-vejs ANOVA, P 0,05). D. Celler blev behandlet med medium (kontrol) eller 10 uM af den angivne metabolit i 72 timer, og deres lysater blev analyseret for SDC-1. Western blot repræsenterer 3 uafhængige eksperimenter. Værdier i grafer repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3 uafhængige forsøg). Barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (en-vejs ANOVA, P 0,05)

PPARy aktivering optrådte kritisk for aktiviteten af ​​DHA metabolitter:. Metabolitterne blev markant hæmmet at tilskynde SDC-1 i PC3-celler transficeret med d /nPPARγ, men ikke i celler transficeret med pcDNA3 vektor kontrol, i forhold til celler, der var ikke-transficeret (fig. 3A). Vigtigere, d /nPPARγ transfektion også blokeret hver af de fire stofskiftehæmmere antiproliferativ aktivitet henviser pcDNA3 ikke gjorde, igen sammenlignet med celler, der var ikke-transficeret (fig. 3B). Til støtte for denne sidste resultat blev den anti-proliferative aktivitet af metabolitterne inhiberet i PC3-celler forbehandlet med PPARy-antagonist, GW6992, sammenlignet med celler behandlet med lægemidlet køretøj (fig. 3C). Endelig SDC-1 induktion optrådte også afgørende for metabolitterne ‘anti-proliferativ aktivitet. Celler, der havde deres SDC-1 slået ned ved transfektion med SDC-1-specifikke siRNA var ikke reagerer (dvs. ikke stoppede prolifererende som reaktion) til metabolitterne sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA eller ikke transfekteret (fig. 3D). Selvom 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA var relativt svage aktivatorer af PPARy (fig. 2B), virkningerne af disse metabolitter på SDC-1-ekspression og proliferation blev også følsomme over for PPARy inhibering (fig. 3A-D). Dette antyder, at en lav tærskel for receptoraktivering kan være tilstrækkeligt til PPARy opregulering af

SDC-1

gen, som er i overensstemmelse med virkningerne af DHA på denne vej vist i tidligere undersøgelser [38].

A. Celler ikke transficerede eller transficerede med pcDNA3 eller d /nPPARγ blev udfordret med 10 uM af den angivne metabolit i 24 timer før analyse syndecan-1-mRNA. Værdier repræsenterer middel ± SD (n = 3). Inden for en transfektion gruppe, barer mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (én-vejs ANOVA, P 0,05). B. Celler utransficerede eller transficeret med pcDNA3 eller d /nPPARγ blev udfordret med 10 uM af den angivne metabolit i 3 dage før assay proliferation. Værdier repræsenterer middel ± SD (n = 3). Inden for en metabolit gruppe, barer mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (én-vejs ANOVA, P 0,05). C. Celler blev inkuberet med 0-1 pM af PPARy-antagonist, GW6692, i 30 minutter og med 10 uM af den angivne metabolit i 3 dage før assay proliferation. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 3 uafhængige forsøg). Inden for en metabolit gruppe, barer mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (én-vejs ANOVA, P 0,05). D. Celler utransficerede, transficeret med kontrol siRNA, eller transficeret med SDC-1 siRNA blev udfordret med 10 uM af den angivne metabolit i 3 dage før assay proliferation. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD (n = 4). Inden for en transfektion gruppe, barer mærket med de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige fra hinanden; barer mærket med forskellige bogstaver er signifikant forskellige fra hinanden (en-vejs ANOVA, P 0,05).

Diskussion

De fleste af de PUFA oxygenaser og metabolitter, som de gør synes forbundet til progressionen af ​​prostatacancer, fordi disse metabolitter fremme celler af denne kræft til at formere [15], [16], [21], [23], [24], [26], [27], [28], [ ,,,0],30], [34], [50], [51], [52], [53]. 15-LOX-2 og dets metabolitter er enestående undtagelser fra denne regel: de synes knyttet til undertrykkelse af prostatakræft delvis fordi disse metabolitter hæmmer proliferation [15], [19], [20], [22], [24] , [25], [26]. Baseret på deres in vitro-aktivitet og dominans som 15-LOX-2 metabolitter, 15-HETE [24], [25], [26], [34], 15-hydroxy-eicostrienoic syre og 15-hydroxy-eicosapentaensyre [ ,,,0],35], [36] er kandidat mediatorer af 15-LOX-2s antiproliferativ virkning. den lave styrke af disse metabolitter tillader imidlertid, at produkter fra andre PUFA kan være mere potent og derfor vigtigere i mediering af 15-LOX-2 virkning. Vi finder, at medlemmer af 17-serie af DHA metabolitter, 17-HpDHA, 17-HDHA, 7,17-diHDHA, og 10,17-diHDHA, inhiberer proliferationen af ​​androgen-uafhængig (PC3 og DU145) og androgen-afhængige (LNCaP) prostata kræftceller. Den mest potente af disse, 17-HpDHA og 17-HDHA, betydeligt langsommere proliferation ved koncentrationer på ≥1 og 100 nM, og derfor er 1.000 gange mere potent end de tilsvarende metabolitter af AA; de også forekommer langt mere potent end de 15-LOX metabolitter af EPA og GLA som rapporteret i [35], [36]. DHA metabolitter klart handlet i en strukturel specifik måde som det fremgår af deres decideret forskellige individuelle kræfter og deres større potenser end deres kolleger i de 15-serie af AA metabolitter. Vi bemærker, at aktiviteterne i 17-serien af ​​DHA metabolitter findes her ikke udelukker muligheder, som deres virkninger involverer deres videre cellulær metabolisme til endnu mere potent anti-proliferative produkter. Vi er lige begyndt at undersøge dette spørgsmål.

Undersøgelser har vist, at DHA undertrykker spredning af prostata cancer celler, herunder PC3 celler ved en vej, der involverer aktivering af PPARy, bindingen af ​​PPARy til SDC-1 promotor , induktion af SDC-1, og SDC-1-induceret apoptose [12], [38]:

DHA metabolitter studeret her stimulerede PC3 celler til at aktivere en PPARy reporter, udtrykke SDC-1, og aktivere caspase-3, hvilket antyder en yderligere vigtigt skridt i denne pathway dvs. metabolismen af ​​DHA til mere potente mellemprodukter. Desuden PPARy antagonist, GW6992, d /nPPARγ, og SDC-1 lyddæmpning blokerede DHA metabolitter ‘anti-proliferativ handling; d /nPPARγ blokeret også deres induktion af SDC-1. De metabolitter anvendte således den samme signalvej som DHA at bremse udbredelsen af ​​PC3 celler. Dette sæt af resultater åbner muligheden for, at anti-proliferative effekt af DHA medieres i det mindste delvist gennem sin metabolisme ved 15-LOX-2 til 17-serie af metabolitter, især 17-HpDHA og 17-HDHA. Der er dog flere problemer med denne ordning.

Undersøgelser uenige om evne PC3 celler til at metabolisere PUFA med nogle finde cellerne gør noget [26] eller meget lidt [23], [24] 13- HODE og 15-HETE og andre finde de gøre betydelige mængder af 13-HODE [15], [16], men lidt 15-HETE [15], selv efter udsættelse for høje koncentrationer af LA eller AA. Siden 15-LOX-1 foretrækker LA til AA, mens 15-LOX-2 foretrækker AA til LA [14], [17], [18], [19], [20], indikerer disse resultater, at PC3 celler har ingen eller lille 15-LOX-2 metaboliserende aktivitet, et resultat fuldt kompatibel med fund, at disse celler har 15-LOX-1, men lille eller ingen 15-LOX-2-meddelelse og protein [15], [24], [54]. Desuden har den relative evne og specificiteten af ​​de to humane enzymer til anvendelse DHA som et substrat ikke defineret, selv om en 15-LOX-1 knock-down studie i retinale pigment epitelceller antyder, at 15-LOX-1, men ikke 15- LOX-2 er ansvarlig for metaboliske DHA til 17-serien af ​​metabolitter [55]. Det er klart, at 17-serie af DHA metabolitter er lavet af forskellige celletyper in vitro og talrige vævstyper in vivo [45], [55], [56], [57], [58]. Imidlertid er evnen hos maligne samt normale prostataceller og væv til at gøre disse metabolitter og bidraget fra 15-LOX-1 versus 15-LOX-2 til dette ikke er kendt. Vi fandt, at PC3-celler provokeret med en antiproliferativ koncentration (dvs. 100 uM) af DHA for 0.5-96 h konverteres kun meget små mængder ( 0,003%) af det til 17-HDHA, 7,17-diHDHA plus 10 , 17-diHDHA, som påvist ved selektiv ion-overvågning-MS (upublicerede studier). Disse mængder syntes utilstrækkelig til at bremse proliferation. Stillet over for disse resultater, kan det være rentabelt at overveje andre muligheder, som prostatakræft kan udsættes for disse metabolitter. Human prostatacancer sidestiller med normalt væv. Denne normalt væv kunne give den 17-serie af DHA metabolitter gennem aktiviteten i 15-LOX-1, 15-LOX-2, eller cytochrom P450 [59], [60]. 17-serien DHA metabolitter også dannes gennem auto-oxidation [61]; dyrkede neuroblastomceller, f.eks metabolisere DHA til 17-HDHA og andre cytotoksiske DHA derivater gennem autooxidation samt 15-LOX-afhængige pathways [56]. En eller flere af disse alternative veje kan være det middel, hvorved kosten n-3 PUFA i sidste ende tjener til at reducere dødeligheden af ​​prostatacancer [31].

Som konklusion finder vi, at en række af 15-LOX- afledte metabolitter af DHA, især 17-HpDHA og 17-HDHA, er langt mere potente end deres oprindelige molekyle eller 15-LOX-metabolitter af andre PUFA i inhibering af proliferation af androgen positive og androgen negative human prostatacancer-cellelinier. Svarende til deres forældre molekyle, DHA metabolitter ‘virkningsmekanisme involverer PPARy /SDC-1 apoptose-signalvejen. Vi foreslår, at prostatakræft-hæmmende effekt af kosten DHA medieres delvist af omdannelsen af ​​DHA til en eller flere af disse metabolitter.

Tak

Indholdet af dette manuskript er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Cancer Institute eller National Institutes of Health.