PLoS ONE: Omega-3 eicosapentaensyre Fald CD133 Colon Cancer Stem-Ligesom Cell Marker Expression samtidig øge følsomhed til Chemotherapy

Abstrakt

Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i den vestlige verden.

In vitro

in vivo

forsøg viste, at omega-3 flerumættede fedtsyrer (n-3 PUFA) kan dæmpe spredningen af ​​kræftceller, herunder tyktarmskræft, og øge effektiviteten af ​​forskellige lægemidler mod cancer. Men disse undersøgelser omhandle virkningerne af n-3 PUFA’er på størstedelen af ​​tumorcellerne og ikke på de udifferentierede tyktarmskræft stamceller-lignende celler (CSLCs), der er ansvarlige for tumordannelse og vedligeholdelse. CSLCs har også været forbundet med erhvervelsen af ​​kemoterapi modstand og til tumor tilbagefald. Colon CSLCs er immunophenotyped anvendelse af adskillige antistoffer mod cellulære markører herunder CD133, CD44, EpCAM, og ALDH. Anti-CD133 er blevet anvendt til at isolere en population af colon cancerceller, der bevarer stamceller egenskaber (CSLCs) fra både etablerede cellelinier og primære cellekulturer. Vi viste, at n-3 PUFA, eicosapentaensyre (EPA), aktivt blev inkorporeret i membranlipider af COLO 320 DM celler. 25 uM EPA faldt celle antallet af den samlede population af kræftceller, men ikke af de CD133 (+) CSLCs. Også vi observeret, at EPA induceret nedregulering af CD133-ekspression og opregulering af colon epitel differentiering markører, Cytokeratin 20 (CK20) og Mucin 2 (MUC2). Endelig viste vi, at EPA øgede følsomhed COLO 320 DM celler (samlede befolkning) til både standard-of-care kemoterapi (5-fluorouracil og oxaliplatin), hvorimod EPA øgede følsomhed CD133 (+) CSLCs kun 5- Fluorouracil

Henvisning:. De Carlo F, Witte TR, Hardman WE, Claudio PP (2013) Omega-3 eicosapentaensyre Fald CD133 Colon Cancer Stem-Ligesom Cell Marker Expression samtidig øge følsomhed til kemoterapi. PLoS ONE 8 (7): e69760. doi: 10,1371 /journal.pone.0069760

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret: 12 jun 2013; Udgivet: den 16. juli, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Forfatterne takker Marshall University Biokemi og Mikrobiologi Kirurgi Afdelinger for deres støtte. De nuværende undersøgelser blev støttet af en bevilling af Bean Foundation, og delvist af NIH tilskud CA131395, CA140024, og WV-INBRE 5P20RR016477 (til PPC) og delvist af NIH give R01CA114018 og DOD tilskud W81XWH-10-1-0697 ( til WEH). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Cancer Institute eller National Institute of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald i den vestlige verden, og hvert år er ansvarlig for en halv million dødsfald på verdensplan [1], [2]. På trods af behandlingen kirurgisk resektion og kemoterapi, næsten 50% af patienter udvikler resistens, tumor tilbagefald eller metastatiske sygdomme [2], [3]. Nylige opdagelser har vist, at dette kan skyldes, i det mindste delvis, at der foreligger cancer stamceller-lignende celler [4], og det understreger behovet for forbedrede behandlingsformer, der kan målrette dem.

En voksende mængde af beviser underbygger tanken om, at human cancer kan betragtes som en stamcelle sygdom. Den cancerstamceller model foreslår, at kun en fraktion af celler i en tumor besidder cancer indledning potentiale, og at disse cancer stamceller-lignende celler (CSLCs) er i stand til at initiere og opretholde tumorvækst [5], [6]. Ricci-Vitiani [4] og O’Brian [7] var den første til at give uafhængige bevis for eksistensen af ​​kolon CSLCs. De isolerede et CD133 (+) population af celler inde i tumoren, der var i stand til at vokse som udifferentierede kolon sfærer i et serum-frie medier, som kan opdeles i den heterogene tumorcellepopulation. De demonstrerede, at kun den CD133 (+) subpopulation var tumorigene i en seriel xenograft assay i immunsvækkede NOD /SCID-mus. For nylig er det blevet vist, at CD133 også kan anvendes til at identificere CSLCs i etablerede cellelinier. CD133 (+) celler isoleret fra cancercellelinier har vist sig at være mere tumorigen end CD133 (-) cellefraktion både

in vitro

in vivo

[8]. Derudover CD133 (+) celler, dyrket i sfærer, opretholde ekspressionen af ​​denne markør selv på lang sigt sfære kultur [9]. Nylig dokumentation fra kliniske undersøgelser viste, at CD133 ekspressionen var negativt korreleret med patientens prognose i avanceret tyktarmskræft [10], [11].

Epidemiologiske undersøgelser har vist en øget forekomst af tyktarmskræft i populationer indtager en vestlig kost, rig på rødt kød, animalsk fedt, og lav i korn. Denne forekomst reduceres hos patienter, der forbruger større mængder af frugt, grøntsager, fibre, og endnu vigtigere, n-3 flerumættede fedtsyrer (PUFA) af marin oprindelse [12], [13]. Den forælder n-3 PUFA α-linolensyre (ALA) findes i vegetabilsk olie, mens dets metabolitter eicosapentaensyre (EPA) og decosahexaensyre (DHA) fås hovedsageligt fra koldtvands fede fisk. Meget data er blevet udgivet om evnen af ​​n-3 PUFA at mindske spredning, at udøve en pro-apoptotisk effekt, og at hæmme angiogenese i flere

in vitro

coloncancer-modeller [14] – [17] . Omega-3 PUFA’er har også vist sig at forøge følsomheden for kemoterapi af adskillige humane afledt kræft cellekulturer

in vitro

såsom bryst [18], hjerne og lunge [19], lymfocytisk [20], og colon [15]. På lignende måde, n-3 PUFA’er sensibiliseret

in vivo Salg modeller af brystkræft [21], sarkom [22], og leukæmi [23] til anticancerterapi. Men alle disse undersøgelser behandles virkningen af ​​PUFA behandlinger på hovedparten af ​​tumorceller, ikke på CSLCs.

antitumoraktiviteten af ​​n-3 PUFA har ikke alene været knyttet til deres virkninger på proliferation og apoptose men også på differentiering i forskellige celle-modeller. En forbindelse mellem omega-3 PUFA og fremme af cellulær differentiering er allerede blevet beskrevet i normale og maligne celler [24] – [28]. Omega-3 PUFA’er er blevet vist at differentiere myeloide progenitorceller i knoglemarven hos mus uden at ændre antallet af hvide blodlegemer i cirkulation [24]. På lignende måde er det blevet vist, at langtidsbehandling behandlinger af EPA og DHA, som ikke ændrer morfologi eller det gennemsnitlige antal af celler i den del af normal tyktarmsslimhinde krypt i rotter, har nedsat cellulær proliferation, forbedre differentiering og apoptose [29].

Derudover behandling af humane brystcancerceller med n-3 PUFA’er resulterede i deres vækstinhibering, som var proportional med brystkirtel differentiering [27], og en pro-differentierende virkning blev også observeret i DHA behandlede humane melanomaceller

in vitro

[26].

formålet med vores undersøgelse var at undersøge, om

in vitro

koncentrationer af EPA svarende til plasmaniveauer opnås i menneskelige krop efter tilskud af kosten med 2,4 g n-3 /dag [30], var i stand til at påvirke differentiering status og kemosensitivitet af den samlede population af kolon kræftceller og specifikt af CD133 (+) CLSCs.

Materialer og metoder

Cell kultur

den menneskelige kolorektal adenocarcinom cellelinie COLO 320 DM (CCL-220, hertugens C) blev opnået fra Amerika Type Culture Collection (Rockville, MA). Colo320DM celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, penicillin 100 U /ml og streptomycin 100 ug /ml (HyClone, South Logan, UT). Celler blev subdyrket ved en tæthed på 1 x 10

5 /ml to gange om ugen i en fugtig atmosfære ved 37 ° C, 5% CO

2.

Kemikalier og narkotika

Eicosapentaensyre, EPA (omega-3 polyumættet fedtsyre, 20:05) blev indkøbt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI) og stearinsyre (SA, mættet fedtsyre, 18:0) fra Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). 100 mM stamopløsninger af EPA og SA i absolut ethanol blev foretaget og fortyndet til endelig koncentration med kulturmedier.

Oxaliplatin og 5-fluoruracil blev købt af Alexis Biochemicals (Farmingdale, NY). 12.6 mM stamopløsninger af Oxaliplatin og 384,3 mM 5-fluoruracil i DMSO blev foretaget og fortyndet til endelig koncentration med kulturmedier.

Kontrol celler blev behandlet med den samme mængde køretøj, ethanol eller DMSO (CTRL VH). Slutkoncentrationerne vehicle aldrig oversteg 0,1% v /v.

gaschromatografi

COLO 320 DM blev udpladet i 100 mm petriskåle (1 × 10

6 celler) og behandlet efter 4 timer med køretøj kontrol eller en række koncentrationer af EPA og SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM). Fedtsyresammensætningerne af COLO 320 DM blev vurderet ved anvendelse af gaschromatografi. CTRL VH og behandlede celler blev høstet efter 96 timer, vasket i PBS1X at fjerne overflade lipider, derefter homogeniseret i destilleret vand med 0,1% BHT (3,5-di

tert

butyl-4-hydroxy-toluen ) i methanol for at forhindre fedtsyreoxidation. Lipider blev ekstraheret med chloroform /methanol, og derefter transmethylated. Methylerede lipider blev separeret og identificeres ved anvendelse af gaskromatografi, som tidligere offentliggjort [31]. Fedtsyremethylestere standarder (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN) blev anvendt til peak identifikation.

De enkelte fedtsyremethylestere af EPA, DPA (decosapentaenoic syre), DHA og, SA blev rapporteret som procentdelen af ​​summen af ​​de samlede methylerede fedtsyrer (areal under kurven).

Metabolisk aktivitet assay (MTT assay) tidsforløb

COLO 320 DM celler blev udpladet i plader med 96 brønde (3.000 celler /brønd). Efter 4 timer blev celler behandlet med en række koncentrationer af EPA og SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) eller vehikelkontrol (CTRL VH) i 0-4 dage. Celler blev derefter analyseret dagligt for metabolisk aktivitet ved MTT-assayet. Kort fortalt, 10 pi 5 mg /ml MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 2 timer i en fugtig atmosfære ved 37 ° C, 5% CO

2. Efter dette tidsrum blev mediet fjernet, formazansalt dannet solubiliseret med DMSO og absorbansen blev aflæst ved 570 nm med en mikropladelæser.

celletælling og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse

COLO 320 DM blev udpladet i en 24-brønds plade (2,5 x 10

4 /brønd) og behandlet efter 4 timer med en række koncentrationer af EPA eller SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) i 96 timer. Levedygtige celler blev talt ved anvendelse af en trypan fremgangsmåde blå-udelukkelse. Efterfølgende celler blev suspenderet i kold FACS-buffer (PBS1X, 2 mM EDTA, 0,1% BSA), og alikvoter af celler, 2 x 10

5 celler /50 ul, blev mærket med den passende koncentration af monoklonalt antistof mod CD133 /2 ( 293C3), phycoerytrin konjugeret (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). Et isotype antistof blev anvendt som en kontrol antistof til baggrund normalisering. Analyse blev udført med en Accuri-C6 flowcytometer (BD Accuri cytometre, Ann Arbor, MI). Efter den procentdel af positivitet for CD133 blev bestemt, at antallet af CD133 (+) og CD133 (-). Negative celler i den samlede befolkning blev beregnet

Real Time PCR

COLO 320 DM var udpladet i 100 mm petriskåle (1 × 10

6 celler) og behandlet med vehikel, EPA, eller SA (25 uM). Celler blev høstet efter 48 og 96 timer og total RNA blev ekstraheret fra prøverne under anvendelse af Trizol ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA blev solubiliseret i ddH2O og nukleinsyre-koncentrationen blev målt ved en Nano Drop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). RNA (1 ug) blev udsat for omvendt-polymerasekædereaktion ved anvendelse af et højkapacitets-cDNA transskription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) og Real-time PCR blev udført med RT2 SYBR Green /ROX qPCR Master Mix anvendelse af en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Relative ændringer i genekspression blev beregnet ved anvendelse af 2-ΔΔCt metode, beskrevet af Livak og Schmittgen [32]. β-Actin blev brugt som husholdning gen

β

Actin-F

:. GGT TCC GCT GCC CTG AGG;

β

Actin-R

: GTC CAC GTC ACA CTT CAT G.

Specifikke par af primere blev anvendt til at forstærke gener af interesse:

CD133-F

: TTG GCT CAG ACT GGT AAA TCC C;

CD133-R

: ATA GGA AGG ACT CGT TGC TGG T;

CK20-F

: ACC TCC CAG GCC TTG AGA T;

CK20-R

: TGG CTA ACT GGC TGC TGT AA,

MUC2-F

: GGG ACT GTG AGT GCT TCT GC;

MUC2-R

: AGT GGA TGC CGT TGA TGG T.

Western Blotting

COLO 320 DM blev udpladet i 100 mm petriskåle (1 × 10

6 celler) og behandlet med vehikel, EPA eller SA (25 uM) i 48 og 96 timer. Total proteiner blev ekstraheret fra celler efter lysering i koldt prøvebuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 8, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1% Triton X-100). Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) blev udført ifølge Laemmli fremgangsmåden [33]. Ens mængder af totale proteiner af hver prøve blev underkastet elektroforese derefter overført til 0,45 um nitrocellulosemembraner. Efter blokering i 5% fedtfri mælk i TBS-T, blev membraner inkuberet med de følgende antistoffer: Anti-CD133 /1 (AC133 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland), Anti-Cytokeratin 20 (EPR1622Y Abcam, Cambridge, MA ). Anti-p Actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt som indlæsning kontrol. Efter inkubering med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev immunkomplekserne visualiseret ved forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Billeder blev erhvervet ved hjælp af Luminary /FX imaging system (Fotodyne, Hartland, WI). Densitometri blev udført med Image j 1,45 software (Image Processing og analyse i Java) (imagej.nih.gov/ij/download/).

Dot Blotting

Dot blot blev udført som tidligere beskrevet [34]. Kort fortalt blev COLO 320 DM belagt, behandlet med bærer, EPA eller SA (25 uM) i 48 og 96 timer og proteiner blev ekstraheret som beskrevet i Western blot-analyse sektion. Ens mængder af totale proteiner af hver prøve blev spottet på en 0,45 um nitrocellulosemembran. Et peptid kompetitive assays blev udført for at verificere specificiteten af ​​Muc-2-antistof (Pierce, ThermoScientifics, Waltham, MA). 300 ug specialfremstillede peptid (CPDFDPPRQENETWW, peptid 2.0, Chantilly, VA) med en identisk sekvens til den, der anvendes til at generere Muc-2-antistof blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med 1 ug af muc-2-antistof. Efter blokering i 5% fedtfri mælk i TBS-T, blev membranerne inkuberet med anti-Muc-2 og anti-p Actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som kontrol. Efter inkubering med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev immunkomplekserne visualiseret og afbildes som beskrevet i Western blot-analyse sektion.

Isolering af Cancer stamcellepopulation

CSCLs blev isoleret ved anvendelse af en CD133 mikroperle kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). COLO 320 DM totale cellepopulation blev mærket med et monoklonalt antistof CD133 /2 (293C3) konjugeret til mikro-perler og den CD133 (+) celler blev magnetisk sorteret. En alikvot af celler elueret fra søjlen blev mærket med et monoklonalt antistof mod CD133 /1, phycoerytrin konjugeret (AC133, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland) og en FACS-analyse blev udført for at evaluere den procentdel af renheden af ​​CD133 (+) celler.

vækst-inhiberingsassay

COLO 320 DM-celler blev udpladet i plader med 96 brønde (3000 celler /brønd). Efter 4 timer blev celler behandlet i 24 timer med en række koncentrationer af oxaliplatin (0,005-0,1 mm) eller 5-fluorouracil (0,05-2 mM) for at bestemme den koncentration, der 25% og 50% af vækstinhibering. Celler blev derefter analyseret for deres metaboliske aktivitet af en MTT-analysen.

kemosensitivitet assay

COLO 320 DM (3 × 10

3) celler /brønde, samlede befolkning eller CD133 (+) , blev udpladet i 96-brønds plader. Efter 4 timer komplette medier suppleret med bærer, EPA, eller SA blev tilsat til opnåelse af en slutkoncentration på 25 uM FA’er. Efter 48 timer blev mediet erstattet med frisk medium suppleret med en række oxaliplatin (0,005-0,1 mm) eller 5-fluorouracil (0,05-2 mM) koncentrationer. Efter 24 timers behandling, af en MTT-assay blev udført for at definere den inhiberende koncentration, som fører til en reduktion i levedygtighed på 25% (IC25) og 50% (IC50).

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført mindst tre gange og præsenteres som middelværdi ± SD. Alle data blev analyseret under anvendelse Prism © software (Graphpad, Inc., La Jolla, CA). Envejs variansanalyse (ANOVA) med Tukey flere sammenligninger post-test blev anvendt til at bestemme statistiske signifikans af forskellene mellem eksperimentelle grupper:.

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

eicosapentaensyre er indarbejdet og metaboliseres af COLO 320 DM celler

for at vurdere inkorporeringen af ​​fedtsyrer ved COLO 320 DM celler vi analyserede fedtsyrer sammensætning ved gaschromatografi efter behandling med EtOH (CTRL VH) eller med en række koncentrationer (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) af PUFA’er n-3, EPA, eller mættet FA’er SA. Efter 96 timer blev cellerne høstet, og de samlede lipider blev ekstraheret. Først vi registreret, at SA er 30 gange mere repræsenteret i kontrolgruppen bilen total lipid cellulære membran end EPA, DPA, og DHA. Vi observerede (figur 1A) en signifikant dosis reagerende stigning af EPA i cellerne behandlet med denne fedtsyre. Endvidere fraktionen svarende til DPA, hvilket er en EPA metabolit, steg også efter EPA behandling. Disse resultater viste, at COLO 320 DM celler indarbejdet og effektivt metaboliseres EPA. På lignende måde observerede vi en dosisafhængig forøgelse af SA-indhold i de totale lipider fra COLO 320 DM behandlet med stearinsyre (figur 1B).

Total lipider blev ekstraheret fra COLO 320 DM celler behandlet i 96 timer med kontrol køretøj (CTRL VH) eller en række koncentrationer af (a) EPA eller (B) SA, (6.25-12.5-25 uM). Gas kromatografi blev udført for at studere fedtsyrer stiftelse og deres metabolitter af COLO 320 DM celler. Resultaterne præsenteres som relative procentdel i forhold til CTRL VH. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre eksperimenter.

Sorte bjælker

: sammensatte anvendes til behandling detekteres med GC;

Light Grey barer

: DPA (

docosapentaensyre

, C22: 5, n-3);

Mørk Grå stænger: DHA (docosahexaensyre, C22: 6, n-3)

. (SA: stearinsyre C18: 0).

25 uM eicosapentaensyre behandling faldt celle antal COLO 320 DM celler uden at påvirke CSLCs befolkningens

Flere linjer af beviser har vist eksistensen af ​​en lille population af cancer stamceller-lignende celler, der kan initiere og vedligeholde tumorer. Brugen af ​​specifikke markører, herunder CD133 for kolon CSLCs, har gjort det muligt for forskerne at mærke disse celler og skelner mellem CSLCs befolkning og hovedparten af ​​tumor [4], [7]. Omega 3 fedtsyrer er allerede blevet rapporteret at reducere hovedparten af ​​tumorceller [14] – [17]., Men virkningen på CSLCs er ikke blevet bestemt

Figur 2A og tabel 1 viser, at et tidsforløb behandling (0-96 timer) med 25 uM EPA faldt betydeligt antallet af COLO 320 DM (samlede befolkning) som målt ved MTT-assay i forhold til vehikelkontrol (p 0,01 ved 72 timer, og p 0,001 ved 96 timer). Behandlinger med 25 pM SA, reduceres til en mindre grad celleantallet af COLO 320 DM celler (figur 2B og tabel 1).

COLO 320 DM celler blev behandlet i 0-96 timer med vehikelkontrol (CTRL VH ) eller 6.25-12.5-25 uM af (A) EPA og (B) SA. MTT-assay af EPA og SA-behandlede celler vs. vehikelkontrol (CTRL VH) behandlede celler.

s

værdier blev beregnet med én-vejs ANOVA test med en Tukeys multipel sammenligning post-test på de forskellige behandlinger inden for hvert tidspunkt. * P ≤ 0,05; ** P≤0.01; *** P≤0.001; n = 5. COLO 320 DM celler blev også behandlet i 96 timer med vehikelkontrol (CTRL VH) eller et område af koncentrationer af fedtsyrer (6.25-12.5-25 uM), (C) EPA og (D) SA. Levedygtige celler blev talt og mærket med et monoklonalt antistof anti-CD133 at bestemme procentdelen af ​​CD133 (+) celler i de behandlede grupper. Resultaterne repræsenterer CD133 (+) og CD133 (-) celleantal på ± SD af mindst tre forsøg.

s

værdier blev beregnet med t-test på behandlede prøver vs CTRL VH (* p ≤ 0,05).

For at definere, hvilke cellulære befolkning (bulk tumor eller CSLC) blev påvirket, vi først behandlet COLO 320 DM med en række koncentrationer af EPA eller SA (6,25 øh, 12,5 øh, 25 uM) i 96 timer. EPA forskelligt påvirket de to cellulære delpopulationer (CD133 (+) og CD133 (-) celler). En trypanblåt celletælling blev udført efter vi mærkede portioner af behandlede og ubehandlede celler med et monoklonalt antistof mod CD133 /2 (glykosyleret epitop 2). En fluorescens-aktiveret cellesortering analyse blev udført for at bestemme procentdelen af ​​celler positive for CD133 og at beregne antallet af CD133 (+) celler i den samlede population for hver behandlet prøve. Figur 2C viser, at behandlinger med EPA faldt betydeligt (p 0,05) antallet af CD133 (-) celler (hovedparten af ​​tumor), på den fysiologiske koncentration på 25 uM. Interessant nok blev den CD133 (+) CSLCs befolkning kun knap berørt af den samme koncentration af EPA (25 uM), der forårsagede en reduktion i celle nummer CD133 (-) delpopulation. Behandlingen med SA, som er en mættet fedtsyre, ikke signifikant ændre hverken CD133 (+) eller CD133 (-) celleantal (figur 2D). Afslutningsvis viste vi, at 25 uM EPA reducerede signifikant antallet af COLO 320 DM hovedparten af ​​tumorceller, men at SA ikke.

eicosapentaensyre inducerede en forøgelse af colon epitel differentieringsmarkører, cytokeratin 20 og Mucin 2 mRNA-ekspression mens faldende CSLCs markering, CD133

den mellemliggende filament cytokeratin 20 udtrykkes i epitelceller i mavetarmkanalen. CK20 har vist sig at blive nedreguleret eller dets ekspression er fuldstændig tabt i en række colorektale prøver cancerpatient sammenlignet med den tilstødende normale slimhinde [35] – [37]. Tilsvarende MUC2 er mindre udtrykt i colorektal adenocarcinom, mens dets ekspression opretholdes i normalt væv støder op til malignitet [38] – [40]

CD133 er blevet rapporteret til specifikt markere lille udifferentieret population af tumorfremkaldende. celler i colon cancer [4], [7] og at være forbundet med dårlig prognose i fremskreden tyktarmskræft [10], [11]. For at forstå, hvis EPA ændret genekspression af CK20, MUC2, og CD133, vi behandlede COLO 320 DM i 48 og 96 timer med 25 pM EPA, SA, eller kontrol køretøj. Vi observerede, at EPA inducerede en forøgelse af de relative mRNA-niveauer af CK20, findes på begge, enterocytterne og bæger celler (figur 3A), og af slimceller markør MUC2 (figur 3B), sammenlignet med de bærerbehandlede celler. De observerede virkninger var statistisk signifikant på både 48 og 96 timer for CK20 og på 96 timer for MUC2. Vi observerede også, at EPA inducerede et fald i ekspressionen af ​​CD133 CSLCs markør efter 48 og 96 timer (figur 3C) (p 0,05 og 0,01). SA (figur 3A, 3B) faldt betydeligt CK20 efter 48 timers behandling uden at påvirke MUC2 ekspression. Vi observerede også, at SA på den anden side steg CD133 RNA-ekspression (figur 3C) ved 96 timer efter behandling. Disse data antyder, at omega-3 har en pro-differentiering effekt på COLO 320 DM celler.

COLO 320 DM celler blev behandlet med vehikelkontrol (CTRL VH) og 25 uM af EPA eller SA i 48 og 96 timer . Totalt RNA blev ekstraheret og Real-Time RT-PCR blev udført for at studere den relative ændring i genekspression af specifikke markører i forhold til p-actin. Ekspressionen af ​​differentieringsmarkører (A) cytokeratin-20 (CK20), en enterocytter og bæger celler markering, (B) mucin-2 (MUC2) en slimceller markering, og (C) tyktarmskræft stamceller-lignende celler mærketråden CD133 var undersøgt efter behandlinger med køretøj kontrol (CTRL VH), EPA eller SA. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre eksperimenter.

s

værdier blev beregnet med t-test på behandlede prøver vs CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01).

25 uM eicosapentaensyre øger Cytokeratin 20 proteinsyntese mens faldende CD133 i COLO320 DM celler

for at afgøre, om ændringen i mRNA-ekspression korreleret til en effekt på CK20, Mucin 2, og CD133 proteinsyntese, vi udvindes det samlede proteinindhold fra COLO 320 DM efter behandling i 48 og 96 timer med bil, EPA og SA på 25 uM. Som forudsagt af Real Time PCR analyse blev CD133 protein faldt betydeligt efter 96 timers EPA behandling (figur 4A og B). Vi observerede, at cytokeratin 20 proteinniveauer ved 48 og 96 timer var signifikant højere i 25 uM EPA behandlede celler sammenlignet med kontrolpatienter køretøj eller til SA behandling (figur 4A og C) som påvist ved western blot-analyse. Vi observerede også, at mucin 2 proteinniveauer ikke ændredes efter 48 og 96 timer ved dot-blot-analyse i 25 uM EPA behandlede celler sammenlignet med kontrolpatienter køretøj eller til SA-behandling (figur 4A og D). For at verificere specificiteten af ​​MUC-2-antistof, der blev anvendt til dot-blot-analyse, gennemførte vi et peptid baseret assay og har vist, at 300 gange overskud af peptid effektivt konkurrerede bindingen af ​​antistoffet til MUC-2 er til stede i cellelysatet .

(A) Samlet lysat blev opnået fra COLO 320 DM celler behandlet med køretøj kontrol (CTRL VH), 25 uM EPA eller SA i 48 og 96 timer. Western blot blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​cytokeratin-20 (CK20) og CD133 efter behandling med fedtsyrerne. Dot blot blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​mucin 2 (MUC2) efter behandling med fedtsyrerne. Et peptid er identisk med den, der anvendes til at generere Muc-2 antistof blev anvendt i et peptid baseret assay til bestemmelse MUC2 antistofspecificitet. Ændringerne i (B) CD133, (C) CK20, og (D) MUC2 protein udtryk i forhold til p-actin er repræsentative for tre separate forsøg. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre eksperimenter.

s

værdier blev beregnet med t-test på behandlede prøver vs CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01).

Som konklusion, vi observeret, at EPA øgede protein udtryk for markør for differentiering CK20 og nedsat ekspression af markør for stemness CD133 i COLO 320 DM celler.

Forbehandling med 25 pM eicosapentaensyre øger følsomheden af ​​COLO 320 DM total befolkning og CSLCs til 5-fluoruracil

evne omega-3 fedtsyrer for at forbedre effekten af ​​lægemidler mod cancer både

in vitro

og

in vivo

på hovedparten af ​​tumor celler er tidligere blevet beskrevet [15], [18], [19], [22], [23], [31]. Men stadig urapporteret er kemo-sensibiliserende virkninger af EPA på hovedparten af ​​tumor i forhold til virkningen på CSLCs befolkning efter standard-of-care mod kræft behandlinger.

I dette arbejde undersøgte vi, om forbehandling med EPA stiger kemoterapi respons standard-of-care anticancermedicin i både hovedparten af ​​tumor celler og CSLCs befolkning dyrket fra COLO 320 DM celler.

Vi fandt, at 2,5 uM eller 10 uM oxaliplatin resulterede i en celle levedygtighed 75,88 ± 3,23% (IC

25) eller 53 ± 1,18% (IC

50) af kontrol (figur 5A). Vi fandt, at 100 uM og 1,5 mM 5-fluoruracil faldt COLO 320 DM cellelevedygtighed til 74,48 ± 4,85% (IC

25) og 52.90 ± 1,09% (IC

50) af kontrol (figur 5B).

(a) COLO 320 DM celler blev behandlet med en række Oxaliplatin (0,005-0,1 mm) eller 5-fluorouracil (0,05-2 mM) koncentrationer for at bestemme den inhibitoriske koncentration på 25% (IC25) og 50% ( IC50). (B) Celler fra COLO 320 DM samlede befolkning blev forbehandlet i 48 timer med 25 pM EPA eller SA. Bagefter blev cellerne eksponeret i 24 timer med Oxaliplatin (

IC25, 2,5

uM, IC50, 10

uM

) og 5 fluorouracil (

IC25, 100

uM, IC50, 1,5

mM

). (C) CD133 (+) celler blev magnetisk sorteret fra den samlede befolkning i COLO 320 DM og blev forbehandlet i 48 timer med 25 pM EPA eller SA og derefter udsat i 24 timer til IC25 og IC50 af Oxaliplatin og 5-fluorouracil. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre eksperimenter.

s

værdier blev beregnet med t-test på behandlede prøver vs CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001).

at afgøre, om n-3 PUFA var i stand til at øge følsomheden af ​​den samlede befolkning i COLO 320 DM celler til kemoterapi, vi belagt og forbehandlet cellerne som før med 25 uM af EPA eller SA fedtsyre. Efter 48 timer fjernede vi mediet og behandles cellerne i 24 timer med den tidligere definerede IC25 og IC50 koncentrationer for oxaliplatin og 5-fluorouracil (figur 5 A og B). Vi fandt, at EPA, men ikke SA (figur 5C, lys grå søjler), væsentligt forbedret effektiviteten af ​​begge kemoterapeutiske lægemidler (figur 5C, sorte søjler), i forhold til vehikelkontrol.

hvis definere samme behandling med 25 uM af EPA fedtsyre påvirket i samme grad CLSCs respons på kemoterapi, testede vi kemosensitivitet af magnetisk sorteret CD133 (+) COLO 320 DM celler til oxaliplatin og 5-fluorouracil. CD133 (+) CSLCs blev forbehandlet med 25 uM EPA i 48 timer, hvilket blev efterfulgt af en behandling i 24 timer med oxaliplatin eller 5-fluorouracil. Som tidligere påvist af andre [41], observerede vi, at CD133 (+) CSLCs var mere resistente over for de afprøvede antineoplastiske lægemidler (figur 5d, mørkegrå søjler) sammenlignet med den samlede befolkning (figur 5C, mørkegrå søjler). Interessant, fandt vi, at EPA forbehandling (sort bar), men ikke SA (lysegrå bar) signifikant forøget følsomhed CD133 (+) CSLCs til 5-fluorouracil, men ikke til oxaliplatin (figur 5D).

Kollektivt antyder disse data, at EPA forstærker effekten af ​​5-fluorouracil, som er en af ​​de første linje standard-of-care antineoplastiske midler, mod tyktarmskræft.

diskussion

der er