PLoS ONE: Aktivering af p38 /JNK Pathway er ansvarlig for Embelin induceret apoptose i lungekræft celler: Transitional rolle Reactive Oxygen Species

Abstrakt

naturprodukt embelin har vist sig at besidde en bred vifte af terapeutiske egenskaber, men de mekanismer, hvormed det udøver anticancer effekter endnu ikke er klare. Ved at overvåge de molekylære forandringer forbundet i den tidlige apoptotisk fase, har vi identificeret den afgørende rolle, oxidativ stress induceret MAP kinase signalering som en fremherskende mekanisme for sine anticancer effekter. Behandling af A549 lungekræft celler med embelin resulterede i forbedring af phospho-p38 og phospho-JNK niveauer så tidligt som 4h. Forbehandling af celler med specifikke inhibitorer af p38 (PD169316) og JNK (SP600125) ophævede embelin-induceret caspase-3-aktivering. Undersøgelser beskæftiger embelin i nærvær eller fravær af specifikke MAP kinase hæmmere viste, at de observerede ændringer i fosforylering niveauer af p38, JNK og ERK 1/2 skyldes alene embelin og ikke på grund af krydstale mellem MAP kinaser. Reaktive oxygenarter (ROS) spiller en afgørende rolle i embelin inducerede ændringer i MAP-kinase-phosphorylering og apoptose som forbehandling af celler med FeTMPyP afbødes denne effekt. De observerede ændringer er ikke på grund af den hæmmende effekt af embelin på XIAP som celler behandlet med SMAC-N7-Ant peptid, en specifik hæmmer af XIAP s BIR3 domænet ikke efterligne embelin inducerede apoptotiske effekter. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse klart angive den afgørende rolle, p38 og JNK veje i embelin induceret apoptose og give os nye spor til at forbedre dets terapeutiske virkning

Henvisning:. Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) Aktivering af p38 /JNK Pathway er ansvarlig for Embelin induceret apoptose i Lung Cancer Cells: Transitional rolle Reaktive oxygen Species. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10,1371 /journal.pone.0087050

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA

Modtaget: September 24, 2013; Accepteret: 17. december 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Avisetti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af sMILE projekt fra CSIR, Indien. Senior Research Fellowship til DRA fra UGC, Indien, er taknemmeligt anerkendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Embelin, en aktiv bestanddel af frugterne af

embelia ribes,

har vist sig at besidde en bredspektret af terapeutiske egenskaber, såsom anticancer, anti-inflammation, anti-diabetes, anti-fedme, analgetisk, anti-fertilitets- og anti-helminthiske [1] – [5]. Den oprindelige opdagelse af embelin som en hæmmer af XIAP i kraft af sin interaktion med BIR3 domænet og dens observerede selektivitet mod kræftceller i forhold til de normale celler inspireret os til at betragte det som en lead-stof til yderligere undersøgelser mod kræft [6]. Da mange af de kræftformer udtrykkelig forhøjede niveauer af XIAP og blive resistente over for apoptose, behandling med embelin eller i kombination med andre kendte anticancerlægemidler viste sig at sensibilisere dem mod apoptose [6], [7]. Mechanism baserede undersøgelser viser, at embelin inaktiverer NF-kB ved at hæmme nukleare transport af p65 og også vist at hæmme STAT3 fosforylering ved at inducere ekspression af PTEN [8], [9].

Specifikke bestræbelser på at identificere den præcise molekylære mål for embelin resulterede i identifikationen af ​​embelin som inhibitor mod XIAP s BIR3 domæne [6]. Desuden blev embelin også påvist at være en inhibitor af 5-lipoxigenase og mikrosomale prostaglandin E2 synthase-1 (mPGES) -1; plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) og P300 /CBP associeret faktor (PCAF) [10] – [12]. Desuden har embelin blevet vist at interferere med den oxidative phosphorylering af mitokondrier og kan undergå både redox og ikke-redox medierede mekanismer [13], [14].

Selvom affiniteten af ​​embelin mod nogle af de molekylære mål og celle- signalering mekanismer er blevet identificeret, den primære intracellulære mål ansvarlig for dens anti-cancer egenskab er endnu ikke klart, da mange af de tidligere undersøgelser er blevet udført på senere tidspunkter hvor signaltransduktionskaskaden bliver kompliceret på grund af den krydstale mellem flere celle signalering mekanismer [8], [15], [16], [17]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, søgte vi at identificere de ændringer i signalveje der er ansvarlige for anticancer ejendom embelin under den tidlige apoptotiske fase. Den foreliggende undersøgelse identificeret for første gang den centrale rolle af MAP-kinase pathway, især p38 og JNK, i embelin induceret apoptose.

Materialer og metoder

Materialer

Embelin var oprenset fra frugterne af

embelia ribes

som tidligere beskrevet [18], [19]. Minimalt essentielt medium (MEM), Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS), penicillin, streptomycin, sulforhodamin B (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, N-acetyl-L-cystein (NAC), radioimmunaktivitet nedbør assaybuffer (RIPA) og protease inhibitor cocktail blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, Tyskland. U0126 og FeTMPyP blev indkøbt fra Calbiochem. SMAC-N7-Ant peptid (AVPIAQK-P-RQIKIWFQNRRMKWKK) blev syntetiseret af GenPro Biotech, Noida, Indien. Annexin-V assaykit blev købt hos Clontech Inc, USA. Alle kemikalier til buffer præparater og finkemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich, Tyskland.

Cell Kultur og eksperimentelle betingelser

Alle cellelinier blev opnået fra ATCC, USA. A549, DU145, MCF-7 og WPMY-1-celler blev dyrket i MEM (suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 enheder /ml streptomycin), mens H9c2 og MRC-5-celler blev dyrket i DMEM (tilsat 10 % FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 enheder /ml streptomycin). Celler blev holdt i fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Tolv timer før behandlinger blev cellekulturmediet erstattet med respektive medier indeholdende 2% FBS, medmindre andet er angivet. I interventionsundersøgelser blev celler forbehandlet med de respektive MAP-kinaseinhibitorer eller antioxidanter i 1 time før tilsætning af embelin (15 uM). For forsøg med SMAC-N7-Ant peptid blev celler behandlet med 100 pM peptid i en periode på 8 timer.

cytotoksicitetsanalyse

Virkningen af ​​embelin på cellelevedygtigheden blev bestemt ved sulforhodamin B ( SRB) assay som tidligere beskrevet [20]. SRB er et aminoxanthene farvestof, som binder til basiske aminosyrerester af celler (fastgjort til vævskulturplader med trichloreddikesyre) under milde sure betingelser [20]. Kort beskrevet blev celler (i 24-brønds plader, ~ 80% sammenflydning) blev behandlet med forskellige koncentrationer af embelin i 48 timer i medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Efter afslutning af inkubationen blev cellerne fikseret ved tilsætning af 30% trichloreddikesyre til mediet ved 4 ° C i 1 time. Senere blev cellerne vasket med deioniseret vand og lufttørret. SRB (0,04%, vægt /volumen) blev tilsat til cellerne og inkuberet yderligere i 30 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev cellerne vasket med 1% eddikesyre (tre gange) og lufttørret. SRB bundet til cellerne blev solubiliseret i 10 mM Tris-base og absorbansen blev målt ved 565 nm ved anvendelse Enspire multimode pladeaflæser (Perkin Elmer).

Caspase 3 og 9 Assay

Efter ophøret inkubation blev cellulær caspase-3 og -9- aktiviteter målt under anvendelse AFC konjugeret tetrapeptid substrater som tidligere [21] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne vasket med iskold DPBS og lyseret i iskold lysepuffer (50 mM HEPES pH 7,4, 5 mM CHAPS og 5 mM DTT) [22]. Lysater blev pelleteret ned ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanter blev opsamlet. Til lysaterne lige store volumener af assaypuffer (40 mM HEPES pH 7,4, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, 4 mM EDTA) indeholdende enten caspase-3 substrat (Ac-DEVD-7- AFC, 40 uM) eller caspase-9 substrat (Ac-LEHD-7-AFC, 40 uM) blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C. Stigning i fluorescensaflæsninger grund af frigivelsen af ​​AFC blev overvåget for hver 5 min interval, X ex 400 nm og Aem 505 nm i 1 time under anvendelse Enspire multimode pladeaflæser (Perkin Elmer). Protein estimering blev udført ved Bradfords metode og de fluorescensenheder blev normaliseret til det totale protein i inkubationsblandingen.

Annexin-V /FITC Analyse for Apoptosis Salg

A549-celler dyrket på dækglas i 6- brønd plader blev behandlet med embelin i 4 timer. Efter behandling blev dækglassene vasket to gange med PBS efterfulgt af 1X bindingsbuffer. Celler blev derefter farvet med annexin-V /FITC-antistof ved inkubering i mørke i 30 minutter og vasket med 1X bindingsbuffer for at fjerne eventuelt ubundet antistof i henhold til fabrikantens protokol (Clontech Inc, USA). Formaldehyd (2%) blev tilsat til fikseres cellerne i slutningen af ​​inkubationen. Fluorescens blev overvåget ved anvendelse af et Olympus-mikroskop IX71inverted udstyret med FITC og rhodamin indstillinger igen.

genekspressionsprofilering hjælp Microarray

A549-celler blev behandlet med embelin i 4 timer. Efter behandlinger blev RNA isoleret ved anvendelse af Qiagen kit i henhold til fabrikantens anvisninger. Koncentrationen og renheden af ​​RNA udvundet blev vurderet ved hjælp af NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific). Integriteten af ​​det ekstraherede RNA blev analyseret på Bioanalyzer (Agilent). RNA blev anset for at være af god kvalitet baseret på de 260/280 værdier, rRNA 28S /18S nøgletal og RNA integritet nummer (RIN). Prøverne blev mærket under anvendelse af Agilent Quick Amp Kit. 500 ng af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af oligo-dT-primer mærket til T7-promotorsekvensen. cDNA således opnåede blev omdannet til dobbeltstrenget cDNA i den samme reaktion. Yderligere cDNA’et blev omdannet til cRNA i

in vitro

transkription trin under anvendelse af T7-RNA-polymerase-enzym og Cy3-farvestof blev tilsat til reaktionsblandingen. cRNA opnået blev renset op ved hjælp af RNeasy søjler (Qiagen Inc) og koncentrationen og mængden af ​​farvestof inkorporeret blev bestemt ved anvendelse NanoDrop. Den specifikke aktivitet for alle prøverne større end 8 pmol farvestof /ug cRNA blev anset ideel til hybridisering. Mærket cRNA (600 ng) blev hybridiseret på array’et (Tilpasset Whole Genome Humant 8 × 60k designet af Genotypisk Technology Private Limited AMADID: 027.114) under anvendelse af Gene Expression Hybridisering kit i Sure hybridiseringsbetingelser kamre (Agilent) ved 65 ° C i 16 timer. Hybridiserede objektglas blev vasket under anvendelse af Gene Expression vaskebuffere. De hybridiserede, vasket microarray objektglas blev derefter scannet på en microarray scanner (G2505C, Agilent Technologies). Dataudtræk fra billeder blev gjort ved hjælp Feature Extraction software og billeder blev kvantificeret (Version 10.7 af Agilent). Feature udvindes rå data blev analyseret ved hjælp GeneSpring GX Version 11.5 software fra Agilent. Normalisering af dataene blev udført i GeneSpring GX hjælp af 75

percentil skift. Væsentlige gener op og ned reguleret viser to gange og ovenstående inden prøverne med hensyn til kontrol prøve blev identificeret. Statistisk

t

-test p-værdi blev beregnet på grundlag af Students

t

-test algoritme. Gener blev klassificeret baseret på funktionel kategori og veje ved hjælp GeneSpring GX og Genotypisk Biointerpreter-Biologisk Analysis Software. Den microarray data er blevet indsendt til GEO-database med tiltrædelsen nummer GSE50545.

Intracellulær ROS Måling

Reaktiv ilt arter generation i celler blev bestemt ved carboxy-H2-DCFDA (Molecular Probes) som tidligere beskrevet [23]. Efter ophør af behandlingerne, blev mediet aspireret og celler i 12-brønds plader blev vasket to gange med DPBS. Serumfrie medium indeholdende 10 uM carboxy-H2-DCFDA blev sat til cellerne og inkuberet yderligere ved 37 ° C i 20 min. Endelig blev cellerne vasket to gange med DPBS før tilsætning dyrkningsmedium. Intracellulær fluorescens blev overvåget ved anvendelse af et Olympus-mikroskop IX71inverted udstyret med FITC filter indstilling.

Western blot-analyse

følgende behandlinger blev celler vasket med DPBS, forsigtigt skrabet og opsamlet ved kort centrifugering (300 g i 3 minutter) og resuspenderet i 100 pi RIPA indeholdende protease inhibitor cocktail og natrium ortho-vanadat, 10 mM (Sigma). Den resulterende cellesuspension blev passeret gennem en 26 gauge nål 10 gange for at sikre fuldstændig lyse. Lysatet blev centrifugeret ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og de klare supernatanter blev opsamlet i separate rør. Eftersom alle de anvendte antistoffer er monoklonale, i stedet for stripning og Fornyet probing immunoblots for total og phospho-specifikke proteiner er der udført immunoblotting separat for at undgå enhver baggrundssignaler. Efter protein estimering af Bradfords metode blev proteiner (25 ug) opløst på 10% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran. Blots blev probet med monoklonale antistoffer mod total og phospho specifikke antistoffer for ERK 1/2, p38, JNK (Cell Signaling Technology); og tubulin (Sigma-Aldrich). Anti-kanin Ig-G konjugeret til HRP (GE Life Sciences) og anti-muse-IgG konjugeret til alkalisk phosphatase (Sigma-Aldrich) blev anvendt som de sekundære antistoffer til MAP-kinase og tubulin antistoffer henholdsvis. Bånd blev udviklet ved hjælp af ECL Prime Western blotting reagens (GE, Life Sciences) eller BCIP /NBT reagens til tubulin (Sigma-Aldrich) og bandet intensiteter blev beregnet ved hjælp af GeneTools software (Syngene geldokumentation system).

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev udført tredobbelt, og resultaterne blev udtrykt som middel ± SD Statistisk signifikans blev bestemt ved Students

t

test med SigmaPlot software.

Resultater

Embelin udstiller Forbedret cytotoksicitet i kræftceller sammenlignet med normale celler

antiproliferative aktiviteter af embelin blev sammenlignet ved SRB-assay i udvalgte cancer og normale cellelinier (fig. 1). Celler blev udsat for stigende koncentrationer af embelin (2,5, 5, 10 og 25 uM) i 48 timer. Blandt de kræftceller, blev embelin sig at være mere toksisk for A549-celler med en IC

50 værdi på 4,4 uM, efterfulgt af DU145 og MCF7 med 6,31 og 10,66 uM hhv. Men den observerede IC

50 værdier var, forholdsvis mindre end de normale cellelinier nemlig., MRC5, WPMY-1 og H9c2 som viste en IC

50 værdi på 24,4, 10,9 og 23,4 uM hhv. Forskellen mellem den observerede IC

50 værdier af lungekræft og normale celler (4,44 ± 0,76 og 24,44 ± 5,32 uM) syntes at være større. Som A549 celler udviste forøget følsomhed over embelin, har alle yderligere undersøgelser blevet udført ved hjælp af denne cellelinie for at forstå virkemåde embelin at få nye indsigter til selektivt at målrette lunge kræftceller i forhold til deres normale celle modstykke. Derfor, for at identificere den tidlige apoptotiske fase, har vi analyseret den tidsafhængige virkning af embelin på cellulær caspase-3-aktivitet i A549-celler (fig. 2A). Embelin (15 uM) inducerede næsten 2-fold stigning i caspase-3-aktivitet så tidligt som 4 t tidsperiode, som yderligere forstærker op til 6 gange ved 8 h (fig. 2A). Annexin-V /FITC-farvning af celler behandlet med embelin (4h) klart den tidlige apoptotiske stadium af celler, som de blev kun farves med annexin-V, men ikke med propidiumiodid (fig. 2B). Men på senere tidspunkter, dvs., 18 og 24,, caspase-3 aktiviteter faldt næsten til 4 og 2 gange hvilket tyder på at apoptotiske celler kan have helt døde ved udgangen af ​​18 eller 24, eller der kan også være en mulighed for multipel celledød mekanismer på grund af den cross-talk mellem forskellige signalsystemer mekanismer.

(A) struktur af embelin (B) Celler blev behandlet med embelin for 48 timer og efter afslutning af inkubationen levedygtighed celle blev målt ved sulphorhodamin B assay og IC

50 værdier blev beregnet som nævnt i afsnittet “Materialer og metoder”. De viste data er gennemsnit ± SD af tre separate forsøg. * Angiver p 0.01as sammenlignet med kontroller

(A) A549 celler blev behandlet med 15 pM embelin for forskellige tidsintervaller.. Efter ophør af behandlingerne, blev caspase-3-aktivitet målt som angivet i afsnittet “Materialer og metoder”. (B) A549-celler blev behandlet med 15 pM embelin i 4 timer og farvet med Annexin-V /FITC og propidiumiodid som beskrevet i afsnittet “Materialer og metoder”. Fluorescens billeder blev taget med et Olympus-IX71 omvendt fluorescens mikroskop udstyret med FITC og rhodaminfilteret indstillinger. Repræsentative billeder fra tre forskellige synsfelter er vist. (C) Celler blev behandlet med en XIAP inhibitor, SMAC-N7-Ant peptid (100 uM) i 8 timer. Senere, caspase-3 og -9- aktiviteter blev målt ved hjælp af tetra-peptid substrater som beskrevet under afsnittet “Materialer og metoder”. For både (A) og (C) viste data er gennemsnittet ± SD af tre separate forsøg. ** Indikerer p 0,01 og * angiver p 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

Som embelin vides at inhibere XIAP ved binding til BIR3 domænet svarende til den i SMAC, vi næste undersøgt, om den. observerede påvirker af embelin på cellulær apoptose kan påvise en celle gennemtrængelig SMAC-N7-Ant peptid (bestående af modne SMAC s amino terminal 7 aminosyre peptid – AVPIAQK bundet til Ant peptid -RQIKIWFQNRRMKWKK, for celle permeabilitet af en prolin linker), som er kendt for specifikt at interagere med BIR3 domæne af XIAP [24], [25]. Resultater viser, at behandling af A549-celler med SMAC-N7-Ant peptid (100 uM for 8h) forøget cellulær caspase-9-aktivitet til næsten to gange i forhold til ubehandlet kontrol blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant stigning i caspase-3-aktivitet ( fig. 2C). Selvom de observerede virkninger af SMAC-N7-Ant peptid er i overensstemmelse med tidligere rapport [24], manglende caspase-3 aktivering med SMAC-N7-Ant peptid, men ikke med embelin, fik os til at undersøge de ansvarlige veje mægle embelin induceret apoptose til at få nye indsigter i sin virkningsmekanisme.

Ændring i Gene Expression profil af embelin

for at identificere de veje, der i embelin induceret apoptose, vi har analyseret ændret genekspression profil i A549-celler behandlet med embelin (15 pM til 4h). I alt 215 opreguleres og 80 nedreguleret gener blev identificeret som viste mindst to-fold forskel i forhold til kontroller med en betydning p. 0,05

Klassificering af disse gener baseret på funktionel kategori og veje ved hjælp GeneSpring GX og Genotypisk Biointerpreter-Biologisk analyse software viste, at de opreguleres gener majorly tilhøre fem forskellige veje (med mindst 4 ændrede gener i hver pathway) og antallet af gener ændret er i størrelsesordenen Wnt (4 gener) Focal adhæsion (5 gener ) p53 (8 gener) cytokin-cytokin receptor-interaktion (11 gener) MAP-kinase-vejen (16 gener) (fig 3 A-C).. Blandt de nedreguleret gener med mindst tre gener i hver pathway besidder en 2-gange ændring med en signifikans på p. 0,05 tilhørte cytokin-cytokin receptor og MAP-kinase-vejen (. Figur 3A og B)

A549 celler blev behandlet med embelin (15 uM) i 4 timer. Microarray analyse blev udført som beskrevet i afsnittet “Materialer og metoder”. Gener, der viste forskellen regulering af mindst to gange med p 0,05 blev klassificeret baseret på funktionel kategori og veje ved hjælp GeneSpring GX og Genotypisk Biointerpreter-Biologisk Analysis Software. Veje, der overvejende viste differentiel ekspression var (A) MAP kinase pathway, (B) Cytokin-cytokinreceptor interaktion og (C) p53 pathway. Dataene er blevet indsendt til GEO-database med tiltrædelsen nummer GSE50545.

På et overblik, de opnåede resultater indikerer, at blandt de ændrede veje, vises MAP kinase signalvejen til at være mere fremherskende og væsentligt påvirket med næsten 16 ændrede gener og mange af generne er enten opstrøms eller nedstrøms for p38 /JNK /ERK-vejen, såsom p53 eller regulatorer af disse pathway (fig. 3A). Fra funktionelt synspunkt, phosphorylering status af de identificerede proteiner (såsom DUSPs, GADD45A /B, p53 osv) men ikke kun deres transkriptniveauer diktere den cellulære skæbne. Ikke desto mindre, de opnåede resultater indikerede den betydelige rolle af MAP-kinase signalering og inspireret os til at fokusere på inddragelse af MAP-kinase pathway i embelin induceret apoptose.

Embelin induceret aktivering af p38 og JNK Pathway

baseret på de indledende spor opnået fra microarray undersøgelser på den potentielle rolle af MAP-kinase pathway i embelin induceret apoptose, vi søgte at undersøge nærmere om inddragelse af MAPK signalering og overvåget embelin inducerede ændringer i phosphorylering status ERK, p38 og JNK proteiner ( fig. 4). Resultater Som vist i figur-3 indikerer, at embelin (15 uM) inducerede phosphorylering af p38 til næsten 2,5 og 3 gange ved 4 og 8 timer hhv. Phospho-JNK 1/2 niveauer blev også øget til 1,2 og 1,9 fold henholdsvis 8h. Men under lignende betingelser Behandling Der var et signifikant fald i phosphorylering status ERK 1/2 (p42 og p44) og værdierne viste sig at være 0,3 og 0,2 gange mindre end den for kontrollerne (fig. 4A og B). For at forstå, om ændringerne i phosphorylering status for disse MAP-kinase-proteiner har nogen relevans for den observerede apoptose, har vi forbehandlet celler i 1 time individuelt med specifikke inhibitorer for p38 (PD169316), JNK (SP600125) og MEK (U0126) ved 5 uM koncentration efterfulgt af embelin (15 uM) i 4 timer. Embelin-induceret caspase-3-aktivitet blev signifikant inhiberet af både p38 og JNK-inhibitorer til næsten kontrolværdier (fig. 4C). Men under lignende forsøgsbetingelser MEK-inhibitor (U0126) ikke udviste nogen beskyttende virkning mod embelin induceret apoptose og heller ingen signifikant stigning i caspase-3-aktivitet blev observeret i celler behandlet med inhibitorer alene (fig. 4C). De observerede ændringer indikerer klart, at ændringer i phosphorylering status både p38 og JNK synes at være afgørende i embelin induceret apoptose. Salg

(A) A549-celler blev behandlet med 15 pM embelin til 4 og 8 timer. Total samt phosphoryleret ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin (loading control) niveauer blev målt ved Western blot som beskrevet i “Materialer og metoder” sektionen. (B) Normaliserede værdier af båndintensiteter opnået ved densitometrisk analyse af data fra (A). (C) Caspase-3-aktivitet i celler forbehandlet med eller uden U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 uM) i 1 time efterfulgt af embelin (15 uM) i 4 timer. Styreværdier normaliseres til 1 og dataene anførte er middelværdien ± SD af tre separate forsøg. * Angiver p 0,05 i forhold til kontrol og # indikerer p. 0,05 i forhold til embelin behandlede celler

For at afgøre, om de observerede ændringer i MAPK phosphorylering er på grund af embelin behandling alene eller på grund af den regulerende virkning af en MAP-kinase over den anden MAPK s, har vi behandlet cellerne individuelt med embelin (15 uM) i nærvær og fravær af MEK-inhibitor (U0126, 5 uM) eller p38-inhibitor (PD169316, 5 uM) eller JNK-inhibitor (SP600125, 5 uM) i 4 timer og analyseret phosphoryleringsniveauerne fra alle de tre MAP-kinaser (fig. 5). MEK inhibitor U0126 hæmmer dens nedstrømsmål ERK. p38-inhibitor, PD169316 og JNK-inhibitor, SP600125 specifikt inhiberer p38 og JNK aktivitet henholdsvis ved kompetitiv binding til ATP-binding lommer forhindrer phosphoryleringen af ​​proteiner nedstrøms, men som sådan ikke medfører det ringere phosphoryleringsniveauerne af enten p38 eller JNK [26 ], [27]. Resultaterne indikerer, at behandling af celler med MEK hæmmer (U0126) hæmmede phospho-ERK 1/2, men ændrede ikke niveauerne af embelin induceret phospho-p38 og phospho-JNK-niveauer. Tilsvarende havde behandling af celler med p38-inhibitor (PD169316) ikke påvirker niveauerne af phospho-JNK og phospho-ERK forårsaget af embelin. Også, behandling af celler med JNK-inhibitor (SP600125) ikke påvirker niveauerne af phospho-p38 og phospho-ERK i nærvær eller fravær af embelin (fig. 5). De ovenstående resultater indikerer, at de observerede ændringer i phosphorylering niveauer af p38, JNK og ERK synes at være medieret direkte ved embelin behandling, men ikke på grund af den krydstale mellem MAP-kinaser.

A549-celler blev præ -behandlede med eller uden U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 uM) i 1 time efterfulgt af embelin (15 uM) i 4 timer. Total og phosphorylerede niveauer af ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin (loading kontrol) blev påvist ved Western blotting som beskrevet i “Materialer og metoder” sektionen.

ROS medierer MAP kinase forordning ved Embelin

MAPK proteiner er kendt for at være reguleret af oxidativ stress [28]. Desuden har benzoquinon struktur embelin blevet påvist at danne semiquinon radikal ved redox mekanisme, som i sidste ende fører til reaktive generation oxygen arter [13], [29]. Disse observationer tyder på en vigtig rolle for ROS i embelin induceret apoptose. At evaluere de pro-oxidant egenskaber embelin undersøgte vi dens virkninger på dannelsen af ​​oxidativt stress i A549-celler. De intracellulære ROS genereret af embelin blev påvist ved en forøgelse i intracellulær fluorescens af DCF (fig. 6). Embelin (15 uM) inducerede ROS-generering på en tidsafhængig måde med næsten 5 og 10 gange stigning i forhold til ubehandlede kontroller ved slutningen af ​​2 og 4 timer (fig. 6). Forbehandling af celler med antioxidanten, FeTMPyP (10 uM) eller N-acetyl-L-cystein (NAC) (10 mM) signifikant inhiberede embelin-induceret DCF-farvning til den for kontrolværdier (fig. 6).

(A) A549-celler blev forbehandlet med eller uden FeTMPyP (10 uM) eller NAC (10 mM) i 1 time efterfulgt af embelin (15 uM) i 4 timer og ROS-generering blev påvist ved DCF-farvning som beskrevet i “Materialer og metoder” sektion. Cellular fluorescens blev taget med et Olympus-IX71 omvendt fluorescens mikroskop udstyret med FITC filter indstillinger. (B) gennemsnitlige fluorescensintensitet fra tre forskellige synsfelter blev opnået under anvendelse ImageJ software. * Angiver p 0,05 sammenlignet med kontrol og # indikerer p. 0,05 sammenlignet med embelin behandlede celler

Vi vurderede virkning af yderligere embelin-induceret ROS på MAPK signalering i nærvær og fravær af antioxidanten, FeTMPyP (fig. 7). Resultaterne indikerer at embelin induceret ROS er ansvarligt for de observerede ændringer i de phospho-proteinniveauer af p38, JNK og ERK 1/2 som forbehandling af celler med FeTMPyP ophævet denne effekt (fig. 7A). I overensstemmelse med de ovenstående resultater, forbehandling af celler med FeTMPyP (10 uM) inhiberede også de apoptotiske virkninger af embelin indikerer det målte MAP kinase signalering skyldes forøget ROS spiller en central rolle i embelin-induceret apoptose (fig. 7B).

A549-celler blev forbehandlet med eller uden antioxidanten FeTMPyP (10 uM) i 1 time efterfulgt af embelin (15 uM) behandling i 4 timer. (A) cellulære niveauer af total og phosphoryleret ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin blev påvist ved Western blot efterfulgt af kemiluminescensdetektion som beskrevet under afsnittet “Materialer og metoder”. (B) Under lignende eksperimentelle betingelser som (A), blev cellulære caspase-3 aktivitet målt som beskrevet under “Materialer og metoder” afsnittet. Viste data er gennemsnittet ± SD af tre separate forsøg. * Angiver p 0,01 i forhold til at styre og # indikerer p 0,05 i forhold til embelin behandlede celler

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi rapportere, at oxidativ stress induceret MAPK. signalering spiller en vigtig rolle i embelin induceret apoptose. Analyse af genekspression profilering af microarray undersøgelser indikerede mulig inddragelse af MAP-kinase pathway i A549 celler behandlet med embelin til 4h. Forbehandling af celler med specifikke inhibitorer af enten p38 eller JNK signifikant inhiberede embelin induceret caspase-3-aktivering samt annulleret embelin-inducerede ændringer i phosphoryleringsniveauerne af p38, JNK og ERK 1/2 MAP-kinaser. Reaktive oxygenarter (ROS) synes at spille en central rolle mellem embelin og MAP-kinase-vejen. Alle de observerede virkninger af embelin ikke skyldes inhiberingen af ​​XIAP som behandling af celler med celle permeable SMAC-N7-Ant peptid, som binder til BIR3 domænet af XIAP påvirkede ikke cellulær caspase-3-aktivering.

Den naturlige produkt, embelin, er blevet mere opmærksom i den seneste tid for sine anticancer egenskaber. Endnu vigtigere er det blevet påvist at have mere selektivitet over cancerceller sammenlignet med de normale celler (6). Selv i det foreliggende arbejde, vi observerede en lignende tendens, og en signifikant forskel i IC

50 værdier af embelin var tydelig mellem lungekræft og normale cellelinier (fig. 1). Selvom embelin blev indledningsvis identificeret som værende en inhibitor af XIAP ved hjælp af dens interaktion på BIR3 domæne, efterfølgende undersøgelser vist de direkte

in vitro Salg virkninger embelin på den oxidative phosphorylering af mitokondrier, inhibering af 5-lipoxygenase (5 -LO) og mikrosomale prostaglandin E2 synthase-1 (mPGES) -1 og inaktivering af plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) [10], [11]. Men identifikation af den primære intracellulære mål, som er ansvarlig for anticancer egenskab embelin tiden vil kunne hjælpe i den strukturelle forfinelse af embelin til at forbedre dets effektivitet og selektivitet.

For nylig forskellige undersøgelser er blevet udført for at forstå virkningsmåde embelin og det er blevet påvist at have en rolle i inaktiveringen af ​​NF-kB, inhibering af STAT3 signalering via proteintyrosinphosphatase PTEN, lysosomal destabilisering og AKT og mTOR pathways [8], [9], [15] , [30], [31]. Men om alle de observerede virkninger er indbyrdes afhængige eller uafhængige af hinanden, er endnu ikke klart, da mange af de rapporterede forsøg blev udført til en fast varighed på enten 24 eller 48 timer [8], [10], [16], [17 ].

data fra microarray studier i de tidlige stadier af embelin induceret apoptose pegede os til de ændringer i reguleringen af ​​transkriptionsfaktorer downstream at MAPK proteiner (fig. 3). I den foreliggende undersøgelse har vi identificeret en fremtrædende rolle af MAP-kinase-vejen, (forøgede niveauer af phospho-p38 og phospho-JNK) i embelin-induceret apoptose.