PLoS ONE: Discovery og Validering af DNA hypometylering Biomarkører for leverkræft Brug HRM-Specific Probes

Abstrakt

Dårlig prognose for hepatocellulært carcinom (HCC) i forbindelse med sene diagnose nødvendiggør udviklingen af ​​tidlige diagnostiske biomarkører. Vi har tidligere afgrænset landskabet af DNA methylering i HCC patienter Unraveling betydningen af ​​promotor hypometylering i aktivering af kræft- og metastase-kørsel gener. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at afprøve gennemførligheden at gener, der er hypomethylated i HCC kunne tjene som kandidat diagnostiske markører. Vi bruger høj opløsning smeltepunkt analyse (HRM) som et simpelt translaterbar PCR-metode til at definere methylering i kliniske prøver. Vi testede syv regioner valgt fra liste af gener hypomethylated i HCC og viste, at HRM-analyse af flere af dem adskiller methylering i leverkræft prøver fra normal tilstødende lever og kronisk hepatitis i Shanghai-området. Sådanne områder blev identificeret inden for initiativtagere til neuronal membran glycoprotein M6-B (GPM6B) og melanom antigen familie A12 (MAGEA12) gener. Forskelle i HRM i immunglobulinsuperfamilien Fc-receptor (FCRL1) adskilt invasive tumorer fra mindre invasiv HCC. De identificerede biomarkører differentieret HCC af kronisk hepatitis i andet sæt prøver fra Dhaka. Selv hovedlinjerne i DNA methylering diagnostik i kræft er på hypermethyleret gener, vores undersøgelse for første gang illustrerer den potentielle anvendelse af hypomethylated gener som markører for solide tumorer. Efter yderligere validering i en større kohorte, den identificerede DNA hypomethylated regioner kan blive vigtige kandidat biomarkører for leverkræft diagnose og prognose, især i populationer med høj risiko for HCC udvikling

Henvisning:. Stefanska B, Bouzelmat A, Huang J, Suderman M, Hallett M, Han ZG, et al. (2013) Discovery og Validering af DNA hypometylering Biomarkører for leverkræft Brug HRM-specifikke prober. PLoS ONE 8 (8): e68439. doi: 10,1371 /journal.pone.0068439

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 18, 2013; Accepteret: 29 maj 2013; Udgivet: 7. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Stefanska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra Ministére du Developpement Economique, de l’Innovation et de l’Eksport (MDEIE) program af regeringen i Quebec (nr 215004, til MS), den canadiske Institute of Health Research (nr MOP-42.411, til MS) og Internationalt Center for Diarrésygdomme Research, Bangladesh (ICDDR, b). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

afvigelser i epigenetiske modifikationer, især i DNA methylering mønstre, er blevet forbundet med kræft udvikling og progression i mange undersøgelser i sidste årtier [1], [2], [3]. Hypermethylering af tumorsuppressorgener forbundet med transkriptionel inaktivering, global DNA demethylering forbundet med genom omrokeringer og ustabilitet, og for nylig rapporteret promotor hypometylering knyttet til aktivering af onkogener og prometastatic gener er kendetegnende for næsten alle former for kræft [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. DNA hypermethylering af tumorsuppressorgener har vist sig at have diagnostisk potentiale i flere kræftformer [6], [7], [8], men vores seneste optrævling af det brede anvendelsesområde for hypometylering i leverkræft foreslog, at potentielle biomarkører kan findes i hypomethylated gener, der spiller en kritisk rolle i kørsel cancer og cancer metastase [4]. Identificering pålidelige biomarkører for HCC er af særlig betydning, eftersom forsinket indtræden af ​​kliniske symptomer udgør en sen diagnose og høj dødelighed. Det anslås, at tidlig påvisning af HCC øger hærdningshastigheden fra 5% til 80% [9].

Vi har tidligere anvendt et genom-strategi at afgrænse DNA promotor- methylering profiler i HCC tumorer og afslørede næsten 2.000 gener, hvis promotorer blev hypomethylated i tumorer sammenlignet med matchede tilstødende normale væv [4]. Disse gener blev impliceret i biologiske processer og veje afgørende for udviklingen af ​​kræft og invasion, som peger på en vigtig funktionel rolle af de observerede ændringer. Hypometylering blev observeret i flere gen familier i hele kromosomer. Spørgsmålet opstod, om det specifikt vil markere tumorer og differentiere tumor prøver fra raske væv. I vores tidligere arbejde har vi fokuseret på sammenligning mellem ulige gennemsnitlig DNA-methylering tværs af hele promotor og anti-korrelerede ændringer i genekspression. Vi analyseret i detaljer 230 gener, der blev hypomethylated og induceret i HCC tumorer. Størstedelen af ​​disse gener faldt i en kategori af promotorer med højt CpG-indhold. I den foreliggende undersøgelse på DNA hypometylering biomarkører for leverkræft, vi først udvalgte gener, der var kraftigt hypomethylated i HCC prøver sammenlignet med matchede hosliggende normalt væv (≥2-gange ændring i promotor-methylering baseret på microarray analyse,

P

10E-4). Denne gruppe af gener blev derefter screenet for mest konsekvent hypomethylated sonde (200-400 bp region, ≥1.5-gange ændring,

P

10E-3) på tværs af de patienter, som fastlægges af microarray analyse. For at øge den funktionelle relevans af potentielle biomarkører, vi efterfølgende begrænset denne liste til 47 gener, der blev induceret i HCC tumorer målt ved Affymetrix arrays (≥1.5-gange ændring,

P

0,05, tabel S1 ). Under hensyntagen til ændringer i promotor methylering, udtryk, og omfanget af demethylering af de specifikke prober, har vi valgt syv gener, der demonstrerede den højeste promotor hypometylering, de mest hypomethylated sonder på tværs af patienter og høj induktion af udtryk. Desuden begrænsede vi listen for at gener med kræftrelaterede funktioner baseret på offentligt tilgængelige datasæt som beskrevet nedenfor. Disse syv hypomethylated gener som anført i tabel 1 blev udvalgt til at identificere og optimere specifikke prober, hvis forskellen methylering ville skelne tumorer fra normale væv ved hjælp af High Resolution Melting analyse (HRM). Den HRM analyse er en simpel PCR-metode umiddelbart overføres til klinisk indstilling til påvisning af forskelle i DNA methylering mønstre [10]. Denne metode kræver behandling af DNA med bisulfit der konverterer cytosinrester til uracil forlader 5-methylcytosin rester upåvirket. Efter amplifikation resulterer det i ændringer i DNA-sekvensen, hvor uracil omdannes til thymidin og 5-methylcytosines forbliver som cytosiner. Umethyleret DNA amplicon, der indeholder thymidin i stedet for cytosin inden CpG-sekvenser udviser forskellige smeltepunkter egenskaber end methyleret DNA. Efter primer optimering, tre sonder svarende til tre gener

neuronal membranglycoprotein M6-B Hotel (

GPM6B

),

melanomantigenet FAMILY A 12 Hotel (

MAGEA12

), og

immunglobulin Fc-receptor Hotel (

FCRL1

), viste sig at differentiere HCC fra tilstødende normale væv og /eller invasive tumorer fra ikke-invasive tumorer i en kinesisk sæt prøver som samt HCC af kronisk hepatitis B-infektion (CHB) i prøver fra Bangladesh.

GPM6B

er involveret i neural udvikling og regulering af knogledannelse [11], [12]. Ekspression af dette gen blev vist i genom bred transkriptom profilering til at tjene som en indikator af hjernetumorer [13], [14] og lymfoide leukæmier [15]. Høj ekspression af

MAGEA12

, et medlem af onkogen

MAGE

familie, blev vist at være associeret med blærecarcinom [16], melanom [17], brystcancer [18] og mundtlige planocellulært carcinom [19].

FCRL1

er en celle-overflade membranprotein fortrinsvis udtrykkes på B-celler regulerer B-celleaktivering og differentiering [20]. Høj ekspression af dette gen blev observeret i metastatiske melanomer [21] og i forskellige typer af leukæmier [20]. Ingen af ​​disse gener eller deres tilstand af methylering er tidligere forbundet med HCC.

MAGEA12

blev vist før for at blive undertrykt i normale celler ved promotor methylering og aktiveret i kræftceller ved demethylering [22], [23], mens rollen som

GPM6B

og

FCRL1

methylering i promotoraktivitet blev ikke tidligere testede. Vores nuværende undersøgelse validerer for første gang overekspression af

GPM6B

,

MAGEA12

og

FCRL1

i HCC patienter i forhold til normalt væv og undersøger DNA methylering i deres initiativtagere som en potentiel diagnostisk markør for leverkræft. Da tidlig diagnosticering af HCC øger kur sats og overlevelse, kunne de identificerede epigenetiske kandidat biomarkører have en indvirkning på leverkræft terapi resultat efter validering i en større kohorte.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke, og den etiske komité fra berørte institutioner (kinesiske National human Genome center på Shanghai, Kina og Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh) godkendte undersøgelsen .

patienter og vævsprøver

Kræft og normale tilstødende vævsprøver blev opnået fra 12 patienter med HCC og 1 patient med inflammatorisk pseudotumor (kontrol patient) i kinesiske National human Genome center på Shanghai, Kina (Dr. Ze-Guang Han) (tabel 2). Bangladeshiske kohorte bestod af 4 HCC patienter og 4 CHB patienter i Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh (tabel 2). HCC prøver blev opnået ved ultrasonogram guidet fin nål aspiration, mens CHB prøverne blev opnået ved per-kutant leverbiopsi hjælp Tru-cut biopsi nål. I begge tilfælde blev anvendt lokalbedøvelse.

DNA-isolering og bisulfitbehandling af DNA

DNA fra cancerøse, normale tilstødende, og CHB prøver blev isoleret ved anvendelse af standard phenol-chloroform ekstraktion teknik. Omdannelse med bisulfit blev udført som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt 2 pg DNA blev lineariseret med EcoRI og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C efterfulgt af oprensning under anvendelse af Quick Clean PCR Purification Kit (genscript) ifølge fabrikantens protokol. Det oprensede DNA blev derefter denatureret med 3M NaOH og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C. Frisk fremstillet 3.6M Natriumbisulfit /1 mM hydroquinon blanding (pH 5,0) blev tilsat til denatureret DNA og inkuberet i 2 minutter ved 95 ° C og derefter 8 timer ved 55 ° C efterfulgt af 2 minutter ved 95 ° C og 2 timer ved 55 ° C. DNA-prøver blev derefter afsaltet og oprenset (Quick Clean PCR Purification Kit, genscript). Det oprensede DNA blev igen denatureret med 3M NaOH og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C. Opløsningen blev neutraliseret ved tilsætning af ammoniumacetat til en endelig koncentration på 10 M, og DNA’et blev udfældet med 95% ethanol, og pellet blev resuspenderet i 50 pi destilleret vand.

PCR-amplifikation af bisulfit omdannede DNA

Amplifikationsreaktioner indeholdt 25 ug behandlet med bisulfit genomisk DNA, 0,4 uM forward og reverse primere, der er opført i tabel S2, 10 pi 10 × Light Cycler 480 SybrGreen i Master (Roche) i et endeligt volumen på 20 pi. Amplifikation blev udført i en thermocycler anvendelse af følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikation i 40 cykler ved 95 ° C i 1 min, annealing temperatur i 2 min 30 s, 72 ° C i 1 min, og den endelige forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Som vist i tabel S2, var uden for og de indlejrede primersæt anvendes til flere prober med henblik på at forbedre effektiviteten af ​​amplifikation. Det amplificerede DNA blev derefter underkastet høj opløsning smeltning (HRM).

Høj opløsning smeltning analyse (HRM)

Det amplificerede DNA blev overført til Light Cycler 480 QPCR instrument (Roche), som muliggør HRM. Prøver blev gradvist opvarmet fra 40 ° C i 1 min til 60 ° C i 15 s og endelig DNA blev smeltet ved 95 ° C i 15 s. Smeltningen af ​​PCR-produktet inducerer et fald i fluorescensen af ​​SybrGreen siden SybrGreen som en DNA indlejringsfarvestof bliver frigivet fra dobbeltstrenget DNA efter dissociation. Den fluorescens-signalet er erhvervet under den smeltende fase og analyseret af Light Cycler 480 software. Temperaturen af ​​et smeltetop af DNA amplicon er defineret ved midtpunktet af smeltefasen, ved hvilken hastigheden af ​​ændringer i fluorescens er den største. Dette smeltepunktet afhænger af sekvensen og længden af ​​amplikonet og er specifik for hvert produkt. Som følge omdannelse med bisulfit methyleret DNA efter amplifikation indeholder CG basepar, smeltetemperaturen af ​​et ikke-methyleret version, der indeholder TA basepar er anderledes. Den methylerede amplicon smelter ved højere temperatur, end når ikke-methyleret og prøver af forskellig methyleringsstadiet kan adskilles ved at sammenligne smeltekurven toppe. Under anvendelse 0% og 100% methyleret kontrol-DNA, viste vi, at de testede prober afslører klare forskelle mellem ikke-methyleret og fuldt methyleret DNA. 0% methyleret kontrol blev genereret under anvendelse af hele genomet amplificering kit (Sigma), hvorimod 100% kontrol blev skabt af

in vitro

methylering katalyseret af SSSI methyltransferase i nærvær af en methylgruppe donor S-adenosyl-L-methionin ( SAM). Smeltekurveanalyse toppe i HCC tumorer blev sammenlignet med gennemsnittet af smeltende toppe i normale tilstødende væv fra 7 personer med ikke-invasiv HCC. Denne gennemsnitlige kurve blev kaldt her som normal tilstødende referenceværdier (NorAdjRef).

Pyrosequencing

Specifik bisulfit omdannet promotorsekvenser blev amplificeret med Hotstar Taq DNA-polymerase (Qiagen) under anvendelse af biotinylerede primere, der er opført i tabel S2. De biotinylerede DNA-strenge blev pyrosequenced i PyroMarkTMQ24 instrument (Biotage, Qiagen) som tidligere beskrevet [25]. Data blev analyseret under anvendelse PyroMarkTMQ24 software.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR (QPCR)

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ifølge fabrikantens protokol. 1 ug totalt RNA tjente som en skabelon for cDNA-syntese ved anvendelse af 20 U AMV-revers transkriptase (Roche Diagnostics), som anbefalet af fabrikanten. QPCR reaktionen blev udført i Light Cycler 480 maskine (Roche) under anvendelse 2 pi cDNA, 400 nM forward og reverse primere, der er opført i tabel S2 og 10 pi Light Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) i et endeligt volumen på 20 pi . Amplifikation blev udført under anvendelse af følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikation i 60 cykler ved 95 ° C i 10 s, annealing temperatur i 10 s, 72 ° C i 10 s, og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. Kvantificering blev udført ved hjælp af en standardkurve og analyseret af Roche LightCycler 480 software.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af uparrede tosidet

t

-test eller Mann -Whitney

U

test. Mann-Whitney

U

test blev anvendt til sammenligninger mellem to grupper, hvor stikprøvestørrelser var lille, og det var derfor vanskeligt at verificere fordelingsmæssige antagelser. I hvert tilfælde er testen ledsages af et scatter plot, der viser alle værdier, der anvendes i testen. Middelværdier er angivet ± S.D. Hvor det er nødvendigt,

P

-værdier er korrigeret for flere forsøg med Bonferroni korrektion. For sammenligninger af fire vs. fire prøver (bangladeshiske kohorte), brugte vi også en permutation test, hvor dataene blev blandet 10.000 gange og teststørrelsen blev genberegnet for hver shuffle. R software miljø til statistisk databehandling blev anvendt til alle statistiske analyser undtagen permutationstest hvor Resampling Stats add-in til Excel software blev anvendt (Stan Blank, Charles Seiter, Peter Bruce og Resampling statistik, Inc. 2000, Institut for Statistik Uddannelse, USA).

Resultater

Test og identifikation af kandidat hypomethylated regioner i HCC ved HRM-analyse

målet med vores undersøgelse var at identificere og optimere hypomethylated regioner i HCC som kunne differentiere HCC fra normalt væv ved hjælp HRM. Vi anvendes flere kriterier, som vi forventede vil øge sandsynligheden for, at proberne ubikvitært differentielt methyleret i HCC. Først valgte vi syv gener (anført i tabel 1), der blev identificeret i vores forrige skærm af hypomethylated gener i leverkræft hjælp methylerede DNA immunoprecipitation (MeDIP) og hybridisering til genom-dækkende promotor oligonucleotid arrays. For det andet, de genpromotorer indeholdt sonder med en gennemsnitlig fold reduktion i methylering mellem HCC og normal lever højere end eller lig 2 og var yderst statistisk signifikant (

P

10E-4). Tredje, hypomethylering af deres promotorer var også forbundet med overekspression i næsten alle de patienter, der blev undersøgt tyder robusthed og funktionel relevans af disse DNA demethylering ændringer i HCC (Figur 1A-C). For det fjerde, en analyse af deres funktioner er baseret på offentligt tilgængelige datasæt såsom Gene Ontology (GO), Kegg, og NCBI afslører biologiske processer og veje, der er afgørende for carcinogenese, såsom regulering af cellecyklus, celleadhæsion, celle-celle signalering, spredning og differentiering (tabel 1). For det femte blev generne tidligere var forbundet med humane kræftformer, især

MAGEA12

[16], [17], [18], [19] dog kun

DISKE LARGE (Drosophila) homolog-protein 5 Hotel (

DLGAP5

) og

MATRIX metallopeptidasen 1 Hotel (

MMP1

) er tidligere blevet rapporteret at være opreguleret i HCC tumorer [26], [27] . Sjette, brug af offentligt tilgængelige udtryk microarray data (Oncomine), viser vi, at tre af de gener, der indeholdt prober optimeret til HRM analyse (se punkt nedenfor) viser øget ekspression i mange forskellige typer cancer, såsom leukæmi, ovariecancer og pancreascancer (

GPM6B

FCRL1

), nyre- og kolorektal cancer (

GPM6B

og

MAGEA12

), HCC og brystkræft (

MAGEA12

FCRL1

), testikelkræft og melanom (signifikant overekspression af

GPM6B

i begge kræftformer og

MAGEA12

i melanom) (Figur 1D-F). Dataene er i overensstemmelse med en generel rolle for disse proteiner i mange forskellige typer af kræft og foreslå deres grundlæggende rolle i cancer progression og /eller metastaser.

(A) En Heatmap viser log

2 differential methylering ( M) og ekspression (E) probe intensiteter for de angivne syv gener i hver HCC patientprøver målt ved microarrays. (B, C) Box plots af disse methylering (B) og udtryk (C) forskelle i HCC patienter (log

2 [cancer-normal]). Negative methylering forskelle indikerer hypometylering i HCC og positive udtryk forskelle afspejler højere udtryk i tumorprøver sammenlignet med matchede tilstødende normale væv. (D, E, F) Cancer genekspression niveauer opnået fra microarray data for

GPM6B

(D),

MAGEA12

(E), og

FCRL1

(F). Den normale versus tumor genekspression data blev indhentet fra Oncomine og præsenteres som log

2-transformerede median centreret pr array, og SD-normaliseret til 1 pr array. Alle de præsenterede ændringer er statistisk signifikant (

P

0,05), bortset fra

MAGEA12

i testikelkræft og

FCRL1

i testikelkræft og melanom. (G, H, I) Smeltning kurver og smeltning curve toppe for 0% og 100% denatureret kontrol-DNA forstærkes for

GPM6B

(G),

MAGEA12

(H) og

FCRL1

(i) sammen med et kort over promotorer af de testede gener der flankerer proberne udvalgt til HRM analyse. Vandrette pile angiver positionen af ​​primere anvendt til HRM. HRM til 0% og 100% methyleret kontrol-DNA er vist. CpG websteder, der er beliggende inden for forstærket sonde er cirklede og nummereret. Den formodede transkriptionsfaktorbindingssites er angivet som forudsagt af TransFac.

Tre prober svarende til

GPM6B

,

MAGEA12

, og

FCRL1

optimeret til HRM analyse af differentiel methylering i HCC

Adskillige methylering uafhængig primersæt blev underkastet optimering for HRM analyse (se primersekvenser i tabel S2). Kontrol-DNA, der blev methyleret ved 0% og 100% (standarder) blev amplificeret med primerne og smeltet i realtid. Smeltningen mønster af amplikoner blev etableret og analyseret. Smeltekurver for begge standarder blev plottet i samme diagram og udviste forskellige temperaturer på smeltende toppe (figur 1G-H). Vi screenede derefter 12 HCC og 12 normale leverprøver fra Shanghai kohorten for methylering stat inden alle 7 sonder bruger designede primere. Fire sonder udstillet høj heterogenitet af methylering mønster i tumorer, hvilket blev afspejlet i flere smeltende toppe i HRM-analyse for en enkelt prøve. Tre andre prober til

GPM6B

,

MAGEA12

, og

FCRL1

viste en klar én-peak smeltning mønster og blev anvendt til yderligere analyser som kandidat DNA methylering markører. Overekspression af disse gener blev vist i andre kræftformer, f.eks højere udtryk for

GPM6B

var forbundet med hjernetumorer [13], [14] og lymfoide leukæmier [15],

MAGEA12

var op -regulated i blærecarcinom [16], melanom [17], brystkræft [18] og oral pladecellekræft [19], mens

FCRL1

induktion blev observeret i metastatiske melanomer [21] og i forskellige typer af leukæmier [20].

Differential HRM mønster af amplikoner i

GPM6B

,

MAGEA12

, og

FCRL1

adskiller HCC fra normal lever

HRM analyse af tumorer (n = 12) og tilstødende normale væv (n = 12) blev udført. Smeltekurveme blev afbildet og temperaturen af ​​smelte- top blev beregnet som beskrevet i fremgangsmåderne. Som den methylerede DNA amplicon smelter ved højere temperatur end amplikoner fra umethyleret bisulfit omdannet DNA, kan prøver af forskellige methylering differentieres ved at sammenligne smeltekurven toppe. Det er en almindelig praksis at sammenligne tumorer med patologisk normal tilstødende væv fra den samme patient. Det kan dog resultere i falske negative resultater siden såkaldt normal lever kan allerede transformerede molekylært og viste ændrede DNA methyleringsmønstre uden at udvise ændringer i histopatologi, især i patienter med stærkt invasive tumorer. Fem patienter i stikprøven sæt blev diagnosticeret med invasiv HCC hvor portal vene tumor blodprop (PVTT) blev opdaget. Vi antog, at den normale tilstødende leveren kan allerede ændret hos disse patienter. Vi skabte derfor en normal referencekurve (NorAdjRef) ved at midle smeltekurver for alle tilstødende normale væv undtagen patienter med PVTT. Vi foreslår, at en sådan henvisning kurve kunne forbedres yderligere ved bl.a. HRM resultater fra et stort udvalg af ikke-kræft levervæv og bruges som en generel standard for sammenligning for nye tilfælde, især når der er mistanke om invasion i tilstødende væv. Faktisk methylering af

GPM6B

sonde i tumoren prøven fra patient 5 var den samme som i dens tilstødende normalt væv, men det var forskellige fra NorAdjRef bekræfter brugen af ​​et midlet normalt som en standard til sammenligning (figur 2A , figur 3A). Patienter 1-6 med PVTT udstillet samme methylering stat inden

FCRL1

sonde, når deres tumorer blev sammenlignet med deres matchede tilstødende normale væv, men igen de HRM profiler var forskellige fra NorAdjRef (Figur 2C). Således ved hjælp af en gennemsnitlig normal standard, vi var i stand til at kalde disse prøver som HCC, som ville have været umuligt, hvis vi brugte det tilstødende væv som reference.

(A-C) Smeltepunkt kurve toppe af

GPM6B Hotel (A),

MAGEA12

(B) og

FCRL1

(C) amplikoner i 12 tumorprøver og 12 matchede tilstødende normale væv. Toppene for HCC med PVTT (PVTT-HCC), HCC uden PVTT (ikke-PVTT-HCC), og pseudotumor fag blev sammenlignet med gennemsnittet af normale tilstødende væv fra ikke-PVTT patienter (NorAdjRef). I det andet panel, blev smeltende toppe for tumor prøver af HCC patienter med PVTT plottet sammen med gennemsnittet af matchede tilstødende normale væv fra disse patienter, mens den femte panel viser gennemsnittet af HCC med PVTT og HCC uden PVTT i sammenligning med NorAdjRef. Temperatur værdier for smeltende toppe i hver patient er vist i scatter plots og i tabel 3.

(A-C) smeltekurveanalyse toppe af

GPM6B Hotel (A),

MAGEA12

(B) og

FCRL1

(C) amplikoner i tumorprøver i sammenligning med matchede hosliggende normalt væv fra den samme patient. (D) Pyrosequencing af

GPM6B

region for patient 9 (HCC) og patient 13 (pseudotumor). Den overdækkede område overlapper med analyseret i HRM sekvens.

Vi har optimeret tre specifikke 150 bp DNA-regioner, der kunne differentiere HCC fra ikke-transformeret væv ved hjælp HRM. En region i

GPM6B

promotoren blev hypomethylated i tumorer af alle patienter sammenlignet med NorAdjRef (figur 2A). Alle tumorer blev klart adskilt og identificeret som HCC baseret på temperatur værdier af smeltende toppe (tabel 3,

P

= 3.97E-5, justeret

P

= 1.17E-4, Mann-Whitney

U

test). Patienter med ikke-invasiv HCC (ikke-PVTT) var mere hypomethylated forhold til invasive tumorer som forskellen i smeltetoppe mellem kræft og NorAdjRef indikerer. Således kunne amplikon også differentiere HCC uden PVTT fra HCC med PVTT, i hvert fald i det lille antal undersøgte her tilfælde (tabel 3, figur 2A-diagrammer 3 og 5,

P

= 0,03, justeret

P

= 0,06, Mann-Whitney

U

test). HRM-analyse af en region i

MAGEA12

promotor differentieret alle HCC uden PVTT og 2 ud af 5 HCC med PVTT fra NorAdjRef (figur 2B, 3B,

P

= 1.7E-4, justeres

P

= 5.1e-4, Mann-Whitney

U

test). Tumorprøver fra patienter 5, 6 og 7, der blev diagnosticeret med PVTT udviste samme methylering niveau som deres matchet normal tilstødende væv (figur 2B-diagram 2, figur 3B) og var ikke skelnes enten fra NorAdjRef (Figur 2B-diagram 1) . Den gennemsnitlige smeltning peak temperatur værdi for HCC uden PVTT var lavere end for den gennemsnitlige HCC med PVTT angiver hypometylering inden

MAGEA12

sonde i ikke-invasive tumorer (tabel 3, figur 2B-diagram 5), selv om ændringen var ikke statistisk signifikant i vores sæt prøver (

P

= 0,64, Mann-Whitney

U

test). HRM for

FCRL1

sonde differentierer HCC med PVTT fra NorAdjRef (

P

= 2.5E-3, justeret

P

= 7.5e-3, Mann-Whitney

U

test), men ikke HCC uden PVTT fra NorAdjRef (

P

= 0,11, Mann-Whitney

U

test) (Figur 2C-diagram 1).

FCRL1

sonde hypomethylated i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (tabel 3, figur 2C-diagram 5,

P

= 2.5E-3, justeret

P

= 7.5e-3, Mann-Whitney

U

test) og derudover adskiller disse to slags tumorer. Interessant, selvom vi pænt differentiere ved HRM PVTT prøver fra NorAdjRef, var der ingen relevant forskel, når vi sammenlignet

FCRL1

methylering tilstand i hver PVTT tumor prøven med matchede tilstødende normale væv fra den samme patient, bortset fra patient 7 (tabel 3, figur 2C-Diagram2, figur 3C). Dette antyder, at DNA-methylering ændringer forekom allerede i det tilstødende væv i disse lever. Patient 13, som blev diagnosticeret med liver pseudotumor viste ingen forskel i HRM smelteprofilen med sin egen tilstødende væv og NorAdjRef i alle tre prober (tabel 3, figur 2-diagrammer 4,

P

0,05). Vi bekræftede denne observation ved pyrosekventering af

GPM6B

region for HCC emne 9 og pseudotumor patient som vist i figur 3D.

I sammendrag, en kombination af disse tre HRM optimeret sonder ville differentiere tumorer fra ikke-tumorer (ved hjælp af

GPM6B

sonde og

MAGEA12

i kombination med

GPM6B

) og HCC med PVTT fra ikke-PVTT HCC (ved hjælp af

FCRL1

sonde).

Validering af identificerede epigenetiske biomarkører i Bangladesh biopsi prøver fra HCC og kronisk hepatitis B (CHB) patienter

Det kritiske spørgsmål i diagnosticering af HCC er at identificere tidlig konvertering af CHB til HCC. Vi spurgte derfor, om de identificerede sonder kunne skelne mellem HCC og CHB i et uafhængigt sæt af emner. Vi testede 4 forsøgspersoner med HCC og 4 personer med CHB (tabel 2 for kliniske karakteristika).

GPM6B

sonde, der adskiller alle HCC fra NorAdjRef i Shanghai gruppe patienter viste også forskellige smeltepunkter mønstre i HCC og CHB undtagen en patient med HCC som blev grupperet sammen med CHB baseret på smeltning peak temperatur (tabel 3, Figur 4A,

P

= 0,028, justeret

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

test;

P

0,0001, permutation test) . Methylering stat inden

MAGEA12

sonde adskilt alle HCC sager fra CHB som angivet med lavere smeltetemperatur (tabel 3, figur 4B,

P

= 0,028, justeret

P

= 0,084 , Mann-Whitney

U

test;

P

= 0,02, permutation test). I HCC patienter, vi klart observeret to smeltningstoppe angiver to populationer af celler med lav og høj

MAGEA12

methylering niveau. En sonde inden

FCRL1

blev hypomethylated i alle tumorer i forhold til gennemsnittet af alle CHB patienter (tabel 3, figur 4C,

P

= 0,028, justeret

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

test;

P

0,0001, permutation test). Når vi grupperet smeltende peak temperatur værdier for alle HCC prøver og alle tilstødende normale og CHB prøver, median værdi for hver testet sonde var lavere i kræft end i normal indikerer hypometylering i kræft (figur 4D). Forskellene var stærkt statistisk signifikant for

GPM6B

og

MAGEA12

prober (

P

0,001, justeret

P

0,003, Mann-Whitney

U

test) samt for

FCRL1

men efter udelukke HCC prøver uden PVTT (

P

0,01, justeret

P

0,03 , Mann-Whitney

U

test). Ekspression af de testede gener som målt ved QPCR i den bangladeshiske gruppe var i gennemsnit højere i HCC end i CHB fag (se figur 4E for nøjagtige værdier i hver patient) med de mest relevante ændringer, der observeres for

FCRL1

(figur 4E,

P

= 0,028, justeret

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

test.

P

= 0,028, permutation test)

smeltekurveanalyse toppe af

GPM6B (A)

,

MAGEA12

(B) og

FCRL1

(C) amplikoner i 4 HCC og 4 CHB patienter fra Bangladesh.