PLoS ONE: østrogen-receptor p2 inducerer Hypoxi underskrift genekspression ved stabiliserende HIF-1α i prostatakræft

Abstrakt

østrogen receptor (ER) β variant ERβ2 udtrykkes i aggressiv kastrationsresistent prostatacancer og har vist sig at korrelere med nedsat samlet overlevelse. Genom-dækkende udtryk analyse efter ERβ2 udtryk i prostatacancerceller afslørede, at hypoxi var en overrepræsenteret tema. Her viser vi, at ERβ2 interagerer med og stabiliserer HIF-1α protein i normoxi, hvorved der induceres en hypoxisk genekspression signatur. HIF-1α er kendt for at stimulere metastase ved at øge ekspression af Twist1 og stigende vaskularisering ved direkte at aktivere VEGF-ekspression. Vi fandt, at ERβ2 interagerer med HIF-1α og piggybacks til HIF-1α responselement stede på de proximale Twist1 og VEGF promotorer. . Disse resultater antyder, at i det mindste en del af de onkogene virkninger af ERβ2 medieres af HIF-1α og at målretning af denne ERβ2 – HIF-1α interaktion kan være en strategi til behandling af prostatacancer

Henvisning: Dey P, Velazquez-Villegas LA, Faria M, Turner A, Jonsson P, Webb P, et al. (2015) østrogen receptor p2 inducerer Hypoxi underskrift genekspression ved stabiliserende HIF-1α i prostatakræft. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10,1371 /journal.pone.0128239

Academic Redaktør: Sonia Rocha, University of Dundee, Storbritannien

Modtaget: November 26, 2014 Accepteret: April 23, 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Dey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle microarray filer er tilgængelige fra NCBI s Gene Expression Omnibus database (tiltrædelse nummer GSE35095)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) giver HIRP100680 og RP110444, Texas Emerging Technology Fund under aftale nr. 300-9-1958, Robert A. Welch Foundation (Grant E-0004), de svenske Cancer Fund og Marie Curie-aktioner FP7-PEOPLE-2011-COFUND (VÆKST 291.795) via VINNOVA program Mobilitet for vækst (til C.W.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

Prostatacancer er en langsomt fremadskridende sygdom, der oprindeligt kan behandles med androgen- deprivationsbehandling (ADT) [1], men normalt tilbagevendende i en mere aggressiv form, der er androgenuafhængig [2, 3]. Mest aggressive prostatakræft udtrykker høje niveauer af androgen receptor (AR) og desuden udnytte en række mekanismer til at aktivere AR i fravær af dens ligand. For eksempel kan canceren erhverve evnen til at syntetisere AR ligander, phosphorylere AR eller gennem alternativ splejsning, oprette en konstitutivt aktiv AR [4]. I modsætning hertil er ekspressionen af ​​de vigtigste isoform af østrogen receptor β (ERp /ESR2), ERβ1, reduceret under prostatakræft progression [5-8]. ERβ1 har vist at nedregulere ekspressionen af ​​AR, så ved udtømning af ERβ1 er ekspressionen af ​​AR væsentligt forøget [9]. Desuden har ERβ1 nylig blevet vist at inducere apoptose i prostata cancercellelinier ved at aktivere FOXO3a /PUMA pathway [10]. ERβ1 er også blevet vist at inhibere epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) ved opregulering prolyl hydroxylase domæne 2 (PHD2 /EGLN1) og efterfølgende faldende hypoxi inducerbar faktor 1α (HIF-1α /HIF1A) niveauer [11, 12]. Tværtimod ERp splejsningsvariant ERβ2 [13] er udtrykt i sent stadium metastatisk prostatacancer og nuklear ERβ2 ekspression korrelerer med nedsat samlet overlevelse [14]. ERβ2 indeholder en trunkeret ligandbindende domæne (LBD) og et unikt C-terminale aminosyresekvens der kodes af et unikt alternativ ERβ2-specifikke exon kaldet cx [13]. Dette ERp isoform mangler evnen til at binde ligand, homodimerize og aktivere kanoniske ERβ1 genekspression veje, men kan heterodimerisere med ERa derved hæmmer ERa aktivitet [13]. Nuclear ERβ2 øger invasionsevne af PC3 celler [14] og stiger cellulær proliferation og udtryk for Twist1 (TWIST1) og c-myc (MYC) i både PC3 og 22Rv1 celler, hvilket indikerer mulige onkogene roller ERβ2 i prostatacancer [15].

En prolifererende tumor er ofte udsat for hypoxisk tilstand, på grund af dens højere metaboliske behov og mangel på neo-vaskularisering at holde trit med dens krav. Hypoxi fremmer neuro-endokrine differentiering af prostata tumor, som øger dens aggressivitet [16]. Transskriptionsfaktoren HIF-1α er en central faktor i cellernes reaktion på hypoxi. I celler med normale oxygenniveauer, er HIF-1α hydroxyleret af prolyl hydroxylase, et enzym, der anvender oxygen som cofaktor og er kun aktiv under normoxiske betingelse [17]. Prolyl hydroxylering forårsager HIF-1α til at interagere med Von Hippel Lindau faktor (VHL), hvilket fører til ubiquitinering og nedbrydning af HIF-1α af proteasomet kompleks [18-21]. For nylig har flere undersøgelser vist sig, at HIF-1α-protein kan stabiliseres uden et fald i oxygenspænding af faktorer interfererer med oxygen-afhængig HIF-1α nedbrydning [22-24]. Efter stabilisering, HIF-1α translokerer til kernen og aktiverer transkription af gener involveret i angiogenese. I cancere, skifter HIF-1α ekspression af gener, der fører til øget tumor metabolisme og metastase, hvilket skaber en meget aggressiv tumor. For eksempel, HIF-1α-afhængig regulering af Twist1 udtryk er et vigtigt skridt i metastaser [25]. Da ERβ2 har en vejledende onkogen rolle i prostatacancer, og dens splejsningsvariant ERβ1 er en tumor suppressor kendt for at hæmme HIF-1α, vi her undersøgt, om ERβ2 kan øge HIF-1α stabilisering, og om denne mekanisme ligger til grund for korrelation af begge faktorer med aggressiv, metastaserende, prostatakræft.

Materialer og metoder

Reagenser og cellekultur

22Rv1 og PC3 cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 celler blev holdt i RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO), 25 mM HEPES puffer og 2 mM L-glutamin (Invitrogen Carlsbad, CA), mens PC3-celler blev holdt i RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Alle eksperimenter anvendte celler under passage 30.

HIG2 luciferase plasmid er blevet beskrevet tidligere [26], pXP2-Twist1-LUC og pXP2-mTwist1-LUC er blevet beskrevet [25].

Konstruktion af et inducerbart system til ERβ2 og biotinligase udtrykker PC3 celler (PC3 BirA)

en transposon-baseret system medierende doxycyclin-reguleret ekspression af ERβ2 blev anvendt til stabilt transficere 22Rv1 og PC3 prostata kræftceller. Disse cellelinier er beskrevet andetsteds [15]. Til konstruktion af PC3-celler, der udtrykker biotinligase blev PC3-celler transficeret med plasmid, der udtrykker pBirA

Escherichia coli

biotin holoenzym syntetase (BirA) fra actinpromotoren og selekteres med G418 ved 500 pg /ml. Efter to uger kloner blev isoleret og undersøgt for biotinylering aktivitet.

Protein ekstrakt forberedelse

Til fremstilling helcelleekstrakterne blev cellerne vasket to gange med PBS, lyseret i 10 gange hæmatokritværdi af lysis buffer [0,1% Nonidet P-40, 250 mM KCI, 5 mM Hepes, pH 7,9, 10% (vol /vol) glycerol, 4 mM NaF, 4 mM natriumorthovanadat, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, proteaseinhibitorcocktail, PhosStop (Roche, Indianapolis, IN)] i 15 minutter på is og derefter centrifugeret ved 14.000 x

g

i 10 minutter.

Western blotting

Tyve mikrogram protein blev påsat en SDS-PAGE 10% Bis-Tris-gel med Tris løbebuffer og overført til en nitrocellulosemembran efter elektroforetisk separation. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælkepulver i 0,1% TBST buffer og probet med anti-ERβ2 (produceret i laboratoriet), Twist1 (sc-15393), og HIF-1α (sc-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Primære antistoffer blev anvendt ved 1: 200-1000 fortyndinger, og sekundært antistof blev anvendt ved 1:. 10.000

RNA-ekstraktion og real-time PCR

RNA-ekstraktion blev udført med Qiagen-mRNA ekstraktionskit ifølge standardprotokol. cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA med First Strand System ifølge standardprotokol (Invitrogen Inc. NY). Real-time PCR blev udført med SYBR Green I dye Master Mix (Applied Biosystems Foster City, CA). Primere (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, IA) var: 18s rRNA fremad (F), 5′-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA-3 ‘og omvendt (R), 5′-AGC TAT CAA TCT GTC AAT FTT GTC C-3; glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase F, 5’-TGA CAA CTT TGG TAT YCG TGG AAG G-3 ‘og R, 5′-AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA GAG-3′ (reference- gener); ERβ2 F, 5-ACT TGC TGA ACG CCG TGA CC-3 og R, 5’-CCA TCG TTG CTT CAG GCA A-3 ‘; Twist1 F, 5’-GGA GTC CGC AGT CTT ACG AG-3 ‘og R, 5′-TCT GGA GGA CCT GGT AGA GG-3’. qPCR reaktioner blev udført med en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse af optimerede betingelser for SYBR Green I dye systemet: 50 C i 2 minutter, 95 C i 10 minutter, efterfulgt af 40-50 cyklusser ved 95 C i 15 sekunder og 60 ° C i 50 sekunder. Optimal primer koncentration blev bestemt i indledende forsøg, og forstærkning specificitet bekræftet ved dissociation kurve analyse.

In vitro translation og bakteriel udtryk

HIF-1α og ERβ2 blev oversat ved hjælp af TNT Quick koblet transkription /translationssystemer (Promega Madison, WI). Kort beskrevet blev 0,2 ug af HIF-1α eller ERβ2 ekspressionsvektorer (T7 promotor) blev tilsat til en portion af TNT Quick mastermix og inkuberet i et volumen på 50 pi i 60 minutter ved 30 ° C. In vitro-syntese af protein blev verificeret ved SDS-PAGE. For bakteriel ekspression blev BL21-DE3 bakterieceller bruges til at udtrykke His-LBD-ERa, His-LBD-ERβ1, His-LBD-ERβ2 og Hans-LBD-ERβ2ΔCX ekspressionsplasmider.

Træk ned fra PC3 eller HEK293 celler Salg

PC3-celler blev transficeret med 3 ug BirA (biotinligase) ekspressionsplasmid, 3 ug plasmid indeholdende biotinylering konsensus mærkede receptorer B7TEV-ERa-, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2 og B7TEV-ERβ5 sammen med 3 ug pcDNA3 HA-HIF-1α “Addgene plasmid 18949” eller pcDNA3 HA-HIF-1α P405 /A-P564 /A “Addgene plasmid 18.955” eller pcDNA3 HA-HIF-1α Δ401-603 (pcDNA3 HA-HIF-1αΔODD) beskrevet af Kondo

et al

og Yan

et al

. [27, 28] i en 100 mm vævskulturplade. For HEK293-celler den biotinligase blev transient transficeret. Efter 48 timer blev celler skrabet, pelleteret og lyseret i 300 pi NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40), kortvarigt sonikeret og centrifugeret for at fjerne debris. 10 pi streptavidin magnetiske perler (Pierce Rockford, IL) blev vasket i NETN og inkuberet med 300 pi cellulær ekstrakt i 2 timer i det kolde rum. Perler blev vasket (3 x 10 minutter rotation) med 300 pi NETN og koges med 20 pi 2 x prøvebuffer [125 mM Tris-HCI (pH 6,8), med 4% SDS, 20% (vol /vol) glycerol og 0,004 % bromphenolblåt] og underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membran til Western-blot. Blottet blev probet med HIF-1α antistof (Santa Cruz Dallas, TX) 1: 1000 fortynding og sekundært antistof 1:. 10.000 fortynding

In-vitro pull downs

2 pi

i vitro

oversat HIF-1α protein blev inkuberet med 25 pi bakterielysat indeholdende His-ERβ2 (LBD) natten over, og komplekser blev adsorberet på nikkel agaroseperler i 2 timer. Perlerne blev vasket tre gange med iskold NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40). Komplekser blev kogt med 20 pi 2 x prøvebuffer, udsat for SDS-PAGE og overført til nitrocellulose membran til Western analyser. Blottet blev probet med anti-HIF-1α-antistof (Santa Cruz). Primære antistoffer var ved 1: 1000 fortynding, og sekundært antistof ved 1:. 10.000

Mammalian 2 hybridassay

ERβ2 blev klonet i Gal4DBD udtrykkende plasmid PM2 i ramme med Gal4DBD domæne ved hjælp BamHI og HindIII restriktionssites gør PM2-ERβ2. Den pVP16 plasmid (Clontech) blev anvendt til at klone den N-terminale HIF-1α (aminosyrerne 1-401), oxygen destabilisering domæne (aminosyrerne 401-603) og den C-terminale domæne (aminosyrerne 603-826) i ramme med VP16 aktiveringsdomæne hjælp BamHI- og Pstl-restriktionssteder. Til interaktion assays i PC3-celler Gal4 responsive reporter FR-LUC 300 ng, PM2-ERβ2 500 ng og VP16 fusioneret HIF-1α domæner 200 ng blev transficeret under anvendelse af PEI fremgangsmåde til transfektion som beskrevet af Longo et al. [29]

Microarray og bioinformatik analyser

De to-farve sammenlignende microarray analyse dækker fuldt kendt protein-kodende transkriptom af 39.600 udskrifter og varianter ved at bruge menneskelige OpArray arrays købt hos Microarrays Inc. ( Huntsville, AL). Grupperingen blev suppleret med 133 oligonukleotider specifikt syntetiseret for detaljeret og robust analyse af nukleare receptorer, splejsningsvarianter og coregulators. Den microarray analyse blev udført i det væsentlige som i Richter

et al

. [30]. For hver cDNA syntese blev 20 ug af total RNA anvendes, og hver sammenligning blev replikeret og farvestof byttes. Bioinformatiske analyser blev udført ved anvendelse GenePix, R, og Pathway Studio software (Elsevier, Philadelphia, PA). Differentielt udtrykte gener blev defineret under anvendelse af en p-værdi afskæring af p = 0,005 i kombination med et M-værdi (log2 af fold-ændring) afskæring på +/- 0,3. Berigelse analyse af gen ontologi (GO) af de biologiske processer blev udført med Fishers eksakte test ved hjælp af softwarens gen sæt. Pathway billeder blev designet i Pathway Studio. Microarray data er tilgængelige i NCBI s Gene Expression Omnibus under tiltrædelsen nummer GSE35095.

chromatin Immunfældning (chip)

Sub-sammenflydende PC3 og 22Rv1 celler (90%) blev dyrket i en 150 mm skål og vasket to gange med kold PBS og derefter fikseret i PFA (1%) i 10 minutter. Celler blev vasket to gange med kold PBS + proteaseinhibitor, skrabet med 150 pi resuspension buffer og centrifugeret (4000rpm, 10 minutter). Pellets blev resuspenderet i 750 pi ChIP lysepuffer (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, triton 1%, protease inhibitor), og celler holdt på is i 30 minutter. Cellelysater blev sonikeret (60 pulser, 30 sekunder hver) med 30 sekunder pause ved 4 ° C. Efter lydbehandling blev 25 pi prøver opsamlet og opbevaret ved -20 ° C (indgang). Resten af ​​125 pi cellelysat fraktion blev anvendt til de følgende trin. Prøver blev præ-absorberet i 20 pi G-protein koblet FLAG tagged magnetiske perler ved 4 ° C i 2 timer og supernatanten opsamles. Prøverne blev derefter opdelt i to fraktioner og antistoffer mod FLAG (2,5 ug) eller IgG’er (2,5 ug) blev tilsat og inkuberet natten over. Den næste dag blev perlerne vasket tre gange med chip lyseringsbuffer, en gang med chip vask puffer med højt saltindhold (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, triton 1%), og endelig en gang med chip vaskebuffer (Tris 10 mM, LiCI 250 mM, NP40 0,5%, EDTA 0,1 mM). Beads blev resuspenderet i 40 pi elueringsbuffer (Tris 50 mM, SDS 1%, EDTA 10 mM) og inkuberet ved 65 ° C natten over med et lille hul på hætten. Den tidligere indsamlede input blev også placeret ved 65 ° C. Den næste dag blev prøver oprenset under anvendelse af PCR-oprensningskittet (Qiagen) og anvendt til qPCR analyse under anvendelse af de følgende primere. pHRE-Twist1 promotoren (F) 5′-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 ‘; (R) 5’-AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3 ‘, VEGF-promotor: (F) 5′-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3′; (R) 5’-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 ‘.

Statistik

Værdierne er udtrykt som middelværdien med 95% konfidensintervaller. En to-halet uparret

t

-test blev anvendt til at sammenligne forskellene mellem to grupper. Betydningen præsenteres som *

p

0,05, **

p

0,005, og ***

p

0,001, og ikke-signifikante forskelle præsenteres som NS.

Resultater

Microarray og bioinformatisk analyse af prostatacancerceller, der udtrykker ERβ2 show forøget ekspression af gener involveret i hypoxisk respons

Vi har tidligere vist, at ERβ2 øget udtryk for EMT-associerede gener Twist1 og Slug (SNAI2) i prostata kræftceller [15]. Her udførte vi en transkriptom undersøgelse for at udforske virkningerne af ERβ2 på en saglig måde. Vi sammenlignede PC3 celler stabilt udtrykker ERβ2 med kontrol celler, og fundet 585 gener, der skal ændres væsentligt ved hjælp af vores definerede cut-off. Interessant TGFB2, som vides at blive stimuleret af HIF-1α, var blandt de mest opreguleres gener (næsten 9 gange, ifølge microarray). Analyse berigelse af gen ontologi kategorier blandt de regulerede gener, “

respons på hypoxi

‘var den anden mest overrepræsenteret funktion (p = 8.0e-6), kun overgået’ genekspression (tabel 1). Den “

respons på hypoxi

‘gruppe omfattede 17 signifikant regulerede gener (TGFB2, EGLN1 (PHD2), EGLN3 (PHD3), SMAD3, HSD11B2, CAT, CCL2, CDKN1B, MMP13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, ITPR1, SOD2 ADM). Desuden den berigede undernetværk, defineret som generne bliver ekspression mål for den respektive knude, naboer af HIF-1α ‘var den mest overrepræsenteret on (p = 1.5E-09) med 41 regulerede medlemmer (tabel 2). Endvidere blev der fundet mange ERβ2-inducerede gener at være involveret i angiogenese (tabel 2), hvilket også var en overrepræsenteret tema (p 0,05). Af disse gener, er SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 og TGF-β2 alle stimuleret af HIF-1α [26]. Også “

glukosemetabolismen proces ‘

som HIF-1α er kendt for at regulere, blev overrepræsenteret (p 0,007), herunder 9 gener (PFKP, Akt1, IGF2, GOT2, PGM5, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Således microarray analyse klart angivet hypoxi og HIF-1α funktion som vigtige temaer i ERβ2 funktion (se S1 Fig for validerede gener).

For at validere disse data, vi analyserede udtryk for HIF-1α i PC3 og anden prostatacancer-cellelinie-22Rv1, som begge er overudtrykkende ERβ2. Vi observerede en stigning i HIF-1α proteinniveau i ERβ2 udtrykkende versus kontrol celler, men ingen ændringer i tilsvarende mRNA niveau (Fig 1A-1D). Dette er enig med vores microarray resultater, som ikke registrerer ændring i HIF-1α transskription niveauer, men der er angivet en ændring i HIF-1α funktioner (baseret på berigede veje). Endvidere blev ERβ2-afhængig stigning i HIF-1α proteinniveauer bekræftet at blive ledsaget af ERβ2-afhængig stigning i HIF-1α aktivitet. Luciferaseaktivitet af en reporter drevet af HIF-1α-afhængig hypoxi inducerbart gen 2 (HIG2 /HILPDA) promotor (HIG2-A-luc) [26] blev forøget i nærvær af transficerede ERβ2 ekspressionsvektor (fig 2A-2C). I en tidligere undersøgelse, viste vi, at ERβ2-udtrykkende PC3 celler har øget niveau af Twist1 [15]. Her viser vi, at ERβ2 også øget aktivitet af et luciferase reporter drevet af HIF-1α-afhængig Twist1 promotoren i LNCaP-prostatacancerceller og at denne virkning var afhængig af HIF-1α responselement (Fig 3A-3C). Dette viser, at HIF-1α aktivitet generelt er forbedret i prostata celler, der udtrykker ERβ2.

A. Western blot af ekstrakter fra kontrol og to forskellige 22Rv1 og PC3 kloner, der udtrykker ERβ2 analyseret med HIF-1α antistof. B. Relativ mRNA ekspression af ERβ2 og HIF-1α i ERβ2clones af 22Rv1 cellelinje. Grafen viser de data som fold ændring sammenlignet med kontrolgruppen (gennemsnit af tre separate forsøg (± sem.) Beregnet ved hjælp af Students

t

-test, * p≤0.016). C. Relativ mRNA-ekspression af HIF-1α i ERβ2 # 2 klon af 22Rv1 cellelinje. Grafen viser de data som fold ændring sammenlignet med kontrolgruppen (gennemsnit af tre separate forsøg (± SEM) beregnet ved hjælp af Students

t

-test, ** p≤0.006).

A. Skematisk oversigt over HIG2 promotorkonstruktionen hvor (X) repræsenterer sekvensen af ​​HIF-1α responselementer (HRE). B. Voksende mængde transient transficeret ERβ2 ekspressionsplasmid i PC3-celler successivt aktiverer transient transficeret HIG2 promotoren som vist ved luciferaseanalyse af HIG2-A-LUC. Grafen viser de data som en stigning i luminescens af celler transficeret med øget koncentration af ERβ2 (gennemsnit af tre separate forsøg (± sem.) Beregnet ved hjælp af Students

t

-test, *** p≤0.0002). Sammenligning af koncentrationer-0μg til 1000 ug. C. Tilsætning af ekspressionsplasmid for HIF-1α aktiverer HIG2 promotoren i PC3-cellelinjer. Grafen viser de data som en stigning i luminescens af celler transficeret med HIF-1α (gennemsnit af tre separate forsøg (± SEM) beregnet ved hjælp af Students

t

-test, **** p ≤ 0,0001).

A. Beskrivelse af Twist1 promotorkonstruktioner anvendes. B. LNCaP-celler transficeret med Twist1-promotor-Luciferase reporter og stigende koncentration af ERβ2 ekspressionsplasmid. Grafen viser de data som en stigning i luminescens af celler transficeret med øget koncentration af ERβ2 (gennemsnit af tre separate forsøg (± sem.) Beregnet ved hjælp af Students

t

-test, ** p≤0.0034). C. Transfektion af Twist1-promotor-Luciferase reporter med (Twist) eller muteret (mTwist) HIF-1α responselementet sammen med ekspressionsplasmider for HIF-1α eller ERβ2 i LNCaP-celler. Grafen viser de data som en stigning i luminescens af celler transficeret med øget koncentration af ERβ2 (gennemsnit af tre separate forsøg (± SEM) beregnet ved hjælp af Students

t

-test, **** p ≤ 0,0001, # ## p≤0.002).

ERβ2 direkte interagerer med HIF-1α forårsager stabilisering

Siden ERβ2 øger ekspressionen af ​​HIF-1α protein, men ikke mRNA, vi spekuleret på, at HIF-1α stabilisering forekommer gennem protein-protein-interaktion mellem ERβ2 og HIF-1α. For at teste denne hypotese, fastgjort vi bakterielt udtrykte LBD’erne af ERa, ERp og ERβ2 til et fast underlag og bestemt interaktioner med

in vitro

oversatte HIF-1α. HIF-1a stærkt bundet til ERβ2, men ikke til ækvivalente mængder af vildtype ERa eller ERp LBD’er. Denne interaktion var uafhængig af ERβ2 specifikke sekvenser, fordi trunkering af aminosyrer kodet af den ERβ2-specifikke exon ikke eliminere HIF-1α binding (ERβ2ΔCX) (Fig 4A). Pull-down af biotin-mærket ER’er udtrykt i PC3 celler afslørede specifik interaktion af transficeret HIF-1α med ERβ2 og ERβ2ΔCX og kun beskedne interaktion med ERβ1 (Fig 4B). Da ERβ5 har samme aminosyresekvens og er trunkeret ved samme aminosyre som ERβ2, dvs. kun de små C-terminale peptider varierer mellem de to varianter besluttede vi at teste denne variant og undersøge dets interaktion med HIF-1α. Som vist i fig 4B, ERβ5 interagerer kraftigt med HIF-1α.

A. His-mærket LBD-ERβ2 trækker ned med nikkel agarose perler af

in vitro

oversatte HIF-1α sammenlignet med His-mærket LBD-ERa, His-mærket LBD-ERβ1, His-mærket LBD-ERβ2 og His tagged ERβ2ΔCX TNT er bane med kun koblede reticulocytlysat. B. Ekspression af biotinligase BirA, HA-HIF-1α, og den N-terminale biotin konsensus fusioneret receptor-konstruktionerne B7TEV-ERa, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, og B7TEV-ERβΔCX i PC3-celler. Celleekstrakter blev derefter underkastet pulldown med streptavidin magnetiske beads og proteiner separeret ved SDS-PAGE efterfulgt af påvisning med HIF-1α antistof.

Oxygenet destabiliserende domæne (ODD) af HIF1α er ikke påkrævet for interaktion med ERβ2 og ERβ5

for at undersøge, hvis ilt destabiliserende domæne af HIF-1α var påkrævet for interaktion med ERβ2 vi konstrueret et ekspressionsplasmid af HIF-1α med aminosyrer 401-603 slettet som tidligere beskrevet [31] . Vi derefter co-immunopræcipiteret dette domæne slettet HIF-1α med biotinyleret ERβ2 og ERβ5. Som det kan ses i fig 5A HIF-1α med udgår ODD (Δ401-603) interagerer så stærkt som vildtype angiver, at ODD domæne er undværlig for interaktionen. At kortlægge interaktionen yderligere vi bruges mammale to-hybrid assay, hvor den N-terminale ende, ODD domæne og C-terminale ende af HIF-1α blev fusioneret til VP16 og transficeret ind i PC3-celler sammen med Gal4DBD fusioneret ERβ2 og en reporter med Gal4 bindingssteder i foran luciferase. Som det kan ses i fig 5B interaktionen sker fortrinsvis med N-terminalen af ​​HIF-1α.

A. PC3-celler transficeret med plasmider, der udtrykker GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, BirA (biotinligase), ERβ2 og ERβ5 med N-terminal biotinylering konsensus. Komplekser blev trukket ned med streptavidin magnetiske beads. Trukket ned HIF-1α og HIF-1α ΔODD blev påvist ved anvendelse af anti-HIF-1α antistof. B. Transfektion af 200 ng FR-luciferase alene, med 500 ng PM2-ERβ2 og 300 ng af enten VP16-N-term HIF-1a (aminosyrer 1-401), VP16- ODD HIF-1a (aminosyrer 401-603) eller VP16-C-term HIF-1α (aminosyrer 603-826). Måling af luciferaseaktivitet 24 timer efter transfektion.

Det er velkendt, at proliner 405 og 564 af HIF-1α under normoxi hydroxyleres af prolin hydroxylaser (PHD s) og derefter anerkendt af VHL faktor, og efterfølgende målrettet til nedbrydning [32]. Vi ønskede at finde ud af, om ERβ2 og ERβ5 interaktion med HIF-1α er afhængig af hydroxylering af disse proliner så interaktionen selv ville forekomme under normoxiske betingelser. I figur 6, viste vi, at WT og P405 /A-P564 /A muteret HIF-1α interagerer stærkt med ERβ2 uanset ødelæggelse af prolyl hydroxylerings sites tyder på, at interaktionen opstår både under normoxi og hypoxi.

PC3 celler transficeret med GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, BirA (biotinligase), ERβ2 og ERβ5 med N-terminal biotinylering konsensus. Komplekser blev trukket ned med streptavidin magnetiske perler.

ERβ2 rekrutteres til HIF-1a respons elementer i Twist1 og VEGF initiativtagere

Endelig har vi undersøgt, om ERβ2 kan binde til HIF -1a responselementer vha chip-qPCR. Vi har detekteret forhøjede niveauer af ERβ2 rekrutteret på HIF-1α respons elementer på HIF-1α afhængig Twist1 og VEGF promotorer i både PC3 og 22Rv1 celler. Men ERβ2 ikke binder til initiativtagerne til den klassiske østrogen respons element i PS2-genet (Fig 7A og 7B).

I PC3 celler (A) og 22Rv1 celler (B), der udtrykker doxycyclin-regulerede ERβ2 udtryk dette ERp isoform binder til HRE (HIF-1α responselement i Twist1 promotor) og VEGF-promotoren (HIF-1α responselement i VEGF-promotor), men ikke til pS2 (ERE) promotor. Chip-qPCR resultater er vist med en ikke-specifik IgG og et specifikt anti-M2-FLAG antistof immunpræcipitering. ERβ2 binding beriget kun i HIF-1α responselementet indeholdende Twist1 og VEGF promotorer, men ikke i PS2-promotoren mangler HIF-1α responselement. Grafen viser de data som en stigning i binding af FLAG til Twist1 (pHRE) og VEGF-promotor (gennemsnit af tre separate forsøg (± SEM) beregnet ved hjælp af Students

t

-test, * p≤0.028, # # p≤0.041 (PC3 celler) og ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 celler).

som konklusion, vores resultater viser, at ERβ2 binder til og stabiliserer HIF-1α og desuden er co-rekrutteret til vigtige HIF-1α elementer i HIF-1a regulerede gener og derved øger aktiviteten af ​​HIF-1α under normoksiske forhold i prostata kræftceller.

diskussion

Hvordan reagerer normal væv til hypoxi er afgørende for korrekt vaskularisering og til efterfølgende blodforsyning til ilte og give næring til vævet. en voksende tumor bliver hypoxisk, da den nåede mere at 1 mm i størrelse [33]. den umiddelbare reaktion på hypoxi er en nedsat prolyl-hydroxylering af HIF-1α fører til forøget stabilisering af dette protein. dette skyldes VHL, der inducerer ubiquitinylation og efterfølgende nedbrydning af HIF-1α under normoxiske betingelser, ikke kan binde til HIF-1α i fravær af prolyl-hydroxylering. Stabilisering af HIF-1α tillader regulering af gener involveret i angiogenese, såsom VEGF, som udskilles fra tumoren, tiltrækker endotelceller ved at binde til deres overflade VEGF-receptorer og således tillader forøget tumorvaskularisering og vækst. HIF-1α øger også ekspression af gener involveret i glycolyse, at tilpasse tumoren til at overleve under betingelser med lav oxygen [34], og gener involveret i invasion og metastase, såsom Twist1 [25].

Ekspression af ERβ2 korrelerer med dårligere prognose i prostatacancer [14] og ERa-negativ brystcancer [35], men eventuelle onkogene virkninger af ERβ2 er ikke forstået. Vi viser her, at der er en stærk korrelation mellem ERβ2 udtryk og HIF-1α protein niveau, men ikke mRNA-niveau i prostata cancer cellelinjer PC3 og 22Rv1. ERβ2 øger aktiviteten af ​​HIF-1α afhængige initiativtagere og rekrutteres til Twist1 og VEGF initiativtagere, sandsynligvis ved tethering til HIF-1α. Sammen resultaterne skitseret ovenfor antyder, at HIF-1α medierer den onkogene effekt af ERβ2 gennem en ikke-klassisk signalvej, hvor ERβ2 binder til, og stabiliserer HIF-1α under normoxiske betingelser. Dette er i overensstemmelse med andre undersøgelser viser, at HIF-1α interagerende proteiner stabiliserer HIF-1α ved at blokere dens nedbrydning [22-24].

overraskende, selv om vi fandt, at ERβ1 ikke interagerer effektivt med HIF-1α, korrelerer med dens manglende evne til at inducere HIF-1α responsive gener, er den unikke sidste exon af ERβ2 ikke påkrævet for HIF-1α binding. Tilsyneladende, trunkering af ERβ1 C-terminus udsætter en ny protein overflade mediere interaktion med HIF-1α.

Det er endnu ikke vises, hvis ERβ2 ekspression korrelerer med niveauerne af Twist 1 eller andre HIF-1α målgener i klinisk prøver. En nylig undersøgelse fra Ragnum et al. [36] viser, at androgen-deprivation terapi (ADT) forårsager en reduceret ekspression af mange gener i forbindelse med hypoxi. Vi foreslår, at ekspressionen af ​​ERβ2 eller ERβ5 kunne modvirke effekten af ​​ADT på hypoxi-forbundne gener i en prostata tumor og dermed forårsage kastration modstand resulterer i en dårligere resultat. Faktisk vores fund af ikke-hypoksisk stabilisering af HIF-1α tyder på, at det kunne være muligt at udvikle et lille molekyle forstyrre ERβ2 og ERβ5-induceret HIF-1α stabilisering til anvendelse i terapi af visse aggressive former for prostatakræft. En oversigt over de beskrevne resultater er vist i fig 8.

Foreslået model for, hvordan ERβ2 stabiliserer HIF-1α og rekrutteres til VEGF og Twist1 initiativtagere.

Det kan konkluderes, udtryk for den ERp varianter ERβ2 og ERβ5 har tidligere vist sig at korrelere med aggressiv prostatakræft.