PLoS ONE: Den Molekylær Detection og kliniske betydning af ALK omlejring i Selected Avanceret ikke-småcellet lungekræft: ALK Expression giver indsigt i ALK Målrettet terapi

Abstrakt

Baggrund

Denne undersøgelse havde til formål at belyse kliniske betydning af anaplastisk lymfom kinase (

ALK

) omlejring i udvalgte avancerede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) at sammenligne anvendelsen af ​​forskellige ALK påvisningsmetoder, og især vurdere en mulig sammenhæng mellem ALK udtryk og kliniske resultater i crizotinib-behandlede patienter.

metoder

ALK status blev vurderet ved fluorescerende

in situ

hybridisering (FISH), immunhistokemi (IHC) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) i 173 udvalgte fremskreden NSCLC patienter. Clinicopathologic data, genotype status og overlevelse resultater blev analyseret. Desuden blev sammenslutningen af ​​ALK udtryk med kliniske resultater evalueret i ALK FISH-positive crizotinib-behandlede patienter, herunder to patienter med samtidig epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) mutation.

Resultater

Den opdagelse på ALK omlægning af FISH, IHC og QRT-PCR positivitet var 35,5% (59/166), 35,7% (61/171), og 27,9% (34/122), hhv.

ALK

omlægning blev observeret overvejende unge patienter, aldrig eller lys rygere, og adenocarcinomer, især med signetring celle funktioner og dårlig differentiering. Median progressionsfri overlevelse (PFS) i crizotinib patienter var 7,6 måneder. Den samlede overlevelse (OS) af disse patienter var længere sammenlignet med den for crizotinib-naive eller vildtype-kohorter, men der var ingen signifikant forskel i OS sammenlignet med patienter med

EGFR

mutation. ALK-ekspression ikke forbinder med PFS; men, da ALK-ekspression blev analyseret som et dikotomisk variabel, moderat og stærk ALK udtryk havde en nedsat risiko for død (

P

= 0,026). De to patienter med samtidig

EGFR

ALK

ændringer viste forskel i ALK udtryk, respons på EGFR og ALK-hæmmere, og samlet overlevelse.

Konklusioner

Selektiv berigelse ifølge clinicopathologic funktioner i NSCLC patienter kunne meget forbedre positivitet opdagelse på

ALK

omordning for ALK-målrettet terapi. IHC kunne give flere ledetråde til klinisk forsøgsdesign og terapeutiske strategier for ALK-positive NSCLC patienter, herunder patienter med dobbelt genetisk afvigelse på

ALK

EGFR

Henvisning:. Zhang NN, Liu YT, Ma L, Wang L, Hao XZ, Yuan Z, et al. (2014) Den Molekylær Detection og kliniske betydning af

ALK

omlejring i Selected Avanceret ikke-småcellet lungekræft: ALK Expression giver indsigt i ALK Målrettet terapi. PLoS ONE 9 (1): e84501. doi: 10,1371 /journal.pone.0084501

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: August 27, 2013; Accepteret: November 14, 2013; Udgivet: 3 jan 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet delvist af tilskud fra Research særlige fond for offentlig velfærd Industry of Health (200.902.002-1), National Science and Technology Major Project (2008ZX09312, 2012ZX09303012), National High Technology Research and Development Program Kina (2011AA02A110), Beijing Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (Z121107005112005, Z121102009212055), særlige fonde for Central Health Authority (B2009B124) og Major Research Program for Cancer Institute og Hospital i kinesiske Academy of Medical Sciences (LC2012A18). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fremskridt i molekylære teknikker giver bedre identifikation og forståelse af molekylære markører, der kan have prognostisk værdi og kan køre terapeutisk beslutningstagning for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I det seneste årti, en undergruppe af NSCLC-patienter med epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) mutation har tiltrukket megen opmærksomhed på grund af de høje responsrater til EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) [1]. I 2007, en fusion gen af ​​anaplastisk lymfom kinase (

ALK

) med pighuder mikrotubuli-associeret protein ligesom 4 (

EML4

) i NSCLC blev først identificeret af Soda

et al

. [2], og blev snart en hidtil ukendt molekylært mål for lungekræft behandling. Succesfulde erfaringer EGFR målrettet terapi har givet en referencemodel for den hurtige forskning fremskridt

ALK

omlægning. Crizotinib (ALK /MET /ROS1 inhibitor) var den første klinisk tilgængelige middel, der viste bemærkelsesværdig antitumoraktivitet i ALK-positive fremskreden NSCLC patienter. For nylig har udvælgelse af patienter med ALK omlægning til crizotinib behandling blevet en standard i USA, EU, Kina, Japan og andre lande. Endnu vigtigere, blev andre ALK-hæmmere successivt indgik i kliniske forsøg [3] og lovende at markere en ny side af genotype-drevet lægemiddeludvikling for lungekræft.

Hyppigheden af ​​

ALK

omlejring intervaller fra 3% til 7% i uselekterede NSCLC-patienter, som kunne nå til 13% ~ 18%, hvis patientpopulationen vælges efter specifikke clinicopathologic egenskaber, især hos unge, aldrigrygere eller lette rygere med adenocarcinom [4], [5 ], [6], [7], [8], [9]. Desuden

ALK

omlejring var gensidigt udelukkende med

EGFR

og

KRAS

mutationer. Men ovennævnte karakteristika deles ikke af alle

ALK

omlejring luftfartsselskaber.

ALK

fusion er også fundet hos ældre patienter, rygere [4], patienter med

EGFR

mutation [10], [11], [12] og ikke-adenocarcinom histologiske undertyper, såsom som adenosquamøst carcinom og storcellet carcinom [3], [13]. Derfor clinicopathologic egenskaber er utilstrækkelige til screening patienter og molekylær test er nødvendige for at afgøre ALK status [14].

Kvantitativ realtid polymerasekædereaktion (QRT-PCR), immunhistokemisk (IHC) og fluorescens

in situ hybridisering

(FISH) er de nuværende metoder til valg for ALK testning. Men hver metode har særlige fordele og ulemper. Der er ingen accepteret enighed om, hvilken metode er at foretrække. QRT-PCR kan registrere

ALK

omlægning på mRNA-niveau og definere både

ALK

fusionspartner og fusion variant, men den har brug for høj kvalitet af RNA og kan ikke registrere ukendt

ALK

omlejringer. Derudover er der en række af

EML4-ALK

varianter og ikke-

EML4-AL

K fusioner i NSCLC [15]. Derfor QRT-PCR er ikke almindeligt i brug i påvisning af

ALK

omlægning. FISH er den nuværende standard metode til at påvise

ALK

omlejring, da det kan afsløre inversion og translokation uanset

EML4-ALK

gen fusion varianter og andre fusionspartnere. Vigtigt er det, alle kliniske forsøg, der viste effektiviteten af ​​crizotinib for

ALK

-positiv NSCLC patienter blev baseret på Vysis /Abbot ALK break-apart FISH-analysen. Men FISH er dyrt, tidskrævende og vanskelige at fortolke. Så FISH kan ikke være praktisk til screening hvert NSCLC patient. IHC er hurtigere, mere økonomisk og bredt tilgængelige. Desuden har IHC med nye antistoffer og modificerede protokoller udvidet driftsklar interval for ALK testning. Flere publicerede anbefalinger [16], [17] foreslog, at kun kan udføres ALK FISH-analyse i IHC-positive tilfælde. Dog er standard IHC protokoller og scoring kriterier mangler, og sammenhængen mellem ALK udtryk og kliniske resultater er ikke blevet bekræftet til at kontrollere rigtigheden af ​​IHC.

Derfor er denne undersøgelse indsamlede prøver i begyndelsen af ​​screening af patienter til crizotinib kliniske forsøg (PROFIL 1005 eller PROFIL 1014) og evalueret ALK status ved hjælp af FISH, IHC og QRT-PCR. Clinicopathologic karakteristika og kliniske resultater efter de genotype-specifikke og terapeutiske regimer blev analyseret med henblik på at belyse den kliniske betydning af

ALK

omlægning i udvalgte fremskreden NSCLC patienter. Desuden har vi sammenlignet med anvendelsen af ​​forskellige ALK påvisningsmetoder og især vurderet en mulig sammenhæng mellem ALK udtryk og kliniske resultater i ALK FISH-positive crizotinib-behandlede patienter.

Materialer og metoder

Undersøgelse Befolkning og dataindsamling

prøver blev indsamlet fra 173 avancerede nonsquamous NSCLC patienter, der tager sigte på at undergå ALK screening for crizotinib kliniske forsøg (PROFIL 1005 eller PROFIL 1014) fra januar 2011 til oktober 2012. Alle patienter fik behandling eller høring fra Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College og underskrevet informeret samtykke til fremtidig molekylær analyse. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Boards af det kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Institute og Hospital.

Medicinske optegnelser over alle patienter blev revideret til at indsamle demografiske, klinisk og patologisk information. Histologi blev revideret på grundlag af kriterierne i World Health Organization Klassificering af lungetumorer [18] og IASLC /ATS /ERS tværfaglig klassificering af lunge adenocarcinom [19]. Vi indspillede

EGFR

mutation status af patienter, som var blevet bestemt ved anvendelse af en tovejs sekventering metode

EGFR

exon 18 til 21. Vi undersøgte også behandling regimenter og kliniske resultater. Progressionsfri overlevelse (PFS) blev beregnet ud fra indledningen af ​​crizotinib til dokumenteret progressiv sygdom (PD) eller død uanset årsag. For bedre at belyse de påvirkninger af genotype-specifikke og terapeutiske regimer på patienternes samlet overlevelse (OS), blev analyseret to typer af OS. OS1 og OS2 blev henholdsvis defineret som tiden fra første diagnose af NSCLC og fra underskrevet informeret samtykke til død uanset årsag. OS1 var omfattende, men mere påvirket af tidligere behandlinger. OS2 var mere specifik at klarlægge virkningerne af crizotinib i behandling

ALK

-positiv fremskreden NSCLC.

ALK Test

Prøver blev testet ved IHC, FISH og QRT-PCR. FISH blev gennemført med FDA godkendte ALK sonde kit (Vysis LSI ALK tofarvet, break-apart omlejring sonde; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) og analyseret i henhold til kit instruktioner. ALK IHC blev udført i overensstemmelse med de protokoller, der leveres af antistoffet (D5F3, Cell Signaling Technology) producenten. I lighed med tidligere undersøgelser [20], [21], IHC resultater blev scoret som 0, når ingen specifik farvning var tydelig inden for en tumor; 1+, svag farvning intensitet i mere end 10% tumorcellerne uden baggrund farvning; 2+, moderat farvningsintensitet; 3+, stærk farvning intensitet. Sagerne med tilstrækkelige væv blev udvundet total RNA fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) prøver vha RNeasy FFPE (Qiagen, Tyskland). Til påvisning af EML4-ALK blev mRNA først revers-transkriberet til cDNA og QRT-PCR blev udført med et kommercielt EML4-ALK-kit (Amoydx, Kina), herunder ni kendte varianter (A20, E13, A20, E6a /6b; A20 , E20, A20, E15, A20, E14, A20, E18, A20, E2, A20, E17,.. A20) på ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)

Statistisk analyse

Pearsons chi-square test, Fishers eksakte test eller Kruskal-Wallis test blev anvendt til statistisk analyse af variabler, som passende. Kaplan-Meier fremgangsmåde blev anvendt til at estimere PFS og OS, og forskellen mellem grupperne blev sammenlignet ved log-rank test. Den hazard ratio (HR) blev estimeret ved proportionel risiko regressions med en 95% Wald konfidensinterval (95% CI). Dataanalyse blev udført med SAS-version 9.2, blev statistisk signifikans defineret som en to-sidet

P

-værdi. 0,05

Resultater

ALK Detection Resultater

et hundrede og toogtredive resektion og fyrre en biopsi prøver blev analyseret både ved IHC og FISH; dog blev der ikke fortolkelige IHC resultater opnået for to patienter og ingen fortolkelige FISH resultater for syv patienter. QRT-PCR blev succesfuldt udført i 122 eksemplarer. ALK ændring blev fundet i 35,5% (59/166), 35,7% (61/171), og 27,9% (34/122) prøver ved FISH, IHC, og QRT-PCR hhv. Detaljerne i afsløring resultaterne i henhold til de tre metoder er sammenfattet i tabel 1.

patientrettigheder Karakteristika og kliniske resultater Ifølge Molekylær undertyper

Af de 166 avanceret NSCLC patienter, der var klaret ALK screening af FISH, 59 nærede

ALK

omordning herunder to (3,4%, 2/59) patienter med samtidig

EGFR

mutation, 20 viste

EGFR

mutation, 87 var vildtype med

ALK

ekskluderet og

EGFR

ekskluderet eller

EGFR

-Ukendt (vildtype kohorte, WT). Patienterne mest sandsynlige at huse

ALK

omlægning var unge, aldrig eller lys rygere med dårligt differentieret adenocarcinom, især med signetring celle funktioner, sammenligner med

EGFR

mutation eller vildtype kohorte (tabel 2 ). De to patienter med samtidig

ALK

omlægning og

EGFR

mutation blev analyseret separat grund af den lave forekomst sats.

I de 59 patienter med FISH-positive

ALK

omlejring, 45 modtog crizotinib i det kliniske fase II studie (PROFIL 1005), 8 blev indskrevet i fase III klinisk forsøg (PROFIL 1014) og 6 ikke deltog et klinisk forsøg. På grund af den crossover effekt af pemetrexed og crizotinib i klinisk fase III-forsøg blev otte patienter ekskluderet for overlevelse analyse. De øvrige 158 patienter blev inddelt i fire typer:

ALK

positiv med crizotinib-behandlede (n = 45),

ALK

positiv med crizotinib-naive (n = 6),

EGFR

mutation med TKI’er-behandlede (n = 20) og vildtype (n = 87). Baseline funktioner, kliniske behandlinger og resultater er vist i tabel 3.

ALK

-positiv gruppe viste en dramatisk yngre aldersfordeling end nogen anden gruppe modtog flere behandlingsforløb end

EGFR

mutation gruppe (. median, 2,9

vs

1.8;

P

= 0,025) og havde flere patienter fik pemetrexed kemoterapi end vildtype gruppe (

P

= 0,020).

ALK

-positive patienter med og uden crizotinib behandling havde statistisk signifikant forskel i både OS1 (median, 39,7

vs.

8,8 måneder,

P

= 0,003) og OS2 ( . median, 22,0

vs

1,8 måneder,

P

0,001). Der var ingen signifikant forskel mellem

ALK

-positiv med crizotinib-behandlede gruppe og

EGFR

mutation med TKI’er-behandlede gruppe både i OS1 og OS2 (

P

= 0,249 og

P

= 0,896, henholdsvis). Derudover

ALK

-positiv med crizotinib-behandlede patienter havde længere OS2 end patienter vildtype (median, 22,0

vs.

14,2 måneder,

P

= 0,014), men der var ingen signifikant forskel i OS1 mellem disse to kohorter (39,7

vs.

38,7 møl,

P

= 0,294) (Figur 1).

A, B, C, gennemsnitlig overlevelse beregnet ud fra diagnose (OS1); D, E, F, samlede overlevelse beregnet ud fra underskrevet informeret samtykke ved screening tid (OS2). WT: patienter med ALK negativ og EGFR-negativ eller EGFR-ukendt;