PLoS ONE: Konservering Heat Shock Factor 1 i humane cancerceller med en potent RNA Aptamer

Abstrakt

Heat shock faktor 1 (HSF1) er en mester regulator, der koordinerer chaperone proteinekspression at øge cellulære overlevelse i ansigtet af varmestress. I kræftceller, HSF1 driver en transkriptionel program adskiller sig fra varme chok at fremme metastase og celleoverlevelse. Dens stærk sammenhæng med den maligne fænotype indebærer, at HSF1 antagonister kan have generelle og effektive forsyningsselskaber i kræftbehandling. Til dette formål havde vi identificeret en ivrig RNA aptamer for HSF1 der er bærbare mellem forskellige modelorganismer. Udvide vores tidligere arbejde i gær og Drosophila, her rapporterer vi aktiviteten af ​​dette aptamer i humane cancercellelinier. Når den leveres i celler under anvendelse af en syntetisk gen og stærk promotor, dette aptamer kunne forhindre HSF1 i at binde til dets DNA regulering elementer. På celleniveau, ekspression af denne aptamer apoptose og afskaffede kolonidannende evne af cancerceller. På molekylært niveau, det reducerede chaperoner og svækkede aktiveringen af ​​MAPK-signalvejen. Tilsammen demonstrerer disse data den fordel aptamerer i drug target validering og støtte den hypotese, at HSF1 DNA bindende aktivitet er et potentielt mål til styring onkogen transformation og neoplastisk vækst

Henvisning:. Salamanca HH, Antonyak MA, Cerione RA , Shi H, Lis JT (2014) Hæmning Heat Shock Factor 1 i humane cancerceller med en potent RNA aptamer. PLoS ONE 9 (5): e96330. doi: 10,1371 /journal.pone.0096330

Redaktør: Sandy D. Westerheide, University of South Florida, USA

Modtaget: Januar 18, 2014 Accepteret: April 4, 2014; Udgivet: 6. maj 2014

Copyright: © 2014 Salamanca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (GM25232 til JT Lis, CA140730 til JT Lis og H. Shi, Minority Supplement # 25.232-2351 til JT Lis og HH Salamanca), og Cornell University (Provost mangfoldighed Fellowship til HH Salamanca). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Heat shock faktor 1 (HSF1) er en transskription faktor, der reagerer på en række miljømæssige stressfaktorer for at aktivere varme chok reaktion i eukaryoter, en beskyttende mekanisme konserveret blandt forskellige riger [1]. Stressende fornærmelser, såsom termisk eksponering, stimulere HSF1 til at fungere som en master aktivator af et sæt af målgener. Især det forårsager ophobning af proteiner med chaperoning aktiviteter, såsom varmechokproteiner (HSP), HSP70 og HSP90, som hjælper opretholde intracellulær homeostase ved at beskytte proteomet mod de toksiske virkninger af protein misfoldning og aggregering [2]. Mens der kun er én HSF i

Saccharomyces cerevisiae

Drosophila melanogaster

, findes flere isoformer i pattedyr og planter, som synes at have specialiserede funktioner [3] – [5]. HSF1 funktion er afgørende for stress respons og levedygtighed i gær [6], og vigtigt for oogenese og tidlig udvikling i Drosophila [7]. HSF1 er også involveret i modningen i

C. elegans

[8], samt i ekstra-embryonale udvikling og flere vigtige sygdomme hos pattedyr [9].

Paradoksalt nok under visse omstændigheder, HSF1 evne til at fremme celle overlevelse kan bringe den samlede vel- er af en multicellulær organisme. Et gribende eksempel er funktionen af ​​HSF1 i kræft. Det har længe været bemærket, at cancerceller kan fortsætte med at formere sig i hypoksiske og fjendtlige mikromiljøer, som ellers vækstinhiberende for normale celler. Det er derfor ikke overraskende, at cancerceller udviser forhøjede niveauer af varmechokproteiner (HSP’er) for at lette foldningen af ​​beskadigede proteiner og solubilisering af proteinaggregater [10]. Mens denne observation antyder en indirekte rolle HSF1 i kræft progression, har en direkte indvirkning på HSF1 på malignitet blevet opdaget for nylig [11]. Faktisk er HSF1 sig at blive aktiveret i en bred række af maligne celler, og mønstret for DNA belægning af HSF1 i sådanne cancerceller er forskellig fra den af ​​normale celler udsat for varmechok. , HSF1 driver således en særskilt transkriptionel program, der fremmer cellulær transformation og vedligeholder ondartet vækst. Ud over mange klassiske varmechok gener, cancerspecifikke gener i dette program støttecelle-cyklus regulering, signalering, metabolisme, adhæsion og translation. Fordi denne HSF1 signatur er forbundet med dårlige patientresultater i forskellige typer af humane kræftformer herunder bryst-, lunge- og tyktarm, kan HSF1 være et mål for generelle og effektive kræftmedicin [11].

Med henblik på studere og styre funktionen af ​​HSF1 i celler og organismer, vi tidligere identificeret en RNA-aptamer, AptHSF-RA1 [12]. Aptameren blev oprindeligt isoleret i en

in vitro

selektion forsøg under anvendelse Drosophila HSF1 som mål, og senere vist sig at være i stand til at genkende HSF1 i gær, Drosophila og mennesker. Deletionsanalyse defineret en minimal binding motiv i aptamer består af to stilke og en stamme-løkke forbundet ved en 3-vejs krydset [12]. Denne aptamer interagerer med DNA-bindingsdomænet og en tilstødende linker region HSF1, og konkurrerer med de varmechok DNA-elementer (HSEs) om binding til HSF1. I gær celleekstrakter, aptameren inhiberer transskription fra varmechok-promotorer, og når det udtrykkes i levende gærceller, den producerer en temperaturfølsom vækstretardering fænotype og specifik reduktion af varmechok genekspression [13]. I Drosophila, denne aptamer reducerer Hsp83 niveauer og forårsager udviklingsmæssige abnormaliteter, der efterligner fænotyper af Hsp83 reduktion. Den aptamer også effektivt undertrykker de fænotyper fremkaldt af konstitutivt aktive former af EGF-receptoren og Raf oncoproteiner, som er reguleret »kunde« proteiner af Hsp83 [14].

Her i nærværende undersøgelse, rapporterer vi anti- cancer aktivitet af denne HSF1 aptamer i dyrkede humane celler. Vi vedtog den dimere konfiguration af AptHSF-RA1 anvendes i Drosophila [14], som blev opkaldt iaRNA

HSF1 ( “ia” står for “hæmmende aptamer”), og givet den i HeLa cervikal carcinomaceller i form af en syntetisk gen ved transfektion. Den anti-cancer aktivitet af aptamer blev derefter undersøgt gennem tre linjer af undersøgelser. Først, vi bekræftet den molekylære mekanisme af aptamer handling ved at bestemme afbrydelse af HSF1 samspil med sine beslægtede DNA elementer

in vitro

og

in vivo

. For det andet, vi demonstreret evne til aptamer, når det udtrykkes i cancerceller, til at fremme apoptose og inhibere kolonidannelse i blød agar. Endelig har vi behandle spørgsmålet om specificitet i celler ved at vise: (1) aptameren fænotyper undertrykkes ved overekspression af HSF1 eller HSP’er, (2) aptamer udtryk reducerer HSF1 target genekspression, og (3) aptamer udtryk reducerer HSF1 moduleret, MAPK-signalvejen. Kollektivt vores resultater enig med tidligere rapporter, der viser, at HSF1 er kritisk for opretholdelse af cellulær transformation. Desuden vores resultater hæve den interessante mulighed at en aptamer, der funktionelt inaktiverer HSF1 kan anvendes til at blokere human cancer progression.

fremgangsmåder og materialer

Ekspressionskonstruktioner

Sekvensen af det dimere aptamer konstruktion iaRNA

HSF1 er følgende (de små bogstaver repræsenterer hammerhovedribozym): 5′GUCGAGUGACGUUGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUCGGAAUUCAACUGCCUUCGUCAUACUCCUUGAAUUCAACUGCCUUCGGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUGGAGGCUCGACguc uagcgaugugguuucgcuacugaugaguccgugaggacgaaac 3 ‘. I processen med at konstruere ekspressionsvektoren til den dimere aptamer, et antisense kontrol-konstruktion, RevRA1, blev genereret under anvendelse af primersæt der byttes de parentale og tilbagestående strenge af aptamer-kodende region og samtidig holde hammerhoved enhed intakt. Både sense- og antisense enheder blev klonet i gateway vektorer [14] og flyttede ind pDest51 (Invitogen) til ekspression af aptameren og kontrollen i pattedyrceller. Den kodende sekvens af “redning” proteiner og deres kontroller, herunder HSF1, HSP90, HSP70, LacZ og GFP blev hver klonet nedstrøms for CMV-promotoren i en anden vektor med G418 som den selektive markør.

Cellekultur og transfektion

Celler anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra ATCC og opretholdt i henhold til fabrikantens instruktioner. HeLa (CCL-2), IMR-90 (CCL-196), 293T (CRL-3216), MCF7 (HTB-22), U87 MG (HTB-14), og BE (2) -M17 (CRL-2267) celler blev dyrket i E-MEM lav glucose-medium (ATCC) suppleret med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO

2. MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) blev dyrket i RPMI-medium suppleret med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO

2. De 293T-celler blev dyrket i DMEM høj glucose medium (ATCC) suppleret med 10% FBS, 1X Pen /Strep i 5% CO

2. Efter vækst til sammenflydning, blev cellerne trypsiniseret og ledes i frisk medium ifølge ATCC instruktioner. Disse forældre celler blev transficeret med iaRNA

HSF eller RevRA1 RNA kontrol-udtrykkende vektorer. Ikke-transficerede celler blev efterfølgende fjernet fra populationen ved dyrkning af cellerne i 6 ug /ml blasticidin og vaske cellerne 24 timer efter transfektion. Derefter blev celler opretholdt og dyrket i (1 ug /ml) blasticidin. Kun blasticidin-resistente celler blev anvendt i hele efterfølgende assays. For de “rednings” -forsøg, konstruktioner udtrykker human HSF1 (hHSF1), human Hsp90 (hHSP90), human Hsp70 (hHSP70), LacZ, eller GFP blev blandet med ekspressionsvektorer for HSF aptamer (eller kontrol-RNA) ved et 20:01 forhold at sikre korrekt og overskydende udtryk for de interesserede mål i forhold til de aptamerer. Efter plasmiderne blev blandet, blev hver blanding transficeret ind i HeLa-celler i 6-brønds skåle. Ikke-transfekterede celler blev skyllet væk ved brug af metoder, der er beskrevet ovenfor, og de resterende celler blev opretholdt i selektionsmedium.

EMSA

Den generelle ordning for elektroforetisk mobilitet (EMSA) blev vedtaget og ændret fra tidligere arbejde [12]. RNA-prober blev internt mærket med [a-

32P] UTP under anvendelse af en T7

in vitro

transcription kit (MAXIscript, Ambion, Austin, TX). De 10 pi bindende opløsning indeholdt 1X bindingsbuffer, 1 ug bærer gær-RNA, 4 ug bærer BSA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 6 enheder SUPERase-In (RNase-inhibitor), plus protein og mærket RNA aptamer. Koncentrationen af ​​det mærkede RNA-probe er under 1 nM i de fleste eksperimenter. Det humane HSF1 genet blev opnået fra Thiele Lab [15] og blev subklonet ind i Gateway Ekspressionssystem en His-fusion. Den bakterielt udtrykte His-mærket hHSF protein blev renset ved Ni-NTA kromatografi. Dette oprensede His-mærket hHSF1 protein blev inkuberet med aptamer RNA ved stuetemperatur i 30 minutter og 10 minutter ved 4 ° før pålæsning på en 6-9% nativ polyacrylamidgel. Gelerne indeholdt 1/4 TBE puffer og 1 mM MgCl

2 og blev kørt ved 100-150 V ved 4 ° C i 1-2 timer.

RT-PCR

RT -PCR blev udført 24 timer efter transfektion ifølge en protokol beskrevet tidligere ved hjælp af følgende primere

iaRNA

HSF1 F:.

5′-GTCGAGTGACGTTGGCATCG

iaRNA

HSF1 R:

5’GACGTCGAGCCTCCAAGAAC

iaRNA

Rev F:

5′-GTCGAGCCTCCAAGAACTCG

iaRNA

Rev R :

5’GACGTCGAGTGACGTTGGCA

chromatin Immunfældning (chip)

chip assay blev udført 36 timer efter transfektion ifølge en protokol beskrevet tidligere [16] ved hjælp af antistoffer mod HSF1 eller HSF2 venligst leveret af Dr. Richard Morimoto.

Western blots

prøver blev fremstillet 72 timer efter transfektion for molekylær analyse medmindre andet er angivet. Ved undersøgelsen af ​​caspase-3 prøver blev forberedt mellem 72-96 timer. Kort fortalt blev celler fodret hver 48 timer, og prøver blev opsamlet ved centrifugating medierne, pelletering af cellerne. Også blev adhærente celler skrottet i PBS, pelleteret og kombineres med cellerne i medierne. Derpå blev prøver lyseret i nærvær af nonioniske detergenter indeholdende proteaseinhibitorer, og prøverne blev kogt i nærværelse af 6X-SDS. Konventionelle Western blot-protokoller blev anvendt med de følgende antistoffer. Primære antistoffer: G6PDH blev indkøbt fra Sigma (A9521). Alle andre antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Inc .: HSF1 (nr 4356), Hsp90 (nr 4875), Hsp70 (nr 4872), Hsp60 (nr 4870), Hsp40 (nr 4868), calnexin (nr 2433), GRP78 (nr 3177), EGFR~p (nr 2234), Erk1 /2~p (nr 9146), total ERK1 /2-(nr 9102), Caspase-3 (# 9662). Den PARP antistof var anti PARP-DBD, en gave fra Dr. W.L. Kraus, og transglulaminase (TGM2) var en gave fra Dr. R. Cerione laboratorium købt hos Thermo Scientific. Sekundære antistoffer blev anvendt i overensstemmelse med god immunreaktivitet. PVDF-membraner blev blokeret med 5% BSA og membraner blev inkuberet primære antistoffer natten over ved 4 ° C.

Apoptotisk assay

Apoptose blev observeret ved kvantificerer antallet af HeLa celler indeholdende fragmenterede kerner som visualiseret ved DAPI-farvning under mikroskopet. I disse forsøg blev parentale, iaRNA

HSF eller RevRA1 RNA kontrolceller observeret i 96 timer efter transfektion. I disse eksperimenter ikke-transficerede iaRNA

HSF blev fjernet ved dyrkning af cellerne i 6 ug /ml blasticidin og vaske cellerne 24 timer efter transfektion. Kun blasticidin-resistente celler blev anvendt i hele efterfølgende assays. Alle statistiske analyser i denne undersøgelse blev beregnet ved anvendelse t-test.

Forankringsuafhængig vækst assay

6 × 10

3 semi-stabile transficerede celler blev udpladet på 6-brønds skåle i passende medium suppleret med 3% agarose (type VII, Sigma A4018) over en varm lag af præ-størknet medium indeholdende 6% agarose (Type VII, Sigma A4018). Fem dage efter udpladning af cellerne en ny 1 cm lag af medium blev udpladet i de voksende celler. HeLa celler indeholdende 17-AGG havde en slutkoncentration på 8,8 ug /dl agar-blanding 17-AAG. Cellers evne til at vokse på blød agar blev evalueret efter 14 dage. Kolonier blev analyseret under lysmikroskop.

Resultater

iaRNA

HSF1 forhindrer HSF1 binde sine regulatoriske DNA elementer i HeLa carcinomceller

Tidligere vi udviklet en metode til levering af RNA aptamerer i kerner af celler som syntetiske gener [17], og brugte det til at udtrykke aptamer for HSF1, AptHSF-RA1, i Drosophila [14]. Dette RNA konstruktion, opkaldt iaRNA

HSF1, indeholder to aptameric enheder til forbedret aviditet og en hammerhovedribozym hvori 5′- og 3′-enderne af RNA’et beskyttes for at lette foldning og stabilitet. Vi tilpasset denne konstruktion ved at placere dens kodende sekvens under kontrol af den EF-1a-promotoren i en pattedyrekspressionsvektor. Vi lavede også en kontrol konstruktion, opkaldt RevRA1, hvor aptamer delen af ​​iaRNA

HSF1 blev erstattet af sin antisense-sekvens. Før du bruger den på celler, vi produceret dette RNA ved

in vitro

transskription og bestemt sin iver for oprenset humant HSF1 i en elektroforetisk mobilitet (EMSA) (figur 1A) ved hjælp af oprenset humant HSF1 protein (figur S1A) . Her iaRNA

HSF1 genereret et forskudt kompleks med en tilsyneladende K

d på 25 nM (figur 1B). I modsætning hertil har den RevRA1 kontrol ikke nogen bindende. Hertil kommer, når begrænsende mængder af iaRNA

HSF1 blev inkuberet med høje mængder af oprenset BSA (1 uM), ingen skiftede bånd blev observeret. Tilsammen

in vitro

resultater viste, at interaktionen mellem iaRNA

HSF1 og HSF1 opstår med høj affinitet og er relativt selektiv.

(A) Elektroforetisk motilitet (EMSA) ved hjælp af radioaktivt mærket iaRNA

HSF1 (1 nM) og stigende mængder af humant HSF1 protein viser, at aptamer binder til sit mål begærligt. (B) Kvantificering af uafhængige EMSA afslører den tilsyneladende affinitet iaRNA

HSF1 for HSF1 som Kd~25 nM (n = 5).

Næste, vi transficeret den iaRNA

HSF1 udtrykkende vektor i en cancer og en ikke-transformeret cellelinie. Vi valgte HeLa cervikale carcinomceller som en repræsentativ cancercellelinie, fordi de er en af ​​de mest almindeligt anvendte og godt karakteriserede humane cancercellelinier [18]. Som en ikke-transformeret cellelinie, anvendte vi IMR-90-celler, der er ikke-transformerede, ikke-immortaliserede humane lungefibroblaster [19]. Som en kontrol for den funktionelle aptamer, brugte vi RevRA1 udtrykke vektor. For at bekræfte ekspressionen af ​​konstruktionerne i cellerne, udførte vi revers transkription og kvantitativ PCR (RT-qPCR) assays under anvendelse primersæt, der genkender dimere iaRNA

HSF1 eller kontrol RevRA1 24 timer efter transfektion. Vores resultater viste, at RNA-aptamer-niveauer var ens for både aptameren og kontrol-RNA i HeLa og IMR-90-celler (figur 2A).

(A) Kontrol-RNA (RevRA1) og aptamer RNA (iaRNA

HSF1) konstruktioner er udtrykt til lignende niveauer i HeLa og IMR90 celler efter 24 timer efter transfektion (RNA værdier normaliseret til GAPDH, n = 3). (B) Forstyrrelse af HSF1 samspil med sine beslægtede DNA elementer ved iaRNA

HSF1. Chip assays i iaRNA

HSF1 (eller RevRA1), der udtrykker HeLa-celler viser, at iaRNA

HSF1 udtryk effektivt kan hæmme HSF1 binding til

Hsp90

Hsp70

promotor loci

in vivo

(n = 3). Antistoffer der anvendes i chip assays er specifikke for mammale HSF1 eller HSF2 proteiner [20]. BG = Background.

For at bekræfte den molekylære mekanisme aptamer handling, vi fastslået, om iaRNA

HSF1 effektivt forhindret HSF1 binde sine regulatoriske DNA elementer i celler. Til dette formål udførte vi chromatin immunoprecipitation (chip) assays af iaRNA

HSF1 eller RevRA1 udtrykkende HeLa-celler (36 timer efter transfektion, før cellerne undergår apoptose-se nedenfor) under anvendelse af et antistof specifikt for pattedyr-HSF1 [20] . Vi fandt, at iaRNA

HSF1 udtryk væsentligt kompromitteret HSF1 binding til centrale varmechokpromotorer (

Hsp90

Hsp70

)

in vivo

(figur 2B). Fordi pattedyr indeholder to varmechokproteiner, HSF1 og HSF2, og det DNA-bindende domæne er stærkt bevaret mellem dem, vi også testet, om vores aptamer inhiberer HSF2 binding. Vi fandt, at iaRNA

HSF1 udtryk på samme måde forhindrer HSF2 binding til

Hsp90

Hsp70

promotor

in vivo

(figur 2B). Det er muligt, at aptamer inhiberer både transkriptionsfaktorer eller inhibering af én faktor binding kan påvirke promotor belægning på den anden, som både HSF1 og HSF2 er kendt for at regulere specifikke heat shock-gener [21]. Ikke desto mindre de meget lavere niveauer af HSF2 på initiativtagerne, i forhold til HSF1 (bemærk 50-fold forskel i y-aksens skala), opdaget af Chip på

Hsp90

og

Hsp70

initiativtagere og reduceret affinitet af aptamer for HSF2 (figur S1B) tyder på, at de primære hæmmende virkninger af aptamer på nedstrøms genekspression er gennem HSF1, i hvert fald under disse betingelser i HeLa-celler.

iaRNA

HSF1 udtryk fremkalder apoptose og dæmper den transformerende kapaciteter af kræftceller

Dernæst vi undersøgte den virkning, at aptamer har på overlevelsen af ​​HeLa-celler og de ikke-transformerede IMR-90 celler. Fire dage (96 timer) efter transfektion cellerne med enten iaRNA

HSF1 eller RevRA1 blev cellulær levedygtighed og apoptose kvantificeres ved direkte observation af de celler, der var aktivt undergår celle blæredannelse, nuklear sammenbrud og kromatisk fragmentering. Vi fandt, at aptamer ekspression i de ikke-transformerede IMR-90 celler forårsagede lidt, om nogen morfologiske ændringer (figur 3A) eller induktion af celledød (figur 3B). I modsætning hertil aptamer forårsagede en ca. 9 ganges forøgelse i celledød af HeLa cancercellelinie (63% af befolkningen,

s

= 0,0001). Som allerede påvist ovenfor i figur 2A, disse forskelle var ikke på grund af forskelle i niveauerne af aptamer ekspression mellem den ikke-transformerede og transformerede cancercellelinier. For at demonstrere den generelle betydning af denne effekt, spurgte vi, om udtryk for iaRNA

HSF1 i omdannes kemisk humane 293T nyre cellelinje tilsvarende ville dræbe cellerne. Vi fandt, at iaRNA

HSF1 ekspression i 293T-celler dramatisk forårsager celler at runde op og løsnes fra deres dyrkningsplader, svarende til HeLa-celler (figur 3A). Sammenlignet med de parentale og kontrol celler der var en ca. 7 gange forøgelse af apoptose i iaRNA

HSF1 udtrykker 293T-celler, med en

s

-værdi på 0,0018 (figur 3B).

(A) iaRNA

HSF1 udtryk påvirker ikke normale celler (IMR90), men inducerer en unormal morfologi i HeLa livmoderhalskræft og kemisk transformerede nyreceller (293T). (B). Cellekernekondensation og fragmentering assays afslører, at iaRNA

HSF1 ekspression inducerer ~ 10 gange stigning i apoptose i HeLa-celler (p 0,0001) (n = 8), og ~ 7-gange stigning i apoptose i 293T-celler (p 0,0001 ) (n 8). Desuden iaRNA

HSF1 induceret apoptose i effektivt undertrykt af overekspression af molekylære chaperoner (HSF1 p 0,006, Hsp90 p 0,005 eller Hsp70 p 0,002), men ikke tilfældige proteiner (GFP eller LacZ) (n 8).

Da en brøkdel af iaRNA

HSF1-udtrykkende cancerceller ikke undergår apoptose (ca. 30%), vi søgte at afgøre, om disse celler blev kompromitteret i deres evne til at danne kolonier i forankringsuafhængige (blød agar) vækst analyser, en

in vitro

måling af tumorgenicity. Som forventet, HeLa-celler, der udtrykker en kontrol-RNA-sekvens (RevRA1) dannet store kolonier i blød agar (figur 4); dog HeLa celler, der udtrykker iaRNA

HSF1 ikke. Dette indikerede, at HeLa-celler, der udtrykker HSF1 aptamer, der ikke undergår apoptose inden for de første 96 timer af dets ekspression kompromitteres i deres transformation kapacitet. Disse resultater giver yderligere støtte, at HSF1 faktisk er nødvendig for opretholdelse af den transformerede kræft fænotype, der ligner tidligere rapporter [22].

HSF1 hæmning af iaRNA

HSF1 hæmmer forvandlet vækst i blød agar. Blød agar analyse af ikke-transficerede HeLa-celler (øverst til venstre) eller kontrol-RNA over-udtrykkende HeLa (nederst til venstre), viser, at iaRNA

HSF1 overekspression (nederst til højre) inhiberer cellulær transformation (kolonidannelse) på en lignende måde som behandling af HeLa-celler med 150 nM 17-AAG (øverst til højre) (dag 14).

Fordi HSP90 er co-reguleret af HSF1 og er vigtig for kræft cellevækst [23], vi yderligere sammenlignet de inhiberende virkninger af iaRNA

HSF1 mod en potent Hsp90 inhibitor 17- (allylamino) -17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) på kolonidannelse i blød agar. I lighed med iaRNA udtrykkende celler, HeLa-celler dyrket i nærvær af 150 nM 17-AAG var ude af stand til at danne kolonier i blød agar (figur 4). Samlet set disse resultater tyder på, at den funktionelle inaktivering af HSF1 af iaRNA

HSF1 reducerer ekspressionen af ​​centrale HSF1-regulerede gener, som igen er afgørende for opretholdelsen af ​​den transformerede fænotype.

iaRNA

HSF reduceret chaperone niveauer og svækkede den MAPK pathway i HeLa-celler

Drug target validering og terapeutisk udvikling kræver streng sikkerhed for specificitet. Dette spørgsmål er relevant for HSF1 aptamer beskrevet her, da det blev isoleret ved anvendelse af en ortologe protein. Men manglende off-target effekter er vanskeligt at bevise i den komplekse miljø i levende celler. Således har vi nærmede dette spørgsmål fra tre forskellige vinkler på det molekylære niveau for at dokumentere årsagssammenhængen mellem aptamer udtryk og tabet af den transformerede fænotype i humane cancerceller. Først tog vi en genetisk fremgangsmåde, der ligner faktor titrering eller add-back eksperimenter, hvor aptameren inducerede virkninger vendes ved tilsætning af overskud af målprotein [17]. For nylig har vi med succes anvendt denne strategi i Drosophila og fandt, at de udviklingsmæssige abnormaliteter induceret af iaRNA

HSF1 kunne undertrykkes ved overekspression af HSF1 [14]. Efter dette eksempel, vi undersøgt, om HSF1 overekspression kunne redde kræftceller, der udtrykker iaRNA

HSF1 fra undergår apoptose. Vi fandt, at ektopisk ekspression af HSF1 eller HSF1-regulerede gener, som er vigtige for at fremme celleoverlevelse nemlig

Hsp70

Hsp90

kan redde aptamer-medierede apoptotiske respons, sammenlignet med den udtryk for kontrol proteiner (LacZ eller GFP) (figur 3B).

for det andet, vi bekræftet kausalitet mellem aptamer udtryk og dens virkning på HSF1 hæmning ved at måle niveauet af produkterne af gener er kendt for at være kontrolleret af HSF1 binding, som inhiberingen af ​​HSF1 binding af aptamer skulle forårsage et fald i disse proteiner. Vi målte de totale niveauer af forskellige molekylære chaperoneproteiner 72 timer efter transfektion i parentale (ikke-transficeret), kontrol-RNA (Rev) og iaRNA

HSF1-udtrykkende HeLa-celler (figur 5A). Vigtigere, blev niveauerne af HSP70, calnexin, transglutaminase 2 (TGM2), og Grp78 alvorligt nedsat i aptamer udtrykkende celler. HSP90-ekspression blev også reproducerbart faldet, om end i mindre grad end HSP70. I modsætning hertil var niveauet af mitokondrie specifikke HSP60 chaperone ikke påvirket af aptamer, hvilket antyder, at HSP60 er enten et meget stabilt protein med en lang halveringstid, der er tolerant over for de proteolytiske begivenheder af apoptose eller dens ekspression er uafhængig af HSF1 transkriptionel aktivitet. I disse eksperimenter blev apoptose detekteret ved at analysere for spaltning af caspase-3 target PARP. For at løse hvorvidt den observerede nedgang i HSP70, calnexin, transglutaminase (TGM2), og Grp78 skyldtes HSF1 hæmning eller en konsekvens af den aptamer inducere apoptose målte vi de totale niveauer af chaperoner i HeLa-celler, der udtrykte iaRNA

HSF men blev forhindret i at komme ind apoptose ved co-udtrykkende HSP90. Svarende til, hvad vi har observeret i celler, der udtrykker kun iaRNA

HSF1, de celler, der udtrykker både iaRNA

HSF1 og HSP90, observerede vi et generelt fald i de samlede niveauer af udvalgte molekylære chaperoner, HSP70 (-50%), calnexin (-50%), og Grp78 (-25%) i forhold til forældrenes HeLa eller kontrol celler (udtrykker RevRA1) (figur 5B, n = 4). Denne observation tyder på, at reduktionen af ​​molekylære chaperoner ved iaRNA

HSF1 skyldes, i det mindste delvist, til den generelle nedgang i HSF1 aktivitet på dens gen-mål.

(A) Western blot analyse, der viser nedbrydningen af specifikke molekylære chaperone-proteiner i aptamer eller kontrol udtrykkende celler. Hsp90 co-ekspression redder specifikke molekylære chaperoner observeret i HSF1 hæmmede aptamer udtrykker celler. Stjernen angiver PARP nedbrydningsprodukt, en markør af apoptose. Længst til venstre tre baner er en seriel fortynding af forældrenes line ekstrakter, der giver en kvantificering standardkurve. (B) Kvantificering af resultaterne observeret i panel A (n = 4, fejl angiver% SEM).

Vi validere de ovenstående resultater og udnytte kraften i pattedyr genetik ved sondering for HSP70 og HSP90 hjælp mus embryonale fibroblast, der er udledt af levedygtige og fertile hSF1 null mus (

hsf1 – /-

) genereres i Benjamin Ivor laboratorium [24]. Blandt pattedyr, HSF1 viser høj strukturel og funktionel bevaring [15], [20] På samme måde som HSF1 hæmning af aptamer, finder vi, at

hsf1 – /-

celler har relativt mindre indvirkning på de samlede niveauer af Hsp90 protein, alligevel viser store virkninger på Hsp70 under normale vækstbetingelser sammenlignet med vildtype MEF (Figur S2).

for det tredje, vi undersøge, hvordan hæmme HSF1 af vores aptamer dæmper aktiveringen af ​​MAPK signalvejen . Drosophila MAPK-vejen er tidligere rapporteret af os at blive berørt af HSF1 aptamer [14]. Ligeledes Lindquist og Gius Laboratories har vist, at HSF1 udtømning også påvirke denne vej [22] – [23], [25]. Her viser vi i humane celler, HSF1 inhibering med aptamer påvirkede de samlede niveauer for klinisk relevante oncoproteiner, Ras, Raf, og Akt, før igangsættelsen (48 timer) og under aptamer induceret apoptose (96 timer). I forhold til RevRA1 kontrol, aptamer udtrykkende celler viste et progressivt fald i niveauerne af Ras, Raf, og AKT på en måde, der var også i overensstemmelse med de faldende niveauer af fuld længde caspase-3, en bonified markør af apoptose [ ,,,0],26] (fig S3A). Vi finder, at disse resultater kan være delvist undertrykt af co-ekspression af hHSF1 både biokemiske og morfologiske analyser (Figur S3 A ​​ B).

For direkte at undersøge muligheden for iaRNA

HSF1 at hæmme MAPK aktivitet i humane cancerceller, vi stimulerede HeLa-celler, der udtrykker aptamer eller kontrol-RNA med mitogenet, epidermal vækstfaktor (EGF), og undersøge virkningerne det havde på aktivering af receptoren EGF eller MAPK signalering ved at indsamle celler 10 minutter efter behandlingen og prøverne analyseres ved Western blotting. Vigtigere, udførtes disse forsøg i en tid, hvor cellerne ikke var aktivt undergår apoptose som visualiseret ved det intakte PARP-protein (36 timer efter transfektion) (figur 6A). Samlet, finder vi, at parentale eller kontrol-RNA-udtrykkende HeLa-celler udtrykker en betydelig mængde epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), der kan aktiveres som reaktion på epidermal vækstfaktor-stimulering (p-EGFR) (figur 6A). I modsætning hertil målretning HSF1 aktivitet med aptamer faldt mængden af ​​aktiveret EGFR (p-EGFR) (figur 6A). For at undersøge virkningen af ​​denne aptamer havde på mitogen signaleringsaktivitet, vi probet for aktiverede ERK1 /2-niveauer, medlemmer af MAPK, der fungerer nedstrøms for EGFR. Her finder vi, at celler, der udtrykker HSF1 aptamer indeholder reducerede mængder af actived Erk1 /2 (phosphoryleret), der er ledsaget af en reduktion i de samlede niveauer af ERK1 /2-protein -75%, sammenlignet med de celler, der udtrykker kontrol aptamer (figur 6B). I en lignende måde, og som et bevis på princippet, vi supplere disse eksperimenter ved hjælp WT og

hsf1 – /- Restaurant MEF’er og opdager, at HSF1 K.O. celler udviser en kompromitteret evne til aktiv Erk1 /2 (p-Erk1 /2) (Figur S4). Denne svækkede MAPK signalering respons kan undertrykkes ved overekspression k-Ras

G12V i

hsf1 – /-. Salg MEF celler

(A) HSF1 inhibering dæmper EGF-receptor-aktivering efter tilsætning af EGF til HeLa-celler. (B) HSF1 inhibering med iaRNA

HSF1 forårsager en udtynding af de samlede niveauer og aktiverede former af Erk1 /2.