PLoS ONE: Expression og funktionelle rolle af Orphan Receptor GPR158 i prostatakræft vækst og progression

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed, efter lungekræft, i mænd fra udviklede lande. I de tidlige stadier, primær tumorvækst er afhængig af androgener, således generelt kan styres af androgen deprivation terapi (ADT). Vinder dog sygdommen skrider frem til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), en dødelig form, der har behov for mere effektive behandlinger. G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) omfatter en stor klan af celleoverfladeproteiner, der har været impliceret som terapeutiske mål i PCa vækst og progression. Resultaterne rapporteres her giver spændende bevis for en rolle for nyligt karakteriseret glutamat familiemedlem GPR158 i PCa vækst og progression. Vi fandt, at GPR158 fremmer PCa celleproliferation uafhængigt af androgen receptor (AR) funktionalitet og at dette kræver dens lokalisering i kernen af ​​cellen. Dette antyder, at GPR158 virker ved mekanismer forskellige fra andre GPCR. GPR158 udtryk stimuleres af androgener og GPR158 stimulerer AR udtryk, hvilket indebærer et potentiale for at bevidstgøre tumorer til lav androgen forhold under ADT via en positiv spiral. Endvidere fandt vi GPR158 udtryk korrelerer med en neuroendokrine (NE) differentiation fænotype og fremmer forankringsuafhængig kolonidannelse indebærer en rolle for GPR158 i terapeutisk progression og tumordannelse. GPR158 ekspression blev øget på invaderende foran prostatatumorer, der er dannet i genetisk definerede betingede

PTEN

knockout musemodel, og co-lokaliseret med forhøjet AR ekspression i cellekernen. Kaplan-Meier analyse på et datasæt fra Memorial Sloan Kettering kræft genom portal viste, at øget GPR158 udtryk i tumorer er forbundet med lavere sygdomsfri overlevelse. Vores resultater tyder på, at lægemidler rettet mod GPR158 aktiviteter kunne repræsentere en ny og innovativ tilgang til forebyggelse og håndtering af CRPC

Henvisning:. Patel N, Itakura T, Jeong S, Liao CP, Roy-Burman P, Zandi E, et al. (2015) Udtryk og funktionelle rolle af Orphan Receptor GPR158 i prostatakræft vækst og progression. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10,1371 /journal.pone.0117758

Academic Redaktør: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Storbritannien

Modtaget: August 7, 2014 Accepteret: December 23, 2014; Publiceret: 18 feb 2015

Copyright: © 2015 Patel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud [R01-EY09828] til MEF og [R01-CA136924] til GAC. Robert E. og maj R. Wright Foundation pris til NP og MEF også ydet støtte til at gennemføre denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser. Nitin Patel og M. Elizabeth Fini er co-opfindere på en foreløbig US patentansøgning med titlen “GPR158 som en ny målsætning for prostatakræft terapi”, anvendes af University of Southern California (USC). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

G-protein koblede receptorer (GPCR’er) omfatter en stor klan af celleoverfladeproteiner der udføre forskellige cellulære funktioner. GPCR’er fornemmer information om miljøet og typisk transduktion et signal i cellen ved binding og aktivering af heterotrimere G-proteiner ved ekstracellulær ligand binding [1]. Medlemmer af denne klan er blevet udnyttet i udstrakt grad til lægemiddelforskning og en stor del af tiden anvendte lægemidler i målgruppe GPCR [2]. GPCRs inddeles i syv familier via fylogenetisk analyse af deres definerende funktion: de syv transmembrane (7TM) domæne [1]. GPCR glutamat familien indeholder 7 orphan-receptorer, tre tilhørende gamma-aminosmørsyre receptor gren: GPR156, GPR158, og GPR179 [3,4]. GPR179 blev for nylig vist at være nødvendig for depolariserende bipolar celle funktion i nethinden, og mutationer forårsager autosomal-recessive fuldstændig medfødt stationær nat blindhed [5,6]. To meget nylige publikationer giver den første karakterisering af GPR158 [7,8]. Den første identificerede GPR158 ekspression i retinale bipolære neuroner og demonstrerede en usædvanlig rolle som plasma membranscaffoldprotein, funktion at inhibere signalering af GPCR’er at par med den inhiberende familien af ​​Galpha proteiner ved binding til Gbeta5 og rekruttering medlemmer af R7 familien af ​​GTPase Aktivering proteiner (gaps) til plasmamembranen [7]. Den anden publikation var fra vores laboratorium [8]. Vi identificerede GPR158 udtryk i trabekelværket (TBM) celler i øjets vandige udstrømning veje og dens rolle i reguleringen af ​​celle barrierefunktion, muligvis bidrage til patofysiologien af ​​steroid-induceret okulær hypertension og glaukom.

Søgning efter anden mulige roller for GPR158, der er konstateret vi en offentliggjort microarray undersøgelse, der viser GPR158 som et af generne opreguleret i androgen ablation-resistente metastatisk tumor i sammenligning med primære prostatatumorer [9]. En anden genekspression microarray undersøgelse viste nedregulering af GPR158 ved tilbagetrækning af østrogen i humane estrogenfølsomme brystcancerceller eller ved tamoxifen (anti-østrogen) behandling [10]. Måske ikke tilfældigt, involverer både kræftformer ændret respons på steroid hormoner. Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed efter lungekræft hos mænd fra de udviklede lande [11]. I første omgang, spredning af PCA celler afhænger af androgener, således androgen-deprivationsbehandling (ADT) er den primære behandling for patienter med lokalt fremskreden PCa. ADT giver remission af sygdommen i mere end 90% af patienterne dog varigheden af ​​respons er typisk 2-3 år. Trods ADT behandling, metastatisk PCa og tilbagevendende sygdom afkast efter svigt af lokaliserede behandlinger [12], en proces kendt som kastrationsresistent PCa (CRPC). Samlet set metastatisk CRPC patienter har en median overlevelse på kun 16-18 måneder, og sygdommen er stadig uhelbredelig [13].

Det er almindeligt anerkendt, at CRPC udvikler gennem flere mekanismer, herunder androgen receptor (AR) -afhængige veje såsom AR-amplifikation og overekspression [14]; lokal androgen syntese [15]; ændret ekspression af AR co-aktivator og co-repressorproteiner; og AR-uafhængige veje såsom alternative overlevelse veje [16]. Målretning AR pathway har vist sig at tilbyde den mest mulig fremgangsmåde for nye terapeutiske midler, da AR forbliver aktiv i CRPC [17]. En anden mulig terapeutisk fokus til PCA terapi er den neuroendokrine (NE) cellefænotype. Denne celletype forekommer i spredte foci indenfor prostataadenocarcinom, ligner dens spredning i duktale epitelceller i normal prostata. Imidlertid densiteten af ​​NE-celler er ofte større i prostatacarcinomer end i normalt væv, og undersøgelser har vist, at NE differentiering (NED) er beriget i høj kvalitet og høj-stage tumorer, og tæt forbundet med fremkomsten af ​​CRPC [18 -20]. Prostata epitelceller menes at transdifferentiate til NE-celler, som er vist at være forskellig fra den mindre population af NE celler til stede i normal prostata [18-20]. NE celler kan fremme proliferation af hosliggende adenocarcinomceller i en androgen-sultede tilstand, hvilket fører til CRPC [21], som støttes af observationerne af højere proliferative indeks af proksimale PCA celler til NE-celler sammenlignet med distale cancerceller [22, 23]. Desuden har studier af cellekulturer fastslået, at neurohormoner og neuropeptider udskilles af NE-celler kan understøtte androgen-uafhængig vækst af PCA-celler [24,25]. Men den nøjagtige oprindelse og årsagsfaktorer af NED fortsat ukendt. Derfor er identifikation af nye gener og molekylære mekanismer for forbindelsen mellem disse flere veje er ansvarlige for patogenesen af ​​CRPC udtalt behov for at udvikle nye behandlingsmetoder.

PCa er typisk forbundet med genetiske ændringer involverer androgen følsomhed og AR [26] . I denne rapport, undersøgte vi udtrykket, molekylære regulering, subcellulære lokalisering og funktionelle rolle af GPR158 ved hjælp af et sæt af fire humane PCA cellelinjer med forskellige ændringer i AR resulterer i forskellige grader af androgen-lydhørhed, androgen-følsomhed og AR udtryk. Vi kombinerer dette med en mus PCa model og bioinformatik analyse af humane PCA datasæt. Vores resultater tyder på, at forhøjelse af GPR158 udtryk er en vigtig onkogen begivenhed, der stimulerer PCa celledeling og progression, og dermed kan udgøre en innovativ terapeutisk mål.

Materialer og metoder

Cell Culture

Primære humane prostata-epitelceller (PHPECs) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og holdt, som pr deres anvisninger ved hjælp prostata epitelcelle basalt medium indeholdende cellevækst kit. Fire humane PCA cellelinier opretholdt i et af vore laboratorier (Coetzee) blev anvendt i disse undersøgelser: LNCaP, C4-2B, PC-3 og DU 145, alle opnået oprindeligt fra ATCC. LNCaP og C4-2B celler blev dyrket i komplet RPMI-medium, mens DU145 og PC-3-celler blev dyrket i DMEM-medium (Gibco-BRL, Bethesda, MA), begge indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 5% CO

2 ved 37 ° C. Cellerne blev delt hver 3. dag.

LNCaP-cellelinjen blev etableret fra en human lymfeknude metastatisk læsion af prostata-adenocarcinom. LNCaP-celler udtrykker AR bærer fælles T877A mutation i det ligandbindende domæne, skabe bred steroid bindingsspecificitet. De er androgen-responsiv, viser vækststimulering ved behandling med androgener, og de er også androgen-afhængige, undergår vækststandsning efter tilbagetrækning af androgener [27-29]. De C4-2B celler blev afledt fra en knoglemetastaser, der voksede i nøgne mus efter podning med LNCaP-afledte, kastrationsresistent c4-2 celler [30,31]. Ligesom LNCaP-celler, er C4-2B celler androgen-responsive. I overensstemmelse hermed de bevarer en funktionel AR, selv om det udviser lavere affinitet for androgener end AR i LNCaP-celler [32]. Men i modsætning til LNCaP-celler, er C4-2B celler androgen-ufølsom, fordi efter tilbagetrækning af androgener de ikke er genstand vækststandsning [33]. PC-3 og DU145 cellelinjer blev etableret fra human prostataadenocarcinom, metastatisk til hjerne eller ben, henholdsvis. PC-3 og DU 145 cellelinier anvendt i dette studie blev tidligere karakteriseret af en af ​​vores laboratorier (Coetzee) [34]. Begge linjer er androgen-nonresponsive og androgen-ufølsom. PC-3

AR + delaktionslinje anvendt i denne undersøgelse udtrykker lave niveauer af AR mRNA og protein. Selvom dette ikke resulterer i tilstrækkelig funktionelt protein til at give androgen-lydhørhed, ektopisk AR udtryk konsekvent fremkaldte en meget større transaktiveringsfunktion respons i denne sub-line end i PC-3

AR sub-line. De DU145 celler er AR negativ. Vi udførte vores egen western blot at bekræfte fravær eller nærvær af AR protein i disse to linier (S1 Fig.). Salg

Behandling af PHPEC, LNCaP og C4-2B celler med androgen, dihydrotestosteron (DHT, 10nM ), blev udført i dyrkningsmedier indeholdende 10% trækul-strippet serum (CSS) at nedbryder androgener. For androgen sult undersøgelser, LNCaP, PC-3, og DU145 celler blev dyrket i 10% CSS

Reagenser og oligonukleotidprimerne

De anvendte i undersøgelsen reagenser blev købt som følger:. Lipofectamine LTX med PLUS reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA); primære antistoffer til AR, prostataspecifikt antigen (PSA), neuron specifik enolase (NSE), epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og transkriptionsfaktor Sp1, og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-intracellulære domæne (ICD) og anti-ekstracellulært domæne (ECD) GPR158 antistoffer og anti-a-tubulin-antistoffer (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); anti-beta-actin antistof (Abcam, Cambridge, UK); high-fidelity DNA polymerase, Phusion (Finnzymes Inc., Woburn, MA); oligonukleotidprimere (Valuegene INC, San Diego, CA); trækul strippet føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals Inc., Lawrenceville, GA). Alle andre reagenser blev indkøbt fra Sigma. Tabel 1 tilvejebringer sekvenserne af alle oligonukleotidprimere anvendt i denne undersøgelse. For Knockdown eksperimenter, brugte vi en pulje af tre specialdesignede siRNA oligonukleotider (GenePharma Co. Ltd, Shanghai, Kina), hvis aktivitet vi karakteriseret tidligere [8].

Kvantitative Real-Time Reverse transkription-PCR (QRT-PCR)

totalt RNA isoleret fra PCA cellelinier med Aurum total RNA mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA), blev underkastet QRT-PCR-analyse under anvendelse iScript ettrins RT- PCR kit med SYBR Green (Bio-Rad) på CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) ifølge producentens anvisninger. Relative kvantificering værdier af gener af interesse blev beregnet som 2

-ΔΔCt ved sammenlignende Ct-metoden, hvor ΔΔCt = (Ct mål-mRNA af behandlet prøvespecifik Ct henvisning gen af ​​behandlet prøve) – (Ct mål-mRNA af kontrolprøven-Ct henvisning genet af kontrolprøven). Vi anvendte beta-actin eller GAPDH som reference gen. De primere, der anvendes til estimering af GPR158, AR, PSA og NSE udtryk er vist i tabel 1.

Western blot analyse

De hele cellelysater blev fremstillet under anvendelse radioimmunudfældning assay (RIPA) lysepuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 1% NP-40) tilsat med en cocktail af proteaseinhibitorer i 20 minutter, efterfulgt af centrifugering ved 10.000 g i 10 min. Supernatanter blev opsamlet, og proteiner i ekstrakterne blev separeret ved SDS-PAGE uden kogning af prøverne og overført til PVDF-membraner. Membraner blev undersøgt med primært antistof mod proteinet af interesse og er udviklet af kemiluminiscens med reagenser Luminol forstærker løsning og peroxid løsning (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, Storbritannien) og billeder blev taget med Fujifilm imaging system (LAS-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan). Protein belastning blev overvåget ved stripning og Fornyet probing af membranen med beta-actin antistof.

Expression Konstruerer

Tre ekspressionskonstrukter (GPR158-pcDNA 3.1 (+), GPR158-GFP og GPR158-NLS -M1 + 2-GFP) anvendes til disse undersøgelser blev beskrevet tidligere [8]. Vi genererede også en anden GPR158-GFP fusion konstruktion, der er udpeget som GPR158: ΔC (AA 1-665), med hele ICD sletning brug af egnede primere, der er anført i tabel 1.

Forbigående transfektion

angivne celler blev transficeret med enten ekspressionsplasmider eller siRNA-konstruktioner eller promoter reporter plasmider ved anvendelse af lipofectamin LTX reagens som pr leverandørens anvisninger. Kort fortalt 1-2 × 10

5 celler /brønd i 2 ml komplet medium blev podet i seks-brønds plader og dyrket, indtil 70-80% sammenløb. DNA (2 ug) blev fortyndet i 500 pi Opti-MEM I + PLUS reagens (2 pi), inkuberet i 5 minutter, blev lipofectamin LTX (4,5 pi) tilsat og inkuberet i 30 min. Cellemedium blev erstattet med frisk 2 ml antibiotika frit medium, og blandingen blev tilsat og inkuberet i 6 timer. Efter inkubation blev komplekserne erstattet med komplet vækstmedium. På 3 dage efter transfektion blev cellerne behandlet til enten QRT-PCR-analyse eller Western blotting eller celletælling.

lentivirus Production and Cell transduktion

GPR158 cDNA blev subklonet fra pcDNA 3.1 (+), beskrevne ekspressionsvektor ovenfor, ind i pSLIK lentivirale ekspressionsvektor (Addgene, Cambridge, MA). Lentivirus produktion og infektion blev udført som beskrevet [35]. Kort fortalt blev viral pakning udført i HEK 293T-celler efter cotransfektion af pSLIK-GPR158 blev to emballering plasmider pMDLg /pRRE og pRSVREV, og VSV G kuvert plasmid under anvendelse af lipofectamin 2000. virus høstet 72 timer efter transfektion, og virale partikler er koncentreret. LNCaP-celler blev inficeret ved en lav MOI for at sikre 30% infektion frekvens og de stabile celler (Lenti-GPR158) blev genereret med hygromycinselektion ved 400 ug /ml for 4-wks. Til induktion af GPR158 blev de stabile LNCaP-celler behandlet med 100 og 500 ng /ml doxycyclin (Dox) i 72 timer. LNCaP-celler inficeret med virale partikler genereret med kun pSLIK vektor (Lenti-vektor) blev anvendt som en negativ kontrol. Efter 3-dages Dox induktion blev cellerne underkastet enten western blotting eller celletælling eller subcellulær proteinfraktionering assay eller blød agar-kolonidannelse assayet.

Subcellulær Fraktionering

Subcellulær fraktionering blev udført hjælp subcellulære protein fraktionering kit ifølge producentens anvisninger (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Dette kit har vist sig at isolere cytoplasmatiske membran, nuklear opløseligt, kromatin-bundet og cytoskelettet fraktioner af tilstrækkelig renhed til proteinlokalisering og omfordeling undersøgelser [36]. Kort fortalt blev en trinvis adskillelse af cellulære rum fra 3 × 10

6 angivne celler udføres efter påføring af den tilførte cytoplasmatiske membran, nukleare opløselige, kromatin-bundne og cytoskelet proteinekstraktion buffere. Koncentrationen af ​​protein i hver fraktion blev anslået under anvendelse af BCA-protein estimation kit (Thermo Scientific Inc.) og angiven mængde protein blev underkastet western blotting.

kolonidannelse Assay

lenti- GPR158 eller Lenti-vektor LNCaP-cellelinjer blev anvendt til kolonidannelse assayet. Kort fortalt blev cellerne udpladet i en plade med 12 brønde (5000 celler /brønd). Cellerne blev suspenderet i phenolrødt frit RPMI-1640 indeholdende 10% FBS, og 0,48% agar, og lagt oven på et fast lag af det samme medium indeholdende 0,8% agar. Cellerne blev enten induceret i det ovennævnte medium indeholdende 100 ng /mL Dox, eller efterlades ubehandlet, under forsigtig opfyldning af deres medier hver 3 dage. Efter en 2-ugers inkubation blev pladen farvet med 0,005% krystalviolet (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ), affarvet natten over med PBS og kolonier blev talt under mikroskop og fotograferet ved × 20 forstørrelse.

immunhistokemisk (IHC) Analyse i betinget

PTEN

knockout Mouse

den betingede

PTEN

knockout musemodel blev oprettet ved University of Southern California med to af medforfattere til denne undersøgelse [37]. IHC-analyse af GPR158 og AR udtryk blev gennemført i alle tre (ventral, dorsolaterale og anterior) flige afledt af prostata af en 10-måneder gammel betinget homozygot

PTEN

knockout mus (

PTEN

– /-) og en tilsvarende alder-matchede kontrol (

PTEN

+ /+

). Kort fortalt blev prostatavæv fikseret i 4% formaldehyd og eksempleringsblokke blev skåret i 5 um tykke snit, deparaffinerede i xylen, og rehydreret under anvendelse af en aftagende ethanol-gradient efterfulgt af skylning med dobbelt-destilleret H

20. For at hente antigenicitet blev objektglassene inkuberet med 10 mM citratpuffer (pH 6,0), vasket med 0,1 M phosphatpuffer, blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i methanol i 15 minutter og med 5% gedeserum i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev inkuberet med anti-ICD GPR158-antistof (1: 100) eller anti-AR-antistof (1: 200) i 1% gedeserum ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubation med biotinyleret anti-kanin sekundært antistof (Vector Laboratories, Burlingame , CA) i 1 time og peberrodsperoxidase streptavidin (Vector Laboratories) i 30 min, og derefter visualiseret ved DAB kit (Vector Laboratories). Objektglassene blev efterfølgende modfarvet med 5% (vægt /volumen) Harris Hematoxylin. Objektglassene indeholdende paraffinsnit i prostata fra normale og PCA humane individer blev leveret af kernen og bearbejdet ved anvendelse af den ovennævnte fremgangsmåde.

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse middelværdien (SE) betydningen af ​​forskelle i middelværdier mellem ubehandlede og behandlede prøver blev bestemt af t-test efter bestemmelse, at data passer til en normal fordeling.

Resultater

GPR158 Effects på Cell Proliferation

for at undersøge betydningen af ​​GPR158 udtryk for PCa, vi udførte et sæt eksperimenter med humane PCA cellelinjer med forskellige ændringer i AR resulterer i forskellige grader af androgen-lydhørhed, androgen-følsomhed og AR ekspression, som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. Først vurderet vi niveauerne af endogent GPR158 mRNA og protein ved real-time kvantitativ PCR og western blotting, hhv. Det hurtigt voksende, androgen-ufølsom DU145 og PC-3 (fordoblingstid 1,5-2 dage) udtrykte højere niveauer af GPR158 mRNA (fig. 1A) og protein (fig. 1B) sammenlignet med langsommere voksende celler af LNCaP linje og dens afledte C4-2B (fordoblingstid 2-3 dage). Den GPR158 proteinniveau i de mere hurtigtvoksende celler var ca. 2-3 gange højere sammenlignet med langsommere voksende celler.

(A) RT-PCR-analyse af GPR158 mRNA-ekspression i angivne PCA cellelinier (B) Western blot-analyse til påvisning af GPR158-protein under anvendelse af anti-ICD GPR158 antistof i helcellelysater af de angivet PCA cellelinier. Den samme membran blev probet for beta-actin, der tjente som en loading kontrol. Den lodrette linje angiver repositioneret gelbaner fra den samme membran, der svarer til prøve orden i fig. 1A. (C, D, E) Alle fire angivet PCA cellelinier blev transfekteret ved 70% konfluens med enten GPR158 ekspressionsplasmid eller tom pcDNA3.1 (+) vektoren (C og D) eller enten GPR158 siRNA eller kontrol scrambled siRNA (E) som angives med Lipofectamine LTX reagens og inkuberet i vækstmedium i 3 dage i en 6-brønds dyrkningsplader. (C og E) Efter 3 dage blev trypsinerede celler talt under anvendelse trypanblåt i et hæmocytometer kammer. (D) Western blotting til påvisning af GPR158 i helcellelysater isoleret fra celler transficeret med angivne plasmider under anvendelse af anti-ICD GPR158 antistof. (F) Totalt RNA blev isoleret fra DU145 celler, som blev transfekteret med den angivne koncentration af enten GPR158 siRNA eller kontrol scrambled siRNA til analyse af niveauerne af GPR158 mRNA ved QRT-PCR. GAPDH var interne reference kontrol. (C, E, F) De data viser gennemsnit ± SE af 3 uafhængige forsøg, hver udført i to eksemplarer. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05; ns, p . 0,05

For at vurdere den mulige biologiske rolle GPR158 i regulering af celledeling af humane PCA celler, vi udførte forbigående transfektioner med GPR158 pattedyrekspressionsvektor beskrevet tidligere [8]. Cellelinier transficeret med vektor alene blev anvendt som kontrol. Virkningen på celleproliferation blev kvantificeret efter 3-dages transfektion. Forbigående overekspression af GPR158 i celler af LNCaP, C4-2B og DU145 linjer førte til en signifikant højere celleproliferation med 3,88, 2,15 og 2,77 gange, henholdsvis i sammenligning med celler transficeret med tom vektor (fig. 1C ). Forbigående overekspression af GPR158 viste kun en marginal stigning i udbredelsen af ​​PC-3 celler, var dog dette den mest hurtigt prolifererende af de fire cellelinjer uden GPR158 overekspression, øge muligheden at spredning sats måske allerede være maksimal . Overekspressionen af ​​GPR158 på 3 dage efter transfektion blev bekræftet i helcellelysater ved Western blotting; en klar stigning i GPR158 protein niveauer blev observeret i alle de cellelinjer (fig. 1D).

For at vurdere betydningen af ​​endogene GPR158 i PCa celleproliferation, vi udførte det omvendte eksperiment ved nedregulering af GPR158 gennem siRNA tilgang. Vi har tidligere rapporteret karakterisering af en pulje af tre siRNA oligonukleotider, hvilket viser 80-90% knockdown af GPR158 proteinekspression i PC-3-celler ved 100 nM, på en reproducerbar måde [8]. Transficerede vi hver af de fire PCA cellelinier med 100 nM af dette siRNA pool. Efter 3-dages transfektion blev signifikant væksthæmning (ca. 50%) observeret i alle fire cellelinjer, i forhold til deres respektive scrambled siRNA transficeret kontrol-celler (Fig. 1E). Vi bekræftede den dosisafhængige knockdown af GPR158 mRNA-ekspression ved transfektion af siRNA pool, med ca. 90% inhibering ved 100 nM siRNA i DU145-celler (fig. 1F) og ca. 75-90% i de andre cellelinier (data ikke vist).

Sammen indikerer disse resultater, at ekspressionen niveauet af endogen GPR158-protein styrer hastigheden af ​​PCa celleproliferation, uanset androgen-responsivitet, androgen-følsomhed eller AR-ekspression status af den humane PCa cellelinie brugt.

Virkninger af en Androgen på GPR158 Expression

at opdage faktorer regulerer GPR158 udtryk, vi søgte NextBio “Farmako Atlas” ansøgning [38], der finder forbindelser og behandlinger signifikant korreleret til et gen med resultater ordnet af statistisk signifikans. Vores søgning ved hjælp af “GPR158” som forespørgslen identificeret androgen, DHT som den mest betydningsfulde, og den første på listen over korrelerede forbindelser. Resultaterne viste 7 uafhængige undersøgelser udført under anvendelse LNCaP-celler og alle undersøgelserne viste forøget GPR158-mRNA-ekspression med DHT behandling i området fra 1,28 til 3,57 gange (S2 fig.).

eksperimentelt bestemme, om GPR158 er en androgen-responsive gen, vi udført DHT behandling tidsforløb eksperimenter, sammenligner androgen-responsiv og androgen-følsomme PHPECs og LNCaP celler og androgen-responsive, men androgen-

ufølsom

C4-2B celler. Repræsentative resultater er vist i fig. 2. I PHPECs og LNCaP-celler, GPR158 mRNA og protein niveauer steg med 3-4 gange med DHT behandling på 24 timer (fig. 2, A, B, E og F). I modsætning hertil DHT behandling havde ingen virkning på GPR158 mRNA og protein niveauer i C4-2B celler (Fig. 2, C og G). Både mRNA og protein niveauer for prostataspecifikt antigen (PSA), en velundersøgte AR målgen, steget betydeligt i PHPEC, LNCaP og C4-2B celler behandlet med DHT. Svarende til offentliggjorte rapporter, vi også observeret AR protein stabilisering i DHT-stimulerede LNCaP-celler ved 12 timer i PHPEC og LNCaP-celler [39], men ikke i C4-2B celler (fig. 2, E, F og G). Vigtigere, fandt vi, at AR antagonist, bicalutamid inhiberede DHT-medieret stigning i GPR158 mRNA og protein niveauer og vi også observeret en fuldstændig inhibering af PSA-ekspression i PHPEC (fig. 2, D og H). GPR158 mRNA og protein niveauer blev reduceret ved androgen sult ved inkubering af PHPEC i medier indeholdende 10% CSS natten over. Baseret på disse resultater, konkluderer vi, at GPR158 er en androgen-responsive gen.

(AC og EG) Celler af de angivne linjer blev inkuberet i medier indeholdende 10% CSS til androgen sult natten over (0 tidspunkt), efterfulgt af behandling med DHT (10 nM) i de angivne tidsperioder. Totalt RNA (A-C) eller cellelysater (E-G) blev isoleret og udsat for QRT-PCR og western blotting, henholdsvis at estimere AR, PSA, GPR158 og beta-actin-ekspression. (D og H) PHPEC blev dyrket i medier, der indeholdt 10% FCS eller 10% CSS, behandlet med DHT (10nM) alene i 24 timer eller præinkuberet med bicalutamid (10 uM) i 1-hr før DHT behandling i medier indeholdende 10 % CSS. Total RNA eller hele cellelysater blev isoleret og QRT-PCR og western blotting blev udført henholdsvis at detektere GPR158, AR, PSA og beta-actin niveauer (D) mRNA-niveauet af de ovenfor angivne gener blev betragtet 1 i celler dyrket i 10% FCS til beregning af den relative ganges forskel af disse gener i andre eksperimentelle betingelser. (AH) Dataene repræsenterer tre uafhængige forsøg.

GPR158 Virkninger på AR Expression

LNCaP /C4-2B human PCa progression model display karakteristika overgangen fra androgen-afhængighed til androgen ufølsomhed [32,40], og AR spiller en afgørende rolle i denne proces [41]. Fig. 3 viser resultaterne af vores analyse af GPR158 virkninger på AR-ekspression. Forbigående overekspression af GPR158 i LNCaP-celler steg, og inaktivering af endogen GPR158 reduceret, mRNA for AR, såvel som for PSA (fig. 3A). I både LNCaP og C4-2B celler, overekspression af GPR158 signifikant forøget AR og PSA-proteinniveauer, mens knockdown af GPR158 (90% reduktion) signifikant reduceret AR og PSA-proteinniveauer (fig. 3, B og C). Tilsammen indikerer disse resultater, at GPR158 stimulerer AR og PSA-ekspression.

LNCaP (A, B, C) og C4-2B (B og C) blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine LTX reagens med enten GPR158 ekspressionsplasmid eller vektoren (A og B) eller enten GPR158 siRNA eller kontrol scrambled siRNA (A og C). Efter 3 dages transfektion blev de samlede isolerede RNA og protein cellelysater anvendt til QRT-PCR (A) og western blotting (B og C), henholdsvis til ekspression analyse af GPR158, AR, PSA og β-actin-mRNA og protein. Data repræsenterer to uafhængige forsøg udført i to eksemplarer.

dosisafhængige virkninger af GPR158

For yderligere at undersøge den rolle GPR158 i regulering af celledeling og AR genekspression, vi skabte den Lenti-GPR158 LNCaP-cellelinje. Dette er en sublinie af LNCaP-celler, der stabilt transformeret med et lentivirus, der udtrykker GPR158 under kontrol af Dox. Den Dox-inducerbare lentivirus system giver mulighed for tæt regulering af GPR158 ekspression i en dosis-afhængig måde. LNCaP-celler blev valgt til denne model, fordi de udtrykker de laveste endogene GPR158 niveauer. Det blev for nylig vist, at Dox ændrer de metaboliske og proliferation profiler af LNCaP-celler ved højere koncentrationer [42], en effekt, vi bekræftet (data ikke vist). Således i alle eksperimenter med denne cellelinie, vi sammenligner resultaterne opnået med Lenti-GPR158 LNCaP-cellelinje til dem, der opnås ved anvendelse af parallelle kulturer af parentale LNCaP-celler behandlet med de samme doser af Dox.

Fig. 4 viser repræsentative resultater af forsøg med den Lenti-GPR158 LNCaP-cellelinje. Behandling af Lenti-GPR158 LNCaP med Dox i 3 dage inducerede GPR158 ekspression i en dosis-afhængig måde, sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4A). Vi konsekvent observeret en ca. 3 gange og 6 gange forøgelse i GPR158 proteinniveauer efter behandling med Dox ved 100 ng /ml og 500 ng /ml henholdsvis 3 dage (fig. 4A).