PLoS ONE: Hurtig Fænotypisk og Genomisk Ændring i Reaktion på Therapeutic Tryk i prostatakræft slutte sig højt indhold Analyse af Single cirkulerende Tumor Cells

Abstrakt

Rettidig karakterisering af en kræft evolution er forpligtet til at forudsige behandlingseffekt og detektere modstand tidligt. Højt indhold analyse af enkelte Cirkulerende tumorceller (CTCs) muliggør sekventiel karakterisering af genotypiske, morfometriske og protein udtryk ændringer i realtid i løbet af kræftbehandling. Dette koncept blev undersøgt i en patient med kastrationsniveau-resistent prostatacancer forløber gennem både kemoterapi og målrettet terapi. I dette casestudie, vi integrerer på tværs af fire tidspunkter 41 genom-dækkende kopi nummer variation (CNV) profiler plus morfometriske parametre og androgen receptor (AR) protein niveauer. Bemærkelsesværdigt blev lille ændring observeret som respons på standard kemoterapi, ses af det faktum, at en unik klon (A), der udviser stærkt omlejrede CNV profiler og AR + fænotype blev fundet cirkulerende før og efter behandling. Imidlertid blev klinisk respons og efterfølgende progression efter målrettet terapi forbundet med den drastiske udtømning af klon A, efterfulgt af den sekventielle fremkomst af to adskilte CTC subpopulationer, der afveg i både AR genotype og ekspression fænotype. Mens ar- celler med flade eller pseudo-diploid CNV profiler (klon B) blev identificeret på tidspunktet for respons, blev opdaget en ny tumor afstamning af AR + celler (klon C) med CNV ændrede profiler under tilbagefald. Vi viste, at klon C, trods fylogenetisk beslægtet at klone A, besad et unikt sæt af somatiske CNV ændringer, herunder

MYC

amplifikation, en begivenhed knyttet til hormon undslippe. Interessant, viste vi, at begge kloner erhvervet

AR

genamplifikation ved at indsætte forskellige evolutionære veje. Samlet set viser disse data tidsrammen for tumor udvikling i respons på behandlingen og skabe rammer for den multi-skala analyse af væske biopsier at kvantificere og overvåge sygdommens udvikling i de enkelte patienter

Henvisning:. Dago AE, Stepansky A , Carlsson A, Lüttgen M, Kendall J, Baslan T, et al. (2014) Hurtig Fænotypisk og Genomisk Ændring i Reaktion på Therapeutic Tryk i prostatakræft slutte sig højt indhold Analyse af Single Cirkulerende tumorceller. PLoS ONE 9 (8): e101777. doi: 10,1371 /journal.pone.0101777

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 11 juni 2014; Udgivet: 1. august, 2014

Copyright: © 2014 Dago et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Award nummer U54CA143906 fra National Cancer Institute. A. E. Dago er en modtager af en PA-12-149- Research Kosttilskud at fremme mangfoldighed i sundhedsrelateret forskning tildelt af National Cancer Institute (NCI). A. Carlsson er finansieret af det svenske Forskningsråd, Dnr 2012-235. JH, JK, tuberkulose og MW blev støttet af en særlig bevilling fra Dr. Marilyn Simons til kræftforskning på CSHL, en Breast Cancer Research Foundation tilskud og støtte forskning fra Skyline Genomics. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Dr. Asya Stepansky af Skyline Genomics haft en væsentlig rolle i udviklingen af ​​protokollen til isolering af DNA fra HD-CTC celler og udførte Illumina bibliotekets præparater. Skyline Genomics økonomisk støttet Illumina sekventering på Cold Spring Harbor Genome facilitet som en demonstration af deres evner som en fremtidig tjenesteudbyder. Virksomheden havde ikke en rolle i udformningen af ​​forsøgene eller fortolkning af data

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har konflikter til at videregive. Den HD-CTC assay teknologi beskrevet her er blevet licenseret til Epic Sciences. ML, AK, KB og PK har ejerandele i Epic Sciences. AS er ansat i Skyline Genomics, og haft en betydelig rolle i udviklingen af ​​protokollen til isolering af DNA fra HD-CTC celler og udførte Illumina bibliotekets præparater. AS havde ikke nogen rolle i udformningen af ​​forsøgene eller fortolkning af dataene. JH er medstifter og aktionær i skyline genomforskning. AED, AC, JK, TB, MW og MEG og har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

androgen-androgen receptor (AR) signalvejen er afgørende for udviklingen og progressionen af prostatakræft og er et vigtigt target for mange terapeutiske midler [1]. I metastatisk prostatacancer (PCA), androgen deprivation terapi (ADT), udgør den gyldne standard behandling for at fremkalde tumorregression ved at undertrykke AR aktivering. Trods første reaktion på ADT, patienterne ofte udvikle resistens og fremskridt til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), en uhelbredelig sygdom med dårlig prognose. Disse patienter behandles ofte med bjærgning hormon-rettet terapier, herunder midler, såsom ikke-steroide anti-androgener og androgen-synteseinhibitorer [1]. Ved forvaltningen af ​​disse behandlinger, forudsige terapeutisk respons og identificere tidlige indikatorer for terapi modstand er store udfordringer. Niveauerne af prostataspecifikt antigen (PSA), en androgen reguleret protein målt i serum, anvendes til at overvåge terapeutisk respons i CRPC patienter, men dens prognosemuligheder for denne patientgruppe er begrænset [2]. Derudover mens mange studier har identificeret molekylære begivenheder, der kan bidrage til terapeutisk modstand mod androgen-målrettede midler, er det vanskeligt at anvende disse resultater på grund af det begrænsede udbud af sekventielt erhvervet væv og den forventede heterogenitet på tværs af flere metastatiske aflejringer stede hos en enkelt patient [3], [4]. Som sådan, metoder, der ville give mulighed for ikke-invasiv sekventiel overvågning gennem det kliniske behandlingsforløb vil være af enorm værdi for klinikere.

Cirkulerende tumorceller (CTCs) har potentialet til at give en ikke-invasive midler vurdering progressive cancere i realtid under behandlingen, og endvidere at hjælpe direkte terapi ved at overvåge fænotypiske fysiologiske og genetiske forandringer, der sker som reaktion på terapi. I de fleste CRPC patienter, har den primære tumor er fjernet, og der forventes CTCs at bestå af celler kaste fra metastaser, hvilket giver en “fluid biopsi«. I øjeblikket er den eneste metode, der er godkendt til CTC tælling (CellSearch, Veridex) baseret på en immun berigelse tilgang, pre-selekterer for celler, som udtrykker epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM), en epitelcelle celleoverflademarkør [5]. Selv numerisk kvantificering af CTCs hjælp CellSearch har givet nogle prognostisk information i visse kræftformer [6] – [8], denne metode har begrænsninger såsom lav følsomhed (vil celler med lav eller fraværende EpCAM udtryk ikke fanget) og regelmæssig tilstedeværelse /forurening af genomisk normale leukocytter i prøven forberedelse, der hæmmer yderligere molekylær karakterisering og data fortolkning. For nylig har genomiske ændringer baseret på vifte CGH og begrænset sekventering blevet rapporteret om CTCs isoleret med det CellSearch systemet [9]. Detaljeret analyse i parrede tumorer og metastase (n = 2) og CTCs (n = 8) foreslog, at de fleste mutationer detekteret i CTCs var til stede på et lavt niveau i den primære tumor [9]. Men fordi en enkelt tidspunkterne under det kliniske forløb af sygdommen blev undersøgt dette studie behandler ikke hvordan en tumor kan reagere og udvikle sig til terapeutisk pres.

Her demonstrerer vi kraften af ​​to nyudviklede teknologier for at give en mere omfattende portræt af de molekylære ændringer, der forekommer, på enkelt celle niveau, i en CRPC patient under behandling tryk i både ADT og kemoterapi indstillinger. High Definition-CTC (HD-CTC) metode blev anvendt til den langsgående identifikation og tælling af CTCs [10] og at vurdere for ekspression af AR [11]. Analysen beskæftiger en fordomsfri protokol til at undersøge og skelne CTCs blandt de omkringliggende leukocytter baseret på deres cytokeratin positive (CK +) fænotype ved hjælp af en høj opløsning immunfluorescens billeddannelse. Derudover HD-CTC-teknologi bevarer cellens morfologi på en sådan måde, så den morfometriske og indirekte kvantificering af AR og CK protein ekspressionsniveauer for alle de CTCs identificeret i blodprøven. For yderligere at karakterisere hver CTC blev en protokol udviklet til ekstraktion individuelle celler under betingelser egnede til efterfølgende genomisk analyse ved en modifikation af den indre kerne sekventering beskrevet af Navin,

et al.

[12] og Baslan,

et al.

[13]. De kombinerede metoder for at kunne spore over tid de molekylære forandringer i CTC befolkning ved at korrelere morfometriske og protein udtryk data med genom brede CNV ændringer for hver af 41 individuelle CTCs isolerede på fire klinisk signifikante tidspunkter. Vi var i stand til at associere fremkomsten af ​​distinkte CTC subpopulationer udstyret med specifikke molekylære ændringer med det kliniske forløb af sygdommen, især i perioden med målrettede ADT, som klinisk var repræsenteret af en kort periode reaktion efterfulgt af modstand og klinisk flugt.

Materiale og metoder

Patient Klinisk Historie og blodprøvetagning indsamlet under behandling

undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle review board (IRB) af University of Southern California Comprehensive Cancer center. Patienten billede skriftligt informeret samtykke.

patienten præsenteret med PCa metastatisk til en lændehvirvler på diagnosetidspunktet for hvilket den primære biopsi repræsenterer den første prøve i denne undersøgelse. Indledende behandling bestod af androgen deprivation terapi (leuprolidacetat). Efter 5 måneder var der klinisk progression til CRPC og patienten blev indrulleret i et klinisk forsøg med docetaxel i kombination med bevacizumab og everolimus (clinicaltrials.gov id: NCT00574769). Før kemoterapi blev indledt, blev en baseline blodprøve taget (Tegn 1) ifølge prøveudtagningsprotokol den. Klinisk progression blev bemærket efter 4 måneders protokol-specificeret kemoterapi. I løbet af de næste 3 måneder, yderligere doser af docetaxel samt ekstern-beam strålebehandling og samarium (

153Sm) lexidronam (en knogle-targeting radioaktivt lægemiddel) var ansat med begrænset palliativ fordel. Efter 12 måneder efter diagnose, behandling med abirateronacetat, en højt selektiv androgensyntese inhibitor, blev påbegyndt. Blod blev trukket før start abiraterone (Tegn 2), ved 3 ugers kontinuerlig behandling falder sammen med en klinisk respons repræsenteret ved nedsat smerte og PSA-niveau (Tegn 3), og ved 9 uger faldt sammen med klinisk progression repræsenteret ved at øge smerte og PSA niveauer (Tegn 4). Efter abiraterone blev behandlingen ændret til cabazitaxel uden klinisk respons efterfulgt af en hurtig klinisk forværring. Patienten døde af almindeligt metastatisk prostatacancer 4 måneder efter Tegn 4 (17 måneder efter diagnosen).

blodprøve Indsamling og behandling for CTC Detection

Patient perifere blodprøver blev indsamlet i henhold til IRB godkendt protokol. Prøverne blev sendt til vores laboratorium og behandles inden for 24 timer efter tidspunktet for udnyttelsen. Prøvefremstilling blev tidligere beskrevet i [10]. Kort fortalt består det af en lyse af røde blodlegemer efterfulgt af udpladning af de kerneholdige celler som et monolag på skræddersyet celle-adhæsion objektglas efterfulgt af opbevaring i en biorepository. Hver prøve produceret mindst 14 uafhængige dias for CTC identifikation og karakterisering.

immunfluorescensfarvning og CTC Optælling

Til dette studie, brugte vi en protokol baseret på den offentliggjorte HD-CTC-analysen kombineret med evaluering af androgen receptor (AR) status inden for cytokeratin (CK) positiv CTC population [11]. Kort fortalt blev cellerne mærket anvendelse af monoklonalt muse cytokeratin 19 (1:100, Dako) og panCK (1:100; Sigma) primære antistoffer for at identificere cytokeratin (CK) positive celler. AR positive HD-CTCs blev identificeret under anvendelse af et kanin-anti-AR monoklonalt antistof (1:250, Cell Signaling Technology). Både CK og AR-antigener blev visualiseret under anvendelse AlexaFluor sekundære antistoffer; CK primære antistoffer blev anerkendt med Alexa Fluor 555 IgG1 sekundært antistof (1:500, Invitrogen) og kanin AR antistof blev anerkendt med Alexa Fluor 488 IgG (H + L) sekundært antistof (1:1000, Invitrogen). Alexa Fluor 647-konjugeret anti-CD45 (1:125; ABD Serotec) primært antistof blev anvendt til at identificere leukocytter som en udelukkelse markør. For at bekræfte, at cellerne er nukleeret og for at muliggøre analyse af nukleare morfologi alle celler blev farvet med en 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).

Objektglassene blev afbildet og formodede CTCs blev registreret under anvendelse af et edb high-throughput fluorescens mikroskop ved 10 ganges forstørrelse. CTCs blev identificeret ved en hæmatologisk tekniker ved hjælp af de tidligere offentliggjorte kriterier for at have en DAPI + kerne plus cytokeratin positivitet og CD45 negativitet [10]. Androgen receptor proteinekspression og lokalisering blev evalueret ved anvendelse af to kriterier (1) tilstedeværelse (AR

+) eller fravær (AR

-) af AR-farvning, og (2) AR subcellulære lokalisering (nuklear AR versus cytoplasmatisk farvning eller begge ). Tærsklen for AR positivitet blev defineret som et signal mere end 6 standardafvigelser over middelværdien signal intensitet (SDOM) observeret i nærområdet leukocytter (baggrund). Subcellulære lokalisering blev målt ved hjælp af den relative pixeltæthed på AR farvning i kernen og cytoplasmaet.

HD-CTC analysens reproducerbarhed

HD-CTC-analysen blev teknisk valideret med cellelinje spiking eksperimenter for at nå en R

2 = 0,9997 om linearitet test som tidligere rapporteret. Disse forsøg blev udført under anvendelse af SK-BR-3-cellelinier og fra 0 til 3 × 10

2 celler pr ml normal donor kontrol blod. Variationskoefficienten er 16%, og inter-processor korrelation er R

2 = 0,979. Prøveforberedelse proces levet op til standardprocedurer for patientprøver gennem en bar kodet system til alle forbrugsstoffer og instrumentering. Alle off-the-shelf instrumentering blev kalibreret i overensstemmelse med de tekniske validering protokoller, der er etableret under idriftsættelse [14].

Udvinding af enkeltceller

Som standard procedure, der tager sigte på at minimere DNA fragmentering celler blev plukket inden for 5 dage efter den indledende procedure farvning. Den eksperimentelle protokol for HD-CTC væskefase capture var opdelt i tre diskrete sekventielle trin: (1). CTC flytning, (2) celle udvinding og (3) isolation og manipulation af enkelte CTCs for downstream molekylære analyser

HD-CTCs blev flyttet (trin 1) ved hjælp af en transformation matrix fra den indledende datafangst til HD-CTC identifikation. Efter kalibrering og udflytning blev hver kandidat celle igen afbildet på 40 × opløsning for detaljerede morfometrisk analyse. For cellen ekstraktion (trin 2) en Eppendorf Transfer Man NK2 mikromanipulator blev anvendt til at indfange cellen af ​​interesse inde i en 25 ° takkede mikropipette (Piezo borspids ES, Eppendorf) ved påføring af væske sugning. Når cellen af ​​interesse blev fanget inde i mikropipetten (trin 3) blev cellen skyllet med PBS og aflejres inde i en 0,2 ml PCR-rør indeholdende 2 pi lysisbuffer (200 mM KOH, 50 mM DTT). Prøven blev derefter og straks frosset og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning. Alle instrumenter og hjælpematerialer blev dekontamineres ved hjælp af en DNAase løsning og udsættelse for UV-lys i 30 min før forsøget.

Single Cell Next Generation Sequencing og Bioinformatik Analyse

celle, der indeholder hætteglas blev overført i tøris til sekventering laboratorium. Kort fortalt blev den lyserede celleblanding optøet og underkastet WGA og sekventering bibliotek konstruktion som tidligere rapporteret [13]. WGA blev udført manuelt i en plade med 96 brønde format vha WGA4 Genomeplex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (Sigma-Aldrich), efterfulgt af oprensning under anvendelse af et QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen). Koncentration af elueret DNA blev målt ved anvendelse af et NanoDrop 8000 (Thermo Scientific). For hver brønd blev amplifikation betragtet som en succes, hvis den resulterende DNA-koncentration var ≥70 ng /pl (elueringsvolumen på 50 pi) efterfulgt af yderligere Quality Control (QC) for at bekræfte passende prøve størrelsesfordeling under anvendelse af Agilent 2100 Bioanalyzer (High Følsomhed DNA Assay og Kit, Agilent Technologies).

Desuden blev detaljerede metoder, der anvendes til at analysere sekventering data offentliggjort for nylig af vores gruppe [13]. Kort fortalt, de edb metoder involverer tre trin: først deconvoluting sekvensen læser baseret på stregkoder; sekunder, kortlægning af læser til det humane genom (hg19, Genome reference Consortium GRCh37, UCSC Genome Browser database) [15], og fjerne PCR dubletter; og tredje, normalisere for guanin-cytosin indhold (GC) og estimering kopi nummer ved hjælp CBS segmentering algoritme. Kopitallet profiler i denne rapport er baseret på 20.000 variabel længde genom siloer gennemsnit en længde på -150 kilo-basepar hver, og blev beregnet som forholdet sammenlignet med normale (hg 19). De indberettede data her havde en median optælling af 1,78 millioner unikt kortlægning læser, med et interval fra 244.190 (minimum cutoff 200.000) til 5.330.000.

Cluster Analysis

Den hierarkiske klyngedannelse blev udført i R [16] ved hjælp af heatmap.2 funktion i gplots pakken. Wards metode med euklidiske afstand metriske blev anvendt til klyngedannelse. Den Heatmap er farvet i henhold til de cutoffs beskrevet ovenfor, og klyngedannelse blev udført ved hjælp af median centreret data.

Frekvens Analyse Definer Genomisk Ændringer

Brug median centreret CNV profiler, cutoff nøgletal versus medianen af 0,8 og 1,25 blev anvendt til at definere deletioner og amplificeringer hhv. Disse cutoffs blev brugt både til at farve Heatmap og gøre frekvensen analyse.

Statistik og Cell Morfologi Analyse

Cellen form (

celle rundhed

) blev analyseret ved at spore cellecytoplasmaet kontur i det sammensatte billede af hvert CTC. Det spores celle billedet blev importeret til R, og en ellipse var monteret til formen ved hjælp af en mindste kvadraters montering algoritme beskrevet af Halir og Flusser [17]. Algoritmen udlæser cellens hovedakse, som er den største radius af den monterede ellipse (se underbyggende oplysninger). Cellen rundhed (

c

) er estimeret som den del af den

de facto

celle område (

A

) og arealet af en cirkel med radius (

r

) sat til cellens hovedakse.

p-værdi, der anvendes i sammenligningen af ​​rundhed mellem CTCs i Draw 3 og 4 blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon sum-rank test.

Resultater og diskussion

behandlingsrespons Overvåget af Longitudinal CTC Molecular analyse

for at vurdere patientens respons på behandlingen højt indhold enkelt celle analyse, herunder: (1) AR protein udtryk fænotype , (2) AR subcellulære lokalisering og (3) CNV genomisk profilering blev udført i CTCs identificeret i blodprøver på tværs af fire forskellige intervaller, der repræsenterer beslutningspunkter i standard pleje af CRPC herunder: (Tegn en) umiddelbart før påbegyndelse af docetaxel kemoterapi, (Draw 2) umiddelbart før abirateronacetat (en yderst selektiv androgen syntese inhibitor), (Tegn 3) efter tre uger, og (Draw 4) efter ni ugers kontinuerlig abiraterone behandling. De specifikke data for alle profilerede celler er præsenteret i den understøttende information. Desuden blev en lignende sekventering baseret metode anvendes til opnåelse af CNV profil en metastatisk sted fra patienten ved anvendelse af en knogle biopsi taget på tidspunktet for diagnose (5 måneder før tegne 1), før de modtager nogen cancer-specifik terapi. Som vist i figur 1A, og i løbet af perioden 7. måned mellem henleder 1 og 2, patienten udviste første reaktion på docetaxel kemoterapi efterfulgt af resistens. Samtidig viste patientens fluid biopsi en konstant andel af AR

+ og AR

-. Subpopulationer mens det samlede antal CTCs faldt (figur 1A, 1D, fig S1 og tabel S1)

( A) de samlede HD-CTCs tæller, herunder antallet af fænotypisk tydelig AR

+ og AR

– celler, blev bestemt for hver blod Draw indsamlet under terapeutisk intervention. CTCs blev defineret som AR positiv, hvis AR signalintensitet var højere end seks standardafvigelser over middelværdien (SDOM) af de omgivende leukocytter (baggrund). Baren-graf viser ændringen i fordelingen af ​​AR

+ og AR

– CTC subpopulationer langs løbet af behandlingen, er angivet i rød og blå henholdsvis og tallene præsenteres over hver bar. (B) PSA-koncentration, målt ved hver behandling tidspunkterne. (C) Boxplot celle rundhed for hver enkelt CTC identificeret på tværs af de forskellige behandlingsmetoder tidspunkter. (D) Repræsentative 40 × immunofluorescens billeder af AR

+ og AR

– HD-CTCs fra subpopulationer identificeret i hver behandling tidspunkterne. Immunofluorescens kanaler er farvet som følger: kerne: blå; cytokeratin: rød; AR: hvid; og CD45: grøn. AR fænotype er angivet i nederste venstre hjørne af hvert billede. Alle grafer blev konstrueret ved hjælp af ggplot2 og RGL pakker i R.

genomiske CNV profiler af CK

+ celler fra Tegner en og to var af to typer (figur 2 og S2). Tre af disse celler var negative for AR-ekspression (CK

+ AR

-), mens de fleste (16/19) viste høje niveauer af AR protein (CK

+ AR

+). En AR

– og en AR

+ celle havde næsten normal CNV profiler kan sammenlignes med dem, der opnås fra enkelt CK

-CD45

+ leukocytter (figur 2). Alle andre CK

+ AR

+ -celler udviste et komplekst mønster af genomiske omlejringer, der var magen til den genomiske profil opnået bagud fra patientens knogle metastaser (hormon naive vævsprøve) opnået ved diagnose (figur 2 og figur 3A) . CK + AR + celler og knoglemetastaser prøven delt flere gevinster og tab på kromosom arme plus en karakteristisk samlingspunkt forstærkning på 3p13 centreret på fosfatase regulatoriske subunit PPP4R2 og som indeholder mindst to gener impliceret i kræft, FoxP1 [18], [19] og MITF [20] (figur 2). Til det niveau af opløsning, idet hver af de delte begivenheder viste identiske genomiske breakpoints, og i den hierarkiske clustering analyse AR

+ -celler fra trækker 1 og 2 samlet i en klynge med knoglemetastaser (Cluster A i figur 3A). Af dette bevismateriale, vi udlede, at disse celler er

bona fide

CTCs afledt fra patientens metastatisk afstamning. Trods den klare afstamning forholdet, AR

+ cirkulerende celler afveg fra metastaser ved AR locus, der viser multikopi amplifikation af forskellige segmenter på Xq12 indeholdende AR-genet selv. AR-amplifikation er hyppige i CRPC, og er blevet forbundet med progression fra kastration-sensitive prostatacancer til CRPC [21]. Det er bemærkelsesværdigt, at hver af AR amplifikationer (figur 3C) er unikke, hidrørende fra flere forskellige breakpoints på hver side af AR-genet, hvilket viser, at AR-amplifikation opstod multiple uafhængige gange (konvergent evolution) sandsynligvis som følge af den selektive pres pålagt af androgen deprivation terapi

Kopier nummer variation profiler fra patientens knoglemetastaser.; et styre enkelt WBC; og enlige CTCs fra hver af de fire behandlingsgrupper tidspunkter er vist. Den tilsvarende fluorescerende billede af cellen anvendes til at generere CNV profil er vist til højre. Relevante genomiske ændringer og deres kromosom lokaliseringer forekommer i hvert enkelt uafgjort er angivet med lyseblå søjler.

(A) Tre forskellige klonale slægter, repræsenteret som Cluster A, B og C, blev identificeret på grundlag af sammenligning af 41 enkelt celle CNV profiler i et uovervåget hierarkisk klyngedannelse. Blodet lodtrækning, hvorfra hver celle blev isoleret angives som Draw 1: gul; Tegn 2: Orange; Tegn 3: lilla; og Draw 4: sort. For reference, blev knoglemetastaser FFPE væv inkluderet i træet, farvet i grønt. Nedenfor træet, en Heatmap angiver amplifikationer (rød) og deletioner (blå) på tværs af hele genomet af hver individuel celle. (B) Hyppigheden af ​​genomiske amplifikationer og deletioner i de tre klynger identificeret. Områder entydigt amplificeret (rød) eller slettet (blå) i klynge A og C er fremhævet. (C) En detalje plot af AR forstærkning begivenhed farvet pr lodtrækning for hver enkelt klynge er vist.

På Draw 3, efter tre ugers abirateronacetat behandling, patienten viste en klar klinisk respons som defineret ved fald i PSA og smerte (figur 1B). Denne respons faldt sammen med en pludselig ændring i CTC fænotyper og genotyper. Selvom det absolutte antal CTCs i Draw 3 var sammenlignelig med Draw 2, var der en næsten fuldstændig udtømning af AR

+ CTC population (figur 1A). CK

+ -celler identificeret i Draw 3 udtrykte lille eller ingen AR protein og afveg også morfologisk, synes at være væsentligt mere langstrakt end AR

+ -celler fra henleder 1 og 2 (figur S1 og tabel S1). Denne morfologisk ændring afspejles i et fald i den mediane celle rundhed (fig S3) fra 0,87 (SD = 0,14) i Draw 1 og 2 til 0,62 (SD = 0,15) i Draw 3, s 10

-11 Wilcoxon rang -sum test (Figur 1C).

den tilsyneladende effekt af behandlingen var også tydeligt i den genomiske analyser af Tegn 3, hvor de ændrede fænotypiske stater korreleret med distinkte genomiske profiler. Størstedelen (10/12) af fænotypisk AR

– celler fra Draw 3 blev ikke forstærket til AR og udstillet tilsyneladende normal eller næsten normale (pseudodiploid) profiler (Figur S2) placerer dem i Cluster B i figur 3A. En af de to AR

– celler fra denne tidspunkterne havde CNV signatur typisk for Cluster A herunder amplifikation af AR, mens den anden er forbundet med en tredje klynge (Cluster C i figur 3A), domineret af celler fra den efterfølgende tidspunkterne ( Tegn 4). Missense mutationer påvirker AR proteinstabilitet og /eller sense-mutationer i AR genet kunne forklare den AR fænotype-genotype forskel på de sidste to celler. Vi tolker, at den første reaktion på abirateronacetat væsentligt forarmet androgen-afhængige AR

+ befolkning, og at en anden AR

– befolkning domineret af pseudodiploid celler var til stede i kredsløbet. Baseret på den totale celletal, opholder sig konstant mellem trækker 2 og 3, vi udlede, at Draw 3 befolkning er en konsekvens af kræft, men fra en kilde uden for de vigtigste tumor afstamning (figur 3A).

Tegn 4 blev opsamlet ved punktet for klinisk progression, når PSA niveauer steg efter 9 uger på abirateron (figur 1B). På dette tidspunkt havde CTC tælle faldet til 47% af den tidligere tidspunkterne, men havde endnu engang undergået en væsentlig fænotypisk skift, da hovedparten af ​​CTCs var igen AR

+ med en celle rundhed værdi på 0,81 typisk for celler fra de to første drager (figur 1C og figur S1). Dette fund, hvilket antyder en sammenhæng mellem terapireaktionen og en CTC fænotype frem for med total CTC Stillingen er konsistent med en nyligt offentliggjort undersøgelse, hvor ekspressionen af ​​to markører for AR signalvejen på CTCs blev overvåget som reaktion på androgen-rettet terapi [ ,,,0],22].

Ændringer i respons på behandling var igen tydelig på det genomiske niveau, som (6/10) celler dannet størstedelen af ​​en ny, tilsyneladende klonal, subpopulation (Cluster C i figur 3A og S2). CNV signaturer i Cluster C er klart i den oprindelige slægt, går tilbage til knoglemetastaser samplet før nogen systemisk terapi, men er nu præget af funktionelt relevante begivenheder såsom en smal amplikon indeholder MYC, og forsvinden FOXP1 /MITF amplikon sammen med andre forskelle bemærket i figur 2, 3A og 3B. MYC amplifikation er en af ​​de mest almindelige ændringer observeret i metastatiske tumorer, og er blevet foreslået at være en bypass mekanisme til AR af modstand [23]. Interessant en nærmere undersøgelse af den genomiske AR forstærkning (skitseret i figur 3C) viser, at i modsætning til de heterogene forstærkning grænser observeret i tidligere celler (klynge A), cellerne i klynge C udviser en enkelt profil form med næsten ensartede breakpoints og betydeligt højere niveauer af AR-amplifikation. Tilsammen de genomiske elementer tyder på, at Cluster C-celler repræsenterer en hidtil ukendt slægt, tilsyneladende resistente over abirateronacetat, og genereret måske fra en enkelt resistent celle.

Desuden morfometrisk analyse af AR subcellulære lokalisering viste, at AR var generelt lokaliseret i kernen af ​​celler fra henleder 1 og 2, men blev identificeret som signifikant mindre lokaliseret til kernen i CTCs isoleret i Draw 4 indsamlet på progression (p = 0,00017 Wilcoxon rank-sum test) (figur 4). Denne konstatering er særlig interessant i lyset af nylige undersøgelser indikerer, at ligand uafhængig AR splejsningsvarianter kan mediere abiraterone resistens hos en human CRPC xenograftmodel [24], og at disse trunkerede og konstitutivt aktive former af AR er fundet at være lokaliseret i kernen samt cytoplasmaet i prostata cancercellelinier [25].

(A) Sammenligning af AR subcellulære lokalisering i CTCs identificeret i blodet før og efter ni ugers abirateron behandling. Korrelation mellem AR og DAPI signaler i cellen indikerer AR bliver colocalized med DAPI,

dvs..

Lokaliseret i cellekernen. Høj korrelation blev generelt set før abirateron behandling, men blev observeret et skift til mindre nukleare plet efter ni ugers behandling (p = 0,00017, Wilcoxon sum-rank test). (B) og (D) Højde maps konstrueret ud fra pixel intensiteter af CK (rød), AR (grøn) og DAPI (blå) i repræsentative CTCs at visualisere den subcellulære lokalisering af AR. Cellen i (B) blev isoleret før abirateron initiering og displays AR farvning begrænset til kernen, mens der observeres cytoplasmatisk AR farvning i CTC identificeret på tidspunktet for terapeutisk tilbagefald (D). (C) og Plots (E) af AR versus DAPI signalintensiteter for hver pixel inde i cellen i 40 × billeder af CTCs i (B) og (D), henholdsvis. Hvert plot punkt er farvet af den tilsvarende CK signal intensitet. Kernelokalisering blev observeret positiv korrelation mellem de to intensiteter (C), og nuklear udelukkelse som negativ korrelation (E). phenotype-genotype.

doi:10.1371/journal.pone.0101777.s004

(DOCX)

Acknowledgments

We