Abstrakt
I human cancer, udtryk for
Lad-7
familie er reduceret betydeligt, og dette er forbundet med kortere overlevelsestid hos patienter. Men de mekanismer, der fører til
Lad-7
nedregulering i kræft er stadig i vid udstrækning uklar. Da en ændring i kopi-nummer er en af årsagerne til gen-deregulering i kræft, vi undersøgte kopital ændringer af
Lad-7
familie i 2969 kræft prøver fra en høj opløsning SNP-array datasæt. Vi fandt, at der var en reduktion i antal kopier af
Lad-7
gener i en cancer-typen specifik måde. Vigtigere, fokal sletning af fire
Lad-7
familiemedlemmer blev fundet i tre kræfttyper: medulloblastom (
lad-7a-2
og
Lad-7e
), bryst cancer (
lad-7a-2
), og ovariecancer (
lad-7a-3-service /
lad-7b
). For eksempel er den genomiske locus huser
lad-7a-3-service /
Lad-7b
blev slettet i 44% af prøverne fra æggestokkene kræftpatienter. Vi fandt også en positiv sammenhæng mellem kopiantallet af
Lad-7b
og modne
Lad-7b
udtryk i kræft i æggestokkene. Endelig viste vi, at restaurering af
Lad-7b
udtryk reduceres dramatisk vækst i æggestokkene tumor
in vitro
in vivo
. Vores resultater viser, at kopi nummer sletning er en vigtig mekanisme, der fører til nedregulering af ekspressionen af specifikke
Lad-7
familiemedlemmer i medulloblastom, bryst og ovariecancer. Restaurering af
Lad-7
udtryk i tumorceller kunne tilvejebringe en ny terapeutisk strategi til behandling af cancer
Henvisning:. Wang Y, Hu X, Greshock J, Shen L, Yang X, Shao Z, et al. (2012) Genomisk DNA Copy-nummer Ændringer af
Lad-7
Familie i Human kræftformer. PLoS ONE 7 (9): e44399. doi: 10,1371 /journal.pone.0044399
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
Modtaget: Februar 27, 2012; Accepteret: August 6, 2012; Udgivet: 6. september, 2012 |
Copyright: © Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, helt eller delvist, af National Institutes of Health Grant R01-CA142776 (LZ), P50-CA83638-7951 Projekt 3 (LZ), Department of Defense Grant W81XWH-10-1-0082 (LZ), og den æggestokkene Cancer Research Fund (LZ). ZS blev støttet af Kina Scholarship Rådet. JT blev støttet af National Institutes of Health Grant 5K12HD000849. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse
Konkurrerende interesser:. LZ er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.
Introduktion
Karakteriseringen af heterochronic mutationer i
Caenorhabditis elegans
afsløret en evolutionært bevaret genetisk vej, der orkestrerer både timingen af celledelinger og cellulære skæbner, som er relevant for udviklingsstadiet af organismen [1] – [5]. I denne vej, den microRNA (miRNA)
lad-7
styrer progressionen af timing begivenheder, der sikrer, at cellecyklus exit og terminal differentiering forekommer på det korrekte tidspunkt [6], [7].
Lad-7
målgener
lin-28
(en RNA-bindende protein) og
lin-41 Hotel (en formodet ubiquitinligase) blok
bogstav 7
modning og interagere med Argonaute proteiner, hhv. Disse heterochronic gener synes at danne bistabile omskiftere via dobbelte-negative regulatoriske feedback-sløjfer [2] – [5]. Angivelse af
LIN28
LIN41
er stærkt begrænset på udifferentierede stadier, såsom i embryonale stamceller, tidlige embryoner, og visse somatiske stamceller /stamceller. Omvendt deres lovgivningsmæssige miRNA,
Lad-7
, viser en gensidig tidsmæssig udtryk mønster, der er steget voldsomt under differentiering og udvikling, og det er i vid udstrækning udtrykt i voksent væv [2] – [5]. Tretten medlemmer af
Lad-7
familie er blevet identificeret i det humane genom [7], [8], som viser både forskellige og overlappende funktioner [8].
rolle
lad-7
i kræft blev først opdaget af Johnson
et al.
da de fandt, at
lad-7
familie negativt regulerer
lad-60 /RAS
i
C. elegans
ved binding til multiple
lad-7
komplementære sites i dens 3′-utranslaterede region (3’UTR) [9]. Desuden have fastslået, at
Lad-7
udtryk er lavere i lungetumorer end i normalt lungevæv, mens
RAS
protein er markant højere i lungetumorer, de foreslog, at
bogstav 7
er et tumorsuppressorgen [9], hvilket er i overensstemmelse med tidligere kliniske observationer i lungekræft [10]. Reduceret udtryk for
Lad-7
har været forbundet med forkortet postoperativ overlevelse hos patienter med kræft [7], [11], [12], og tvunget udtryk for
lad-7
familiemedlemmer kan undertrykke kræft cellevækst både
in vitro
in vivo
[13] – [16]. Den hæmmende funktion af
Lad-7
familien i kræft er blevet bekræftet af en række grupper og i forskellige typer af tumorer [7], [11], [12]. Det er sandsynligt, at
Lad-7
udfører disse funktioner ved at målrette forskellige gener. For eksempel,
Lad-7
hæmmer mange velkarakteriserede onkogene proteiner, herunder
KRAS
[9], [17], [18],
HRAS
[9] [17], [18],
HMGA2
[18] – [21],
c-myc
[22], og
NF2
[23]. Desuden
Lad-7
målrettet mod flere cellecyklus associerede gener, herunder
Cdc25A
[24],
CDK6
[24], og
CDK4
[25] samt
cyclin A
[25],
D1
[25],
D2
[24], og
D3
[25 ]. Endelig
Lad-7
undertrykker udtryk for omprogrammering faktor
LIN28
der fungerer til at blokere differentiering og vedligeholde kræft stamceller populationer [26].
Da det er blevet konstateret, at menneskelige kræftformer viser en betydeligt reduceret udtryk for
lad-7
familie, og at dette er forbundet med kortere overlevelsestid hos disse patienter [7], [11], [12], karakterisering af de mekanismer fører til
lad-7
nedregulering i kræft har vigtig klinisk betydning. En årsag til genetisk deregulering i cancer er en ændring i den somatiske kopiantallet af et givet gen [27]. Det er også blevet rapporteret, at miRNA kopiantal kan ændres under tumorigenese [28], [29]. Dette førte os til at undersøge, om kopi-numre af
Lad-7
familie blev ændret i kræft.
Resultater
Visse medlemmer af
Lad-7
Familie har deletioner i Copy antal i medulloblastom, Breast Cancer, og Kræft i æggestokkene
for at bestemme kopi antal af de
lad-7
familiemedlemmer, vi analyserede en høj opløsning SNP array (Affymetrix 250 K Sty array) datasæt, Tumorscape, skabt af de overordnede Institut for MIT og Harvard [27]. Fjorten typer humane cancere (i alt 2.969 tumorprøver) blev inkluderet i vores undersøgelse (tabel 1). De segmenterede rådata af ovennævnte SNP arrays blev hentet og analyseret efter en standardprotokol tilvejebragt af Tumorscape databasen [27] og visualiseret ved Integrative Genomics Viewer (IGV) (figur 1) [30]. De genomiske regioner, hvor kopitallet ændringer forekom signifikant hyppigere end baggrunden sats blev identificeret ved hjælp af transportcenter algoritme [31]. Følgende udtryk, som blev defineret af Tumorscape databasen [27], blev brugt til at beskrive vores resultater. Frekvens angiver den del af cancere, som udviser amplifikation /deletion på det genomiske locus, der huser en given
lad-7
genet. Lave q-værdier (øvre tærskel = 0,25) tyder på, at amplifikationer /sletninger på dette locus er betydelige og beriget af selektive pres
De segmenterede rådata fra SNP arrays (brystkræft, n = 293;. Kræft i æggestokkene , n = 110; myeloproliferativ sygdom, n = 215) blev hentet fra Tumorscape databasen, analyseres derefter visualiseret ved Integrative Genomics Viewer. Venstre panel: hele genomet bred visning af kopi nummer profiler fra myeloproliferativ lidelse, brystkræft og kræft i æggestokkene (genomiske placeringer er på venstre, tumor prøver er øverst). Rød repræsenterer amplifikation og blå repræsenterer deletion. Højre panel:. Copy-nummer profiler af kromosom 22 i området af
lad-7a-3-service /
Lad-7b
klynge
som vist i figur 2,
lad-7
familien er til stede som tretten medlemmer placeret på otte loci i det humane genom [7], [11], [12]. Alle otte genomiske loci blev analyseret i vores undersøgelse. De fleste af de familiemedlemmer, såsom
lad-7a-1
,
lad-7f-1,
Lad-7d
, klynge sammen. (
lad-7
gener er navngivet ved at inkludere en skrivelse til at betegne en distinkt modne sekvens, og et tal, der indikerer, at det samme modne sekvens er til stede på særskilt genomisk loci.) Kort fortalt fandt vi, at fire
lad-7
loci huser fem
lad-7
medlemmer viste signifikante deletioner i kopi nummer i en kræft-typen specifik måde (figur 2). Focal sletninger af disse
Lad-7
familiemedlemmer blev fundet i tre kræfttyper: medulloblastom (
lad-7a-2,
frekvens 25%
Lad-7e,
frekvens 9%), brystkræft (
lad-7a-2,
frekvens 47%), og ovariecancer (
lad-7a-3-service /
lad-7b,
frekvens 44%). Dette antyder, at genomiske focal kopital deletioner af
lad-7
kan spille en vigtig rolle under tumorigenese i ovennævnte typer cancer. Desuden to ikke-fokale sletninger (
lad-7a-3-service /
Lad-7b,
frekvens 40%;
Lad-7
g, frekvens 36%) Der blev også fundet i brystkræft, og enkelte ikke-fokale sletninger blev fundet i melanom (
lad-7a-2,
frekvens 43%) og ikke-småcellet lungekræft (
lad-7e,
frekvens 31%). Endelig kun én
Lad-7
familiemedlem,
Lad-7i
, viste sig at blive forstærket (i ikke-småcellet lungekræft). Dette blev imidlertid viste et kromosom arm-niveau, ikke-fokal forstærkning, hvilket indikerer, at det kunne være en “passager” genetisk ændring. Tilsammen vores data viser, at en reduktion i kopi række specifikke
Lad-7
familiemedlem gener var hyppige i medulloblastom, bryst og ovariecancer.
Oversigt over DNA kopital ændringer af
lad-7
familie i 14 typer af humane kræftformer (n = 2969).
Lad-7
familie består af tretten medlemmer placeret på otte loci af det humane genom. Mange af dem, som
lad-7a-1
,
lad-7f-1
og
Lad-7d
, klynge sammen (A). Lav Q-værdier (øvre tærskel = 0,25) tyder på, at amplifikationer /sletninger på dette locus er betydelige og beriget af selektive pres. Mørkegrøn repræsenterer omdrejningspunkt sletning af
Lad-7
familie.
Kopier Antal Ændring af
Lad-7b
er positivt korreleret med Ældre
bogstav 7b
Expression i kræft i æggestokkene
for at bestemme om kopi nummer ændringer af
lad-7b
påvirke moden
lad-7
udtryk i kræft, vi undersøgte en kræft i æggestokkene datasæt fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) [32], fordi denne uafhængige genomiske datasæt indeholder matchede oplysninger om såvel hele genomet kopital (SNP Array) og moden miRNA ekspression (miRNA array) fra en stor samling af humane ovariale tumorprøver. Niveau 3 data (segmenteret SNP array-data og normaliserede miRNA array-data) blev hentet fra TCGA [32]. blev identificeret i alt 537 tumorer med data fra både SNP og miRNA arrays. I overensstemmelse med data fra vores Tumorscape analyse, der var en sletning i kopi nummer på
lad-7a-3-service /
Lad-7b
locus i prøver fra kræftpatienter i æggestokkene (figur 3A ). Da den modne
Lad-7
en sekvens er kodet af tre
Lad-7
en gener, som er placeret på tre forskellige kromosomale loci, kunne vi ikke undersøge sammenhængen mellem antal kopier og udtryk for
lad-7a-3
. Således har vi analyseret sammenhængen mellem sletninger på
lad-7a-3-service /
Lad-7b
locus og udtryk for moden
lad-7b
i dette datasæt. Som vist i figur 3 B og C, ekspressionen af moden
lad-7b
var signifikant og positivt korreleret med
lad-7b
kopital i ovariecancerprøver (p 0,0001, R = 0,46, n = 537). Vi kunne ikke finde en sammenhæng mellem andre
lad-7
familiemedlemmer med
Lad-7b
kopi nummer (figur 3D). Dette viser, at en reduktion i antal kopier af
Lad-7b
fører til en reduktion i ekspressionen af moden
lad-7b
i kræft i æggestokkene.
niveau 3 data (segmenterede SNP array-data og normaliserede miRNA array-data) blev hentet fra TCGA. blev identificeret i alt 537 tumorer med både SNP og miRNA arrays data. A. Venstre panel: hele genomet vid udsigt over kopital profiler i kræft i æggestokkene (genomiske placeringer er på venstre, tumor prøver er øverst). Rød repræsenterer amplifikation og blå repræsenterer deletion. Højre panel: Copy-nummer profiler fra kromosom 22 i området af
lad-7a-3-service /
Lad-7b
klynge. B. Heat kort over moden
Lad-7
familie ekspressionsniveauerne i matchede TCGA prøver. Prøverne er anbragt i samme rækkefølge som de SNP data. C. Korrelationer mellem
Lad-7b
DNA-kopi nummer og modne
Lad-7b
ekspressionsniveauerne i ovariecancer fra TCGA datasættet. D. Korrelationer mellem
Lad-7b
DNA kopital og ekspressionsniveauer af modent miRNA andre
Lad-7
familiemedlemmer i kræft i æggestokkene fra TCGA datasættet.
Restaurering af
lad-7b
Expression Markant Reducerer æggestokkene tumor vækst
in vitro
Focal tab i kopi nummer
lad-7
familie medlemmer i medulloblastom, bryst og ovariecancer antyder stærkt, at
lad-7
kan have en vigtig rolle i tumorigenese. Derfor genoprette sit udtryk kunne undertrykke tumorvækst i disse kræftformer. For at teste denne hypotese
in vitro,
vi transficeret to æggestokkene kræft cellelinjer, A2780 og 2008, med en
Lad-7b
mimic (en dobbelt-strenget RNA oligonukleotid). Dyrket humanovarie overflade epithelial (slange) cellelinje blev anvendt som kontrol, og cellevækst blev overvåget via en MTT assay. 72 timer efter transfektion, fandt vi, at
lad-7b
efterligner signifikant reduceret cellevækst i cancercellerne (Figur 3 A og B). Der var ingen reduktion i cellevækst set i kontrol celler (Figur 4C). Dette antyder, at genoprettelsen af
Lad-7b
udtryk i tumorceller kan have stor terapeutisk potentiale til behandling af kræft i æggestokkene.
Lad-7b
mimik og kontrol oligo (30 nM) blev transficeret ind i A2780 (A), 2008 (B) og slangen (C) celler ved lipofectamin. Den cellevækst blev overvåget af en MTT-analysen.
Restaurering af
Lad-7b
Expression Markant Reducerer æggestokkene tumor Vækst
in vivo
at evaluere
in vivo
terapeutisk potentiale
lad-7b
efterligner, en ortotopisk sent stadium ovariecancer musemodel blev genereret ved intraperitoneal injektion af 10 × 10
6 ovariecancer ( A2780) celler i nøgne hunmus (figur 5A). Efter to uger blev musene tilfældigt inddelt i to grupper, der skal behandles med enten
lad-7
efterligner eller kontrol-oligonukleotidet ved i.p. indsprøjtning. Musene blev behandlet hver tredje dag i i alt fire behandlinger (figur 5A), og de tumor nodes blev indsamlet tre dage efter den sidste behandling (figur 5B). Vi fandt, at vægten af tumor lymfeknuder blev signifikant reduceret i musene behandlet med
lad-7b
mimic sammenlignet med kontroller (Figur 5 B og C). Vi overvåges også endogene
Lad-7b
aktivitet under anvendelse af en konstitutivt udtrykt
Lad-7b
luciferase reporter, der indeholdt sekvenser komplementære til
lad-7
i 3’UTR [33 ], [34]. Vi konsekvent fundet, at behandling med
lad-7b
efterligner faldt betydeligt luciferaseaktivitet
in vivo
sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5 D og E). Endelig fandt vi, at behandling med
Lad-7b
efterligner signifikant øget
Lad-7b
ekspressionsniveauerne i behandlingen sammenlignet med kontrolgruppen (7,03 ± 5,73 gange, p = 0,047) . I mellemtiden mRNA ekspressionsniveauerne af kendte
Lad-7
målgener såsom
CCND1
,
Cdc25A
,
HMGA2
,
IL6
LIN28B
signifikant reduceret med
lad-7b
efterligner behandling. Tilsammen har dette viser, at
in vivo
levering af et
Lad-7b
efterligner kan funktionelt gendanne
Lad-7
udtryk og bemærkelsesværdigt reducere tumorvækst i en præ- klinisk dyremodel af kræft i æggestokkene.
Tidslinje for transplantation af tumorceller ved intraperitoneal injektion, behandling, billedbehandling, og indsamling af tumor prøver i ortotopisk sent æggestokkræft musemodel. B. Tumor knuder indsamlet fra hver mus tre dage efter den sidste behandling. C. Resumé af vægtene af tumor knuder fra hver mus. D. Endogen
Lad-7b
aktivitet i hver mus som overvåges af en
Lad-7b
luciferase sensor. E. Resumé af luciferase intensitet under behandlingen.
Diskussion
Lad-7
familie er en af de første miRNA tumor suppressor familier vist sig at være involveret i human cancer. Angivelse af medlemmer af
Lad-7
familie er blevet rapporteret at være signifikant nedreguleret i flere typer kræft, og det faldt
Lad-7
ekspression er blevet korreleret med fattigere kliniske resultater. er blevet foreslået to molekylære mekanismer, der kan føre til global nedregulering af
Lad-7
udtryk i kræft. For det første kan vigtige proteiner i miRNA biogenese vej, såsom Dicer og drosha, blive bemærkelsesværdigt dereguleret i cancer [35]. Dette kan resultere i en ikke-selektiv, global nedregulering af miRNA, herunder lad-7 familie. Desuden er det blevet vist, at RNA-bindende protein,
LIN28,
som selektivt inhiberer nogle miRNA familier, herunder
lad-7
familie [36] – [41], er aktiveres i en stor procentdel af cancerpatienter [42] – [51]. Dog kan de to ovennævnte mekanismer ikke forklare den konstatering, at i de fleste kræftformer, kun nogle
Lad-7
familiemedlemmer nedreguleres. For eksempel ekspressionen af
lad-7
a,
lad-7
c, og
er fundet lad-7
g til selektivt nedreguleret i brystcancer [ ,,,0],52], hvilket tyder på at der er andre uafhængige mekanismer, som påvirker ekspressionen af hver enkelt
lad-7
familiemedlem.
Nylige fremskridt i high-throughput genom karakterisering teknologier har vist, at cancerpatienter genomer er meget uorganiseret, med omfattende ændringer i kromosom struktur og gen-kopi-numre. Det er også blevet rapporteret, at kopiere antal miRNA almindeligvis ændres i human cancer [28], [29]. For eksempel blev det
mir-16-1 /mir-15a
klynge på kromosom 13q14 slettet i mere end 50% af de kronisk lymfatisk leukæmi patienter [53]. Desuden forstærkning af
C13orf25 /mir-17~92
klynge på kromosom 13q31-32 er blevet rapporteret i lymfom patienter [54], [55]. I den foreliggende undersøgelse, har vi vist, at tre
Lad-7
loci, der huser fire
Lad-7
medlemmer (
lad-7a-2
,
lad-7a-3
,
lad-7b
, og
lad-7e
), har deletioner i kopi nummer i en kræft-typen specifik måde i medulloblastom, brystkræft, og livmoderhalskræft. Vigtigst, bekræftede vi sammenhængen mellem
lad-7
kopi nummer ombygninger og modne
Lad-7
udtryk i kræft i æggestokkene. Disse resultater indikerer, at sletning i kopi nummer er en vigtig mekanisme, der fører til nedregulering af specifikke
Lad-7
familiemedlemmer i mindst disse tre typer af humane kræftformer. Men denne mekanisme er sandsynligvis kræft-typen specifik, da vi ikke fandt signifikante kopi nummer ændringer af
Lad-7
familie i andre typer cancer, såsom colon og prostatakræft.
vigtigere, fokale reduktioner i kopi numre af
lad-7
familie tyder på, at sletning af
lad-7
kan spille en vigtig rolle under tumorigenese, og foreslår, at genoprette udtryk for disse
lad-7
familiemedlemmer kan være en hidtil ukendt strategi til behandling af medulloblastom, brystcancer og ovariecancer. Aktuelle hurtige fremskridt i oligonukleotid /nanopartikel terapi skabe realistisk optimisme for etablering af miRNA som en ny og potent terapeutisk target og /eller kemoterapi modulator i kræft. For at teste denne hypotese, vi leverede en lille RNA efterligne for
Lad-7b
, den hyppigst udgår
Lad-7
familiemedlem i æggestokkene kræftpatienter til ovariecancerceller
i vitro
in vivo
. Vi fandt, at restaurering af
Lad-7b
udtryk dramatisk hæmmet tumorvækst. Efter aftale med vore observationer, restaurering af
Lad-7
udtryk er også blevet vist at reducere tumorvækst i prækliniske modeller af andre typer kræft, såsom lungekræft [13] – [16], hvor
lad-7
familie er globalt faldt [9], [10]. I betragtning af at
Lad-7
samtidig hæmmer flere onkogene veje, der er involveret i de fleste trin i tumorigenese (såsom
RAS, MYC
, og
HMGA2)
, restaurering af
lad-7
udtryk i tumorceller tilvejebringer et nyt terapeutisk strategi til behandling af kræft. Interessant vi fandt, at vores
lad-7b
behandling påvirkede ikke signifikant normal ovarie overflade epitelial cellevækst, hvilket antyder, at behandling for at genoprette
lad-7
ekspression kan være mindre toksiske end traditionelle kemoterapi. Dette resultat kan skyldes det faktum, at normale celler allerede udtrykker højere niveauer af endogen
Lad-7
og derfor levering af yderligere
Lad-7
ikke væsentligt øge sin gendæmpning aktivitet i normale celler. En anden forklaring kunne være, at den nedstrøms cellulære kontekst er anderledes i tumorcellerne vs. de normale celler. For eksempel har nogle direkte mål for
Lad-7,
såsom
LIN28, RAS, MYC
HMGA2,
ikke udtrykkes eller aktiveret i normale celler, men er den “driver” gener der fremmer cellevækst i tumorer
det er blevet påvist af uafhængige laboratorier, at undertrykkelsen af deres target genekspression niveauer ved miRNA er relativt mild [56] -. [59], selv om hver miRNA kan specifikt og samtidig målrette hundredvis af mRNA-transkripter [56], [59]. I overensstemmelse med denne fælles opførsel af miRNA, vi viste, at mRNA ekspressionsniveauerne af flere velkendte
Lad-7
målgener såsom
CCND1
,
Cdc25A
,
HMGA2
,
IL6
og
LIN28B
signifikant reduceret med
lad-7b
efterligner behandling (alle p 0,05). Men undertrykkelsen virkninger på mRNA-niveauer ved
Lad-7b
er typisk beskedne (fra 58,0% ± 0,03% til 78,9% ± 0,08%). Det kunne medføre betydelige terapeutiske fordele for
Lad-7b
substitutionsterapi forhold til siRNA baserede strategier: For det første, bivirkninger af restaurering af
Lad-7b
i patienter med kræft kan være mild og begrænset. For det andet kan flere onkogene gener /pathways, såsom cellecyklusregulering, DNA beskadigelse respons, kræft stamcelledifferentiering og inflammation målrettes samtidigt. I enige i denne hypotese, ja vi fandt, at
Lad-7b
substitutionsterapi væsentligt påvirket på normal epitelial cellevækst ved en terapeutisk dosis (figur 4C). Desuden miRNA herunder
lad-7
negativt regulerer målgenekspression af to store mekanismer, dvs. mRNA-spaltning (transkriptionel niveau) og /eller translationel undertrykkelse (translationel niveau), i en sekvensspecifik måde [7] [8], [11], [12]. Dette kunne være en anden forklaring på, hvorfor vi kun fundet beskedne undertrykkelse af mål-genekspression i mRNA-niveauer, der blev detekteret ved real-time RT-PCR. Endelig blev doseringen til
lad-7b
levering i den foreliggende undersøgelse bestemt ved en dosisafhængig eksperiment. Vi brugte den minimale funktionelle respons dosering (30 nM) for vores real-time RT-PCR-forsøg. Når vi øget dosis af
Lad-7b
levering, fandt vi virkningerne af
Lad-7b
substitutionsterapi på sit mål gener bemærkelsesværdigt forøget.
Det har blevet godt demonstreret, at den modne
lad-7
udtryk er en robust biomarkør til at forudsige det kliniske resultat hos patienter med cancer. For eksempel, en systematisk gennemgang af 43 offentliggjorte undersøgelser viser, at
Lad-7
er miRNA hyppigst og signifikant associeret med kliniske resultater hos patienter med cancer [60]. For at undersøge sammenhængen mellem
Lad-7b /lad-7A3
klynge kopi nummer ændringer (tekst udgår vs ikke-tekst udgår) og klinisk resultat af patienter, i alt 491 sene (fase-III og -IV ) tumorer med godt kommenteret overlevelse oplysninger blev undersøgt af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Men vi fandt ikke signifikant sammenhæng mellem de
Lad-7b /lad-7A3
klynge kopi nummer ændringer og samlet overlevelse i denne prøve sæt (p = 0,343). Dette resultat indikerede, at DNA-kopital ændring er ikke den eneste grund, hvorved det modne
lad-7
ekspression reduceres i cancer. I enige i denne observation, har vi og andre uafhængige grupper rapporteret, at miRNA deregulering i human ovariecancer blev ledet af flere mekanismer [29], [61], [62]. For det første har det vist sig at de fleste primære miRNA er transskriberet fra Pol II promotor og reguleret af transkriptionelle faktorer. Flere eksempler viser miRNA deregulering i kræft i æggestokkene ved transkriptionel deregulering er blevet rapporteret. For det andet, nyere undersøgelser tyder på, at epigenetiske ændringer spiller en kritisk rolle i deregulere miRNA ekspression i humane ovariecancer. Tredje, kan mutation også bidrage til nedregulering af modne miRNA. Endelig kan de centrale proteiner i miRNA biogenese pathway være dysfunktionel eller dereguleret i cancer og kan forøge tumorigenese. Derfor transkriptionelle deregulering, epigenetiske ændringer, mutationer, DNA kopital abnormiteter og mangler i miRNA biogenese maskiner kan hver bidrager, enten alene, men mere sandsynligt sammen, til
Lad-7
familie deregulering i human cancer [29 ], [61], [62]. I den foreliggende undersøgelse, vi rapporterede, at
Lad-7b /lad-7A3
cluster slettes i mere end 40% procent af æggestokkene og brystkræft. Vi mener, det er en af vigtige mekanismer til at mindske
Lad-7
udtryk i disse sygdomme, selv om andre mekanismer såsom transkriptionelle deregulering, epigenetiske ændringer, mutationer, og mangler i den miRNA biogenese maskiner er nødvendige for at være yderligere karakteriseret i æggestokkene og brystkræft.
Materialer og metoder
SNP og miRNA Microarray og analyse af data
de segmenter rå data fra SNP mikroarrays (Affymetrix 250 K Sty array) hentet fra Tumorscape databasen (skabt af de overordnede Institut for MIT og Harvard) [27] og analyseret efter en standardprotokol tilvejebragt af Tumorscape, derefter visualiseret ved hjælp af Integrativ Genomics Viewer (IGV) (figur 1) [30]. Fjorten typer humane cancere (i alt 2.969 tumorprøver) blev inkluderet i vores undersøgelse (tabel 1). Niveau 3 data (segmenteret SNP array-data og normaliserede miRNA array-data) var downloades fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) datasæt [32], og i alt 537 tumorer med både SNP og miRNA array-data blev identificeret. De genomiske regioner, hvor kopital ændringer forekom signifikant hyppigere end baggrunden sats blev identificeret ved hjælp af Genomisk Identifikation af væsentlige mål i Cancer (transportcenter) algoritme [31]. Oplysningerne for tumor typer af prøverne fra Tumorscape databasen var tilgængelige på portalen af Tumorscape (https://www.broadinstitute.org/tumorscape) [27]. Breast og ovarietumorer klinisk information var tilgængelig fra de offentliggjorte profiler (GSE7545 og GSE19399) [27], [63], [64]. Alle TCGA kræft i æggestokkene prøver er af høj kvalitet serøse tumorer i æggestokkene, der blev indsamlet fra nydiagnosticerede patienter med æggestokkene serøs adenocarcinom, der var undergår kirurgisk resektion og havde modtaget nogen forudgående behandling for deres sygdom, herunder kemoterapi eller strålebehandling. Alle sager skulle være af serøs histologi, men blev indsamlet uanset kirurgisk fase eller histologisk klasse. Sager blev iscenesat i henhold til 1988 FIGO iscenesættelse system. De nærmere detaljer kliniske oplysninger af prøverne fra TCGA databasen var tilgængelige på TCGA data portalen (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [32].
cellelinjer og Cell Kultur
ovariecancer cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC) og afdelingen for kræftbehandling og diagnose (DCTD) Tumor /cellelinje Repository. Alle cancercellelinier dyrkedes i RPMI 1640 medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Menneskelige æggestokkene overflade epitel (slange) celler blev generøst tilvejebragt af Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia) [65]. HOSE celler blev dyrket 01:01 i Media 199:. MCDB 105 (Sigma), suppleret med 15% FBS
Lad-7b
Mimic
in vitro
transfektion
lad-7b
efterligner og kontrol oligonukleotider blev indkøbt fra Invitrogen. Celler blev udpladet 24 timer før transfektion. Transfektion af miRNA oligonukleotider (30 nM)
in vitro
blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
MTT assay Salg
MTT-assays blev udført i plader med 96 brønde under anvendelse af en Cell Proliferation Kit (Roche) ifølge producentens instruktioner. Fire til seks brønde blev analyseret for hver prøve. Den resulterende farvede opløsning blev kvantificeret ved hjælp af en ELx800 Absorbans Microplate Reader (BioTek) ved 570 nm med en reference bølgelængde på 630 nm.
Generering af stabile cellelinier
Lad-7 reporter vektor var transficeret ind A2780 celler ved anvendelse af FuGene6 transfektionsreagens (Roche). Mediet blev skiftet 48 timer efter transfektion, og stabile kloner blev selekteret ved neomycin i 14 dage. De stabile kloner, der udtrykker Lad-7 reporter blev yderligere bekræftet ved en luciferaseanalyse.
Generation of ortotopisk kræft i æggestokkene xenograftmodel
Seks til otte uger gamle kvindelige nøgne mus blev opnået fra The Jackson Laboratory . Subkonfluente ovariecancerceller (A2780) blev trypsinbehandlet og suspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS), derpå 10 × 10
6 celler i et totalt volumen på 0,1 ml blev injiceret i mus peritoneale hulrum.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.