PLoS ONE: højt niveau HOOK3 Expression er en uafhængig Predictor af dårlig prognose associeret med genomisk instabilitet i prostatakræft

Abstrakt

Hook mikrotubuli-tethering protein 3 (HOOK3) er en adapter protein til mikrotubuli-afhængige intracellulære vesikel og protein menneskehandel. For at vurdere rollen af ​​HOOK3 i prostatacancer analyseret vi HOOK3 ekspression ved immunhistokemi på en TMA indeholder mere end 12.400 prostatakræft. Resultaterne blev sammenlignet med tumor fænotype og PSA tilbagefald samt afvigelser muligvis definere relevante molekylære undertyper såsom ERG status og sletninger af 3p13, 5q21, 6q15 og PTEN. HOOK3 immunfarvning var negativ i normale luminale celler i prostata epitel, mens 53,3% af 10.572 fortolkelige kræftformer viste HOOK3 udtryk, hvilket blev anset for lavt i 36,4% og høj i 16,9% af tilfældene. Højt niveau HOOK3 udtryk var knyttet til avanceret tumor stadie, høj Gleason score, høj spredning indeks, positiv lymfeknude fase, og PSA recidiv (p 0,0001 hver). Den prognostiske rolle HOOK3 udtryk var uafhængig af etablerede klinisk-patologiske parametre både i præoperative og postoperative indstillinger. Sammenligninger med molekylære funktioner blev udført for at drage konklusioner om den potentielle funktion HOOK3 i prostata. En stærk association med alle undersøgte deletioner er konsistent med en rolle HOOK3 for opretholdelse genomisk integritet ved at bidrage til korrekt centrosom samling. Finde HOOK3 udtryk i 74% af ERG positive, men i kun 38% af ERG negative kræftformer (p 0,0001) foreslår endvidere, funktionelle interaktioner mellem disse gener. Som konklusion, at resultaterne af vores undersøgelse identificerer HOOK3 som en stærk kandidat prognostisk markør med en mulig rolle i opretholdelsen af ​​genomisk integritet i prostatakræft, som kan have potentiale for inklusion i klinisk rutinemæssige analyser

Henvisning:. Melling N, Harutyunyan L, Hube-Magg C, Kluth M, Simon R, Lebok P, et al. (2015) på højt plan HOOK3 Expression er en uafhængig Predictor af dårlig prognose associeret med genomisk instabilitet i prostatakræft. PLoS ONE 10 (7): e0134614. doi: 10,1371 /journal.pone.0134614

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: April 28, 2015; Accepteret: 10. juli 2015; Udgivet: 31 Juli 2015

Copyright: © 2015 Melling et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest udbredte cancer hos mænd i vestlige samfund [1]. Mens de fleste tumorer har en temmelig indolent klinisk forløb, prostatacancer repræsenterer stadig den tredje mest almindelige årsag til cancerrelaterede dødsfald hos mænd. Etablerede prognostiske parametre er Gleason kvalitet, tumorudbredelse på biopsier, præoperativ prostataspecifikt antigen (PSA), og klinisk udvikling. Selvom statistisk stærke, de er ikke tilstrækkelige til optimale individuelle beslutninger behandling. Det er håbet, at en bedre forståelse af sygdommens biologi i sidste ende vil føre til identifikation af klinisk relevante molekylære markører, der muliggør en mere pålidelig forudsigelse af prostatakræft aggressivitet i individuelle patienter.

Familien af ​​menneskelige krog mikrotubulus-tethering proteiner (kroge) omfatter tre homologe, HOOK1, HOOK2, og HOOK3, som er rigeligt til udtryk i humane celler. Kroge fungerer som adapter proteiner involveret i handel med membranvesikler og proteinkomplekser langs mikrotubuli mellem Golgi apparatet, centrosomer [2-5], endosomer [6] og lysosomer [7]. En cancer relevant rolle er blevet foreslået specielt til HOOK3 fra adskillige undersøgelser at finde tilbagevendende ændringer af genet. For eksempel er en undersøgelse rapporteret en HOOK3: RET fusion i et tilfælde af papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, som viste sig at være onkogene i en mus xenograft kræft model [8]. En anden undersøgelse viste, protein-ændring mutationer med ukendt betydning i 2 af 48 små tarm neuroendokrine tumorer [9]. Desuden er HOOK3 gen lokaliseret ved 8p11, et fælles breakpoint i mange humane tumorer, heriblandt prostatacancer [10,11]. Derfor blev inaktivering brud resulterer i reduceret ekspression af HOOK3 fundet i en betydelig fraktion (9,0%) af tumorer [11] i en undersøgelse af 77 prostatakræft.

Disse resultater fik os til at studere mønstre af HOOK3 udtryk i prostatacancer mere detaljeret. Vi tog fordel af vores allerede eksisterende væv microarray (TMA), der indeholder 12.000 prostatakræft prøver forbundet til en database med klinisk opfølgning og omfattende molekylære data. Vores resultater viser, at høje niveauer af HOOK3 proteinekspression er stærkt knyttet til negativ tumor fænotype og tidlig PSA recidiv og kan uafhængigt forudsige dårligt resultat i prostatakræft.

Materialer og Metoder

Patienter

radikal prostatektomi prøver var tilgængelige fra 12,427 patienter, der gennemgår kirurgi mellem 1992 og 2012 ved Institut for urologi og Martini klinikker på University Medical center Hamburg-Eppendorf. Opfølgende data var tilgængelige for alt 12.344 patienter med en median opfølgning på 36 måneder (interval: 1 til 241 måneder, tabel 1). Prostataspecifikt antigen (PSA) blev målt efter kirurgi og PSA recidiv blev defineret som den tid punkt, når postoperativ PSA var mindst 0.2ng /ml og stigende på efterfølgende målinger. Alle prostata prøver blev analyseret i henhold til en standard procedure, herunder en fuldstændig indlejring af hele prostata til histologisk analyse [12]. TMA produktionsproces beskrevet tidligere i detaljer [13]. Kort sagt blev en 0.6mm kerne taget fra et repræsentativt væv blok fra hver patient. Vævene blev fordelt mellem 27 TMA blokke, der hver indeholder 144 til 522 tumorprøver. For interne kontroller, hver TMA blok indeholdt også forskellige kontrol væv, herunder normal prostata væv. Den molekylære database knyttet til denne TMA indeholdt resultater på ERG udtryk i 10.678 [14], ERG bryde ud FISH-analyse i 7099 (udvidet fra [15]), sletning status 5q21 (CHD1) i 7932 (udvidet fra [16]), 6q15 (MAP3K7) i 6069 (udvidet fra [17]), PTEN (10q23) i 6704 (udvidet fra [18]), 3p13 (FOXP1) i 7081 (udvidet fra [19]) kræftformer og Ki67 mærkning indeks (Ki67LI) data i 4.426 kræfttilfælde (udvidet fra [20]).

Etik erklæring

brugen af ​​arkiverede diagnostiske venstre-over væv til fremstilling af væv microarrays og deres analyse til forskningsformål som samt patientdata-analyse er blevet godkendt af lokale love (HmbKHG, §12,1), og af den lokale etiske komité (etik kommission Ärztekammer Hamburg, WF-049/09 og PV3652). Ifølge lokale love, blev informeret samtykke ikke påkrævet til denne undersøgelse. Patientjournaler /oplysninger blev anonymiseret og de-identificeret før analyse. Alt arbejde er udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

Immunhistokemi

nyslået TMA sektioner blev immunofarvet på én dag, og i et eksperiment. Objektglas blev afparaffiniseret og udsat for varme-induceret antigen-genvinding i 5 minutter i en autoklave ved 121 ° C i pH 7,8 Tris-EDTA-citratbuffer. Affinitetsoprenset primære antistof HPA024756 rejst mod proteinet HOOK homolog 3 rekombinant protein epitop signatur tag (KEEIAQRCHELDMQVAALQEEKSSLLAENQVLMERLNQSDSIEDPNSPAGRRHLQLQTQLEQLQEETFRLEA) (kanin polyklonale antistof, Sigma, St. Louis, MO, USA; fortynding 1: 150) blev påført ved 37 ° C i 60 minutter. Specificitet af antistoffet blev valideret af fabrikanten, som det viste et enkelt bånd ved den forudsagte størrelse (83,1 kD) i en western blot. Bundet antistof blev derefter visualiseret under anvendelse af EnVision Kit (Dako, Glostrup, Danmark) i overensstemmelse med producentgaranti retninger [15]. Antistoffet normalt farves tumorcellen cytoplasmaet i alle celler (100%) af et givet væv stedet. Farvning intensitet af alle tilfælde blev således semikvantitativt vurderet i tre kategorier:. Negative, lave (svag til moderat) og høje (stærk farvning intensitet)

Statistik

Statistiske beregninger blev udført med JMP 10.0. 2-software (SAS Institute Inc., NC, USA). Kontingenstabeller og chi²-testen blev udført for at søge efter sammenhænge mellem molekylære parametre og tumor fænotype. Overlevelse kurver blev beregnet ifølge Kaplan-Meier. The Log-Rank-test blev anvendt til påvisning af signifikante forskelle mellem grupperne. Variansanalyse (ANOVA) blev anvendt for at søge efter forbindelser mellem celleproliferation og HOOK3 farvning. Cox proportionel risiko regressions analyse blev udført for at teste den statistiske uafhængighed og signifikans mellem patologiske, molekylære og kliniske variable. Separate analyser blev udført ved hjælp af forskellige sæt af parametre til rådighed enten før eller efter prostatektomi.

Resultater

Tekniske aspekter

I alt 10.572 (85,0%) af tumor prøver var fortolkelige i vores TMA-analyse. Grunde til ikke-informative tilfælde (1.855 spots; 15,0%) omfattede mangel på væv pletter i TMA sektionen eller fraværet af utvetydig kræft væv i TMA stedet

HOOK3 udtryk i normale og cancer prostata celler

.

Repræsentative billeder af negative og positive HOOK3 immunfarvninger er givet i fig 1. HOOK3 immunfarvning blev lokaliseret i cytoplasmaet i celler (fig 1c insert). Normale væv, afledt fra prostatacancerpatienter, viste ingen farvning af stromale og luminale celler, mens basale celler farvet positive (** i fig 1d). Positiv HOOK3 immunfarvning blev set i 5636 af vores 10.572 (53,3%) fortolkelige prostatakræft og blev betragtet som lav i 36,4% (figur 1b) og høj i 16,9% af kræft (figur 1c).

(a) negativ , (b) lav intensitet, (c) høj intensitet farvning ved 10x, mellemværker på 300x forstørrelse og (d) negative normale luminale celler og positive basale celler (*) sammen med højt niveau positiv kræft væv (**) i den samme kerne ved 150x forstørrelse

Association med TMPRSS2:. ERG fusion status og ERG proteinekspression

for at vurdere, om HOOK3 udtryk er forbundet med TMPRSS2: ERG fusion i prostatakræft, brugte vi data fra tidligere undersøgelser (udvidet fra [14,15] data om TMPRSS2:. ERG fusion status opnået ved FISH var til rådighed fra 6302 og ved immunhistokemi fra 9,370 tumorer med evaluerbare HOOK3 immunfarvning data om både ERG FISH og IHC var tilgængelige fra 6076 kræftformer. , og en identisk resultat (ERG IHC positive og pause ved FISH eller ERG IHC negative og manglende pause ved FISH) blev fundet i 5811 af 6076 (95,6%) kræftformer. Positiv HOOK3 immunfarvning var knyttet til TMPRSS2: ERG omlejring og ERG positivitet i prostatakræft. HOOK3 immunfarvning blev set i 74,3% og 76,1% af kræfttilfælde med TMPRSS2: ERG fusion opdaget af IHC og FISH, men findes i kun 38,2% af kræfttilfælde uden ERG farvning og 44,1% af kræfttilfælde uden ERG omlejringer påvist af FISH (p 0,0001 hver , figur 2)

IHC = immunhistokemi.; FISH = fluorescens in situ hybridisering.

Association med tumor fænotype

Når alle carcinomer blev i fællesskab analyseret, højt niveau HOOK3 ekspression blev signifikant forbundet med fremskreden patologisk tumor stadie, høj Gleason kvalitet, lymfeknudemetastaser (p 0,0001 hver) og kirurgisk margin positivitet (p = 0,0003). Der fandtes ingen korrelation med høje præoperative PSA-niveauer (p = 0,7594; tabel 2). Undergruppe analyse for ERG-negative og positive kræftformer afslørede lignende resultater (S1 og S2 Tables).

Association med andre centrale genomiske sletninger

Tidligere undersøgelser har fremlagt beviser for distinkte molekylære undergrupper af prostatakræft defineret af TMPRSS2: ERG-fusioner og flere genomiske deletioner. Andre og os har tidligere beskrevet en stærk sammenhæng med PTEN og 3p13 sletninger til ERG positivitet og 5q21 og 6q15 sletninger til ERG negativitet [16-19]. For at undersøge, hvorvidt HOOK3 udtryk kan være særligt forbundet med en af ​​disse genomiske sletninger, blev HOOK3 data i forhold til allerede eksisterende resultater på PTEN (10q23), 3p13 (FOXP1), 6q15 (MAP3K7) og 5q21 (CHD1) sletninger. I analysen af ​​alle tumorer, blev HOOK3 ekspression signifikant knyttet til alle ovennævnte deletioner (PTEN, 5q21 og 3p13 (p 0,0001 hver), 6q15 (p = 0,003), fig 3a). Disse foreninger varierede når undergruppe analyse blev udført for ERG negative (fig 3b) og ERG positive kræftformer (figur 3c). Her HOOK3 farvning blev stærkt korreleret med sletninger i PTEN (p 0,0001 for både ERG negative og positive kræftformer), 6q15 (begge p 0,0001) og 5q21 (p 0,0001, p = 0,01 henholdsvis), men ikke med 3p13 sletninger (p = 0,10 og p = 0,73 henholdsvis).

(a) alle kræftformer, (b) i ERG-negativ, c) ERG-positive delmængde.

Association med tumorcelleproliferation ( Ki67 mærkningsindeks)

Strong HOOK3 farvning blev signifikant forbundet med accelereret celleproliferation som målt ved Ki67LI i alle cancerformer samt i delmængder af cancere med identiske Gleason score (≤3 + 3, 3 + 4, 4+ 3, og ≥4 +4, s. 0,0001 hver, tabel 3)

Association med PSA recidiv

Opfølgende data var tilgængelige for 9,916 patienter med fortolkelige HOOK3 immunfarvning på TMA. En stærkt signifikant sammenhæng mellem højt niveau HOOK3 udtryk og tidlig PSA recidiv blev fundet, når alle tumorer blev analyseret, og også i undergruppen analyser for ERG negative og positive kræftformer (p 0,0001 hver, fig 4a-4e).

(a) alle cancere (n = 9540), (b) ERG-negativ (ERG

-) cancere (n = 4.732), (c) ERG-positive (ERG

+) cancere (n = 3.678 ), (d)

PTEN

ikke slettes (PTEN

norm) kræft (n = 4349), (e)

PTEN

slettede kræftformer (n = 1037).

multivariat analyse

Fire forskellige typer af multivariate analyser blev udført vurdering af den kliniske relevans af HOOK3 udtryk i forskellige scenarier (tabel 4). Scenarie 1 evalueret alle postoperativt tilgængelige parametre, herunder patologisk tumor stadie, patologisk lymfeknude status (PN), status kirurgisk margen, præoperativ PSA værdi og patologiske Gleason kvalitet opnået efter den morfologiske evaluering af hele resekterede prostata. I scenario 2 blev alle postoperativt tilgængelige parametre med undtagelse af nodal status inkluderet. Den rationelle for denne fremgangsmåde var, at indikationen og omfanget af lymfeknude dissektion ikke er standardiseret i den kirurgiske behandling af prostatakræft, og at udelukke pN i multivariat analyse kan markant øge sagsnumre. To yderligere scenarier havde til formål at modellere den præoperative situation, så meget som muligt. Scenarie 3 omfattede HOOK3 udtryk, præoperativ PSA, klinisk tumor stadie (CT etape) og Gleason kvalitet opnået på prostatektomi prøven. Da postoperative bestemmelse af en tumorer Gleason klasse er “bedre” end den præoperativt bestemt Gleason bedømmelse (udsat for stikprøvefejl og dermed under-grading i mere end en tredjedel af tilfældene [21]), blev der tilføjet en anden multivariat analyse. I scenario 4, blev den præoperative Gleason kvalitet opnået på den oprindelige biopsi kombineret med præoperativ PSA, CT scenen og HOOK3 udtryk. HOOK3 viste sig at være en uafhængig prognostisk parameter i alle scenarier, når alle tumorer og også undergrupper af ERG negative og ERG positive tumorer blev analyseret (tabel 4). HOOK3 viste sig at være en uafhængig prognosticator uafhængigt af den analyserede scenario eller undergruppe (alle kræftformer: p = 0,0003 i scenario 1, s 0,0001 i scenario 2-4; ERG negative kræftformer: p = 0,0002 i scenario 1, s 0,0001 i scenario 2-4, ERG positive kræftformer: p = 0,0381 i scenarie 1, p = 0,0433 i scenario 2, p = 0,0006 i scenario 3, s 0,0001 i scenario 4)

diskussion

.

resultaterne af denne undersøgelse viser, at højt niveau HOOK3 udtryk er en uafhængig prædiktor for tidlig PSA recidiv i prostatakræft.

Vores immunhistokemisk analyse viste cytoplasmatisk HOOK3 farvning i 85,0% af 10.572 analyserbare prostatakræft. Normal prostata epitel viste typisk negativt eller svag immunfarvning i luminale celler, mens basale og stromale celler ikke farvning for HOOK3. At stigende niveauer af HOOK3 parallel kræft aggressivitet er i overensstemmelse med en relevant rolle HOOK3 opregulering for prostatakræft udvikling og progression. Data fra det humane protein Atlas (www.proteinatlas.org) synes at antyde, at HOOK3 også kan op reguleres i andre typer kræft, herunder kolorektal cancer, endometriecancer, gliom, lungekræft, lymfom og kræft i skjoldbruskkirtlen [22].

Den stærke sammenslutning af højt niveau HOOK3 udtryk med negative tumor funktioner, herunder fremskredent stadium, høj Gleason kvalitet, nodal metastaser og PSA recidiv argumenterer for en praktisk relevans HOOK3 måling for prognose vurdering. Det stærke HOOK3 udtryk vedrørte prognostisk relevans selv i delmængde af kræft huser PTEN sletninger-en af ​​de stærkeste kendte prognostiske markører i prostatakræft [18,23,24] -FAGLIG fremhæver en klinisk relevant rolle HOOK3 test. Dette er så meget desto mere som den prognostiske betydning af HOOK3 var også uafhængig af kliniske og patologiske parametre. Vores omfattende multivariat modellering foreslår endvidere, at HOOK3 kunne være en klinisk anvendelig prognostisk markør i både præ- og postoperative scenarier. I betragtning af at en klinisk biomarkør skal undersøges fra biopsi materiale og før behandlingen beslutninger er truffet, er det at bemærke, at vores tilgang med at analysere molekylære funktioner på et minut TMA vævsprøve måler 0,6 mm i diameter tæt modeller de molekylære analyser af centrale nål biopsier hvor sammenlignelige mængder af væv evalueres. Som vores TMA prøver ikke ligefrem taget fra “værste” område af hver tumor, men tilfældigt fra et repræsentativt kræftområdet, kan vores TMA spot være så repræsentativt som muligt af den “værste” område af et klinisk cancer identificeret i et sæt cancer biopsier.

Det er ukendt, hvordan HOOK3 kan bidrage til udviklingen af ​​kræft og progression. Vi har ikke foretaget egne funktionelle eksperimenter, men det store antal prostatakræft indgår i vores projekt sammen med omfattende molekylær information på vores tumorer muligt for os at drage nogle konklusioner om formodede kræft-relevante roller HOOK3 “i silico”. Denne tilgang af “funktionel molekylær epidemiologi” først påvist, at HOOK3 ekspression er stærkt forbundet med klassiske parametre af genomisk ustabilitet, såsom forekomst af kromosomale deletioner, og for forhøjet celleproliferation. Deletioner af visse små og store kromosomale regioner er kendetegnende for prostatacancer. Data fra næste generation sekventering undersøgelser viser, at sådanne sletninger er mere udbredt end nogen mutationer af specifikke kodning gener, og mange af disse sletninger har været knyttet til enten ERG positiv (dvs. PTEN og 3p13) eller ERG negative kræftformer (dvs. 6q15 og 5q23). Det høje HOOK3 udtryk er knyttet til en højere forekomst af alle analyserede sletninger fremhæver en mulig inddragelse af HOOK3 om mekanismer, der regulerer genomisk integritet. Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde viser, at HOOK3 er relevant for korrekt funktion af centrosomer, da det er afgørende for transport og dynamisk samling af centrosomal proteiner [3,4]. Både banke ned og ektopisk overekspression af HOOK3 i cellelinje modeller resulterede i kompromitterede centrosomal funktioner [3], en fragmenteret Golgi apparatet, forstyrret dårligt organiseret mikrotubuli netværk, og en øget brøkdel af celler med to eller flere kerner [5]. Desuden har centrosom abnormiteter været knyttet til aneuploidi i prostatakræft før [25].

Vores in silico tilgang yderligere vist, at HOOK3 overekspression er stærkt knyttet til ERG aktivering. Mere end halvdelen af ​​alle prostatakræft, især hos yngre patienter, bære genfusioner forbinder androgen-regulerede TMPRSS2 genet med transskriptionsfaktoren ERG [14,26]. Disse genomiske rearrangementer resulterer i en androgen-drevet overekspression af ERG i berørte celler [27] og dermed ændret ekspression af mere end 1.600 gener i prostata epitelceller [28]. Det er imidlertid usandsynligt, at høje HOOK3 niveauer i ERG positive kræftformer er drevet af direkte aktivering, fordi HOOK3 promotorregionen mangler ERG bindingssteder. Alternative forklaringer på den positive sammenslutning af HOOK3 og ERG udtryk ville omfatte en direkte eller indirekte samspil mellem disse to proteiner. Det kan for eksempel være muligt at HOOK3 -responsible til transport af centrosomal proteiner-interagerer med centrosomal proteiner, såsom integrin-linked kinase (ILK), som er en relevant funktionel partner af ERG [29,30]. ILK og ERG har vist sig at kooperativt køre malign transformation og epitelial-mesenkymale overgang i prostatakræft [31].

Sammenfattende vores undersøgelse dokumenterer, at HOOK3 er en uafhængig prognosticator i prostatakræft. Vi derfor foreslå, at HOOK3 udtryk analyse har potentiale til klinisk rutinemæssig anvendelse-enten alene, eller mere sandsynligt, i kombination med andre biomarkører. Vores store væv microarray tilgang vil fortsætte med at vise sig særdeles medvirkende til løbende at identificere egnede prognostiske biomarkører. Stor skala molekylære databaser forbundet til store TMA’er også aktivere begrænsede funktionelle analyser “i silico”.

Støtte Information

S1 Table. Klinisk-patologisk sammenslutning af HOOK3 immunfarvning i ERG negative delmængde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134614.s001

(DOC)

S2 Table. Klinisk-patologisk sammenslutning af HOOK3 immunfarvning i ERG positive delmængde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134614.s002

(DOC)

Tak

Vi takker Janett Lüttgens , Sünje Seekamp og Inge Brandt for fremragende teknisk bistand.