PLoS ONE: Identifikation af uPAR-positive kemoterapi Celler i småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

urokinaseplasminogenaktivator (uPA) og dens receptor (uPAR /CD87) er store regulatorer af ekstracellulær matrix-nedbrydning og er involveret i cellemigrering og invasion under fysiologiske og patologiske tilstande. Den uPA /uPAR systemet har været af stor interesse i kræftforskning, fordi det er involveret i udviklingen af ​​de fleste invasive kræft fænotyper og er en stærk indikator for dårlig patient overlevelse. Men lidt er kendt om den rolle, uPA /uPAR i småcellet lungecancer (SCLC), den mest aggressive form for lungekræft. Vi afgøres derfor, om uPA og uPAR er involveret i produktion af narkotika resistente SCLC celle fænotype.

Metoder og Resultater

Vi screenede seks humane SCLC cellelinier til overfladen markører for formodede stamceller og kræftceller. Vi anvendte fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), fluorescensmikroskopi og klonogene assays til at demonstrere uPAR ekspression i en subpopulation af celler afledt fra primære og metastatiske SCLC-cellelinier. Cytotoksiske assays blev anvendt til at bestemme følsomheden af ​​uPAR-positive og uPAR-negative celler til kemoterapeutiske midler. De uPAR-positive celler i alle SCLC linjer viste multiresistens, høj klonogene aktivitet og co-ekspression af CD44 og MDR1, formodede cancer stamceller markører.

Konklusioner

Disse data tyder på, at uPAR-positive celler kan definere et funktionelt vigtig population af kræftceller i SCLC, der er resistente over for traditionelle kemoterapi, og kunne tjene som kritiske mål for mere effektive terapeutiske interventioner i SCLC

Henvisning:. Gutova M, Najbauer J , Gevorgyan A, Metz MZ, Weng Y, Shih CC, et al. (2007) Identifikation af uPAR-positive kemoterapi celler i småcellet lungekræft. PLoS ONE 2 (2): E243. doi: 10,1371 /journal.pone.0000243

Academic Redaktør: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, USA

Modtaget: Januar 15, 2007; Accepteret: 31 Januar 2007; Publiceret: 28 feb 2007

Copyright: © 2007 Gutova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde er krediteret.

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er den mest aggressive form for lungekræft og har en ensartet dårlig prognose. Metastaser udvikle sig hurtigt, primært til knoglemarv og hjerne, og de er sædvanligvis til stede på tidspunktet for diagnosen. I ubehandlede patienter, median overlevelse er to måneder fra symptomdebut [1].

I flere typer af tumorer forhøjede niveauer af urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens receptor uPAR (CD87) kraftigt korrelere med dårlig prognose og ugunstige kliniske resultat [2], [3], [4], [5], [6]. uPA og uPAR er medvirkende til membran-associeret ekstracellulært proteolyse og transmembrane signalering og således påvirke cellemigration og invasion under fysiologiske og patologiske tilstande [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR overekspression i maligne celler resulterer fra aktivering af flere onkogene veje, herunder MAPK, RTK, ERK2 og FAK [2], [7], [9]. Multiple onkogene mutationer, herunder p53 i cancerceller føre til ukontrolleret ekspression af uPA /uPAR [11]. Inhibering af uPAR i en musemodel af ikke-småcellet lungekræft og andre tumorer inhiberede tumorvækst, invasion, angiogenese og metastase [12], [13], [14]. Øget uPAR er korreleret med højere dødelighed hos patienter med planocellulært og ikke-småcellet lungecancer [15], [16], men lidt er kendt om den rolle, uPA /uPAR udtryk i SCLC.

En nylig undersøgelse fra Alfano

et al

understreger betydningen af ​​uPAR signalering i forebyggelse af apoptose ved modstand af kræftceller til anoikis (apoptose induceret af tab af forankring). uPAR-ekspression fremmer celleoverlevelse ved at aktivere anti-apoptose faktor Bd-XL transkription gennem MEK /ERK- og PI3K /Akt-afhængige pathways [17]. Vi derfor hypotesen, at uPAR-ekspression kan være involveret i udviklingen af ​​lægemiddel-resistente cancerfænotypen i SCLC.

Vi rapporterer her nærvær af en sjælden population af uPAR-positive celler i humane SCLC-cellelinier, der demonstrerer signifikant lægemiddel resistens mod traditionelle kemoterapeutiske midler, såsom 5-fluoruracil (5-FU), cisplatin og etoposid. De uPAR-positive celler udtrykte stem- og cancer cellemarkører, herunder CD44 og MDR1. Identifikation og målretning af uPAR-positive celler i SCLC kan give værdifuld indsigt i biologi menneskelig lungekræft og kan oprette nye kritiske mål for mere effektive anticancer behandlingsformer.

Metoder

Immunfarvning og flowcytometri Analysis

Primær (lunge) småcellet carcinom (SCLC) cellelinier (H1688, H1417, H69AR), knoglemarv (BM) metastatisk SCLC (H211, H1882) og hjerne metastatisk SCLC (H250) cellelinier blev opnået fra human primær lunge og metastatiske væv (ATCC), dyrket i RPMI 1640 modificerede medium (ATCC, N: 30-2001) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS). BM metastatisk cellelinie (H1882) blev dyrket i komplet HITES medium (D-MEM /F-12, N: 30-2006 suppleret med insulin 5 pg /ml, transferrin 10 ug /ml, natriumselenit 30 nM, hydrocortison 10 nM , β-østradiol 10 nM, L-glutamin 2 mM, HEPES 10 mM og 5% FBS). Celler blev dyrket i to uger og blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af de følgende antistoffer: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) fra Chemicon, CD87 (3936CJ) fra American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) fra R F) SCLC-cellelinier, i modsætning til andre markører, som varierede i overflod, tyder på, at uPAR-positive celler kan omfatte en funktionelt unik subpopulation af celler

kemoresistens af uPAR. -positive celler

Vores hypotese, at uPAR-udtrykkende cellepopulation kan være resistente over for kemoterapeutiske midler. Vi udførte cytotoksicitetsassays på tre udvalgte cellelinjer ved hjælp af ikke-sorteret (bulk) samt Weaver uPAR-positive og uPAR-negative cellepopulationer. Stigende koncentrationer af 5-fluoruracil (5-FU) (10, 100, 200 ug /ml) blev tilsat til disse cellekulturer og inkuberet i 72 timer, efterfulgt af tælling af både levedygtige og dræbte celler. Dataene blev normaliseret til 100%, hvilket betød at antallet af uPAR-positive og uPAR-negative celler uden lægemiddel tilsat. En celle-dræbende effekt blev påvist i alle tre ikke-sorterede cellelinjer (H211, H69AR, H1417), hvor 40-80% af cellerne blev dræbt af 5-FU (figur 2A). Vigtigt er det, der vises, uPAR-positive sorterede celler fra disse tre cellelinier signifikant forøget resistens over for 5-FU, med kun 40-50% af cellerne er dræbt i tilfældet med H211 og H1417 (figur 2B). Selvom H69AR cellelinjen viste også forskellen drab af uPAR-positive og uPAR-negative celler (fx 10 ug /ml 5-FU dræbte 30% af uPAR-positve celler versus 85% af uPAR-negative celler), ved høj koncentration af 5-FU (200 ug /ml), den dræbende effekt for begge populationer (H69AR) var den samme (-100%). Statistisk analyse (2-vejs ANOVA) af uPAR (+) og uPAR (-) datasæt afslørede signifikante forskelle i overlevelse uPAR (+) og uPAR (-) celler efter behandling med 5-FU (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 for H211, H69AR, H1417-celler, henholdsvis) (figur 2B).

cytotoksiske virkning af 5-FU på ikke-sorteret og sorteret (uPAR-positive og uPAR-negative populationer) afledt fra SCLC-cellelinier. (A) 1 x 10

4 celler (H211, H69AR, H1417) blev anbragt i brønde i en 48-brønds plade i tre eksemplarer og inkuberes i 72 timer i nærvær af varierende koncentrationer af 5-FU. (B) SCLC-cellelinier blev FACS sorteret efter farvning med anti-uPAR-antistoffer og blev udpladet ved samme udsåningstæthed (4 × 10

3 /brønd af 96-brønds plade) og behandlet med 5-FU ved 0, 10 , 100, 200 ug /ml i 72 timer. Cell overlevelse blev evalueret efter tilsætning Guava ViaCount reagens og tælle levedygtige og døde celler. Kun levedygtige celler blev inkluderet i dataanalysen, og levedygtigheden 100% blev defineret som antallet af levedygtige celler dyrket i fravær af 5-FU. Statistisk analyse (2-vejs ANOVA) af uPAR (+) og uPAR (-) datasæt afslørede signifikante forskelle blandt levedygtighed uPAR (+) og uPAR (-) celler (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 for H211, H69AR, H1417 celler, henholdsvis). Datapunkterne repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Vi undersøgte ligeledes den cytotoksiske virkning af cisplatin og etoposid, midler, der anvendes til behandling af patienter med SCLC. De ikke-sorteret SCLC-cellelinier (H211, H69AR, H1417) blev anvendt i cytotoksiske assays med cisplatin og etoposid i

in vitro

undersøgelser (3, 10, 100 ug /ml) (figur 3A). 60-80% af cellerne blev dræbt af cisplatin og etoposid (anvendes separat eller i kombination) i ikke-sorteret linier (figur 3A). Igen vises uPAR-positive sorterede celler fra disse tre cellelinier signifikant forøget resistens over for cisplatin og etoposid, med kun 30-50% af cellerne blev dræbt, sammenlignet med 60-80% drab af de uPAR-negative sorterede celler (data ikke vist). Disse data antyder, at uPAR-positive celle subpopulation i SCLC kan være ansvarlige for kemoresistens til 5-FU og andre traditionelle kemoterapeutiske lægemidler såsom cisplatin og etoposid.

cytotoksiske virkning af cisplatin og etoposid på ikke-sorterede celler afledt fra SCLC-cellelinier. (A) SCLC-cellelinier (ikke-sorteret) behandlet med cisplatin, etoposid ved koncentrationer 0, 3, 10, 100 ug /ml eller deres kombinationer (cisplatin og etoposid ved slutkoncentrationer på 10 pg /ml, 100 pg /ml) i 72 timer. Celleoverlevelse blev evalueret efter tilsætning af Guava ViaCount reagens og tælling af både overlevende og døde celler ved anvendelse Guava ViaCount software. Data blev normaliseret til 100% levedygtighed celler dyrket i fravær af lægemidler. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse af tredobbelte kulturer (resultater af tre uafhængige forsøg). (B) Efter behandling cisplatin og etoposid, blev levedygtige adhærente celler løsgøres ved trypsinbehandling og blev farvet med anti-uPAR-FITC-antistoffer og procentdelen af ​​uPAR-positive celler blev bestemt ved FACS-analyse. Prøve med muse-IgG isotypekontrolantistof blev brugt til at angive værdien af ​​FACS porten, som blev anvendt på alle prøver farvet med uPAR-FITC.

For at bekræfte, at uPAR ekspression giver tumor resistens over for cisplatin og etoposid, udførte vi cytotoksicitetsassays på de samme ikke-sorterede SCLC-cellelinier og kiggede for berigelse af uPAR-positive celler i den overlevende cellepopulation. Faktisk vi registreret en betydelig berigelse af uPAR-positive celler (40-70%) blandt overlevende celler, sammenlignet med kun 1-5% af uPAR-positive celler i kontrolkulturer dyrket i fravær af disse lægemidler (figur 3B). Disse data understøtter den hypotese, at uPAR ekspression giver kemoresistens i SCLC, og at uPAR-positive celler bør betragtes som en ny mål for mere effektive behandlingsformer.

Klonogen Aktivitet af uPAR-positive celler

For at vise, at uPAR-positive celler besidder høj klonogene og selvfornyelse potentiale, vi sorteret primær lunge (H1417, H69AR), metastatisk knoglemarv (H211) cellelinier ved FACS under anvendelse af anti-uPAR-FITC-konjugerede monoklonale antistoffer. Efter sortering (97% renhed), blev uPAR-positive og uPAR-negative celler udpladet i methylcellulose medier ved densiteter på 3000, 1000, 100 celler /brønd (6-brønds plade). uPAR-positive celler fra disse primære og metastatiske SCLC-linier dannet multiple særskilte kolonier (figur 4A). Vi anslås, at ca. -10% af uPAR-positive celler (lunge, H1417, knoglemarv, H211) dannet kolonier (figur 4B). Omvendt uPAR-negative celler fra den primære lunge (H1417) celler dannede ikke kolonier, og fra metastatisk knoglemarv (H211) og lunge (H69AR) dannet kun få kolonier (figur 4B). Efter uPAR-positive celler fik lov til at danne kolonier i 16 dage i methylcellulose kultur blev 20 kolonier isoleret og analyseret for uPAR-ekspression ved flowcytometri. Vi fandt både uPAR-positive og uPAR-negative celler i hver koloni analyseres (H1417), med 30-50% af celler, som viser uPAR positivitet inden for hver koloni, efter 18 dages inkubation (figur 4C). Dette antyder, at uPAR-positive celler kan give både uPAR-positive og uPAR-negative celler. uPAR-ekspression blev også analyseret i kolonierne afledt af H211 og H69AR cellelinier. I alle kolonier afledt fra sorterede uPAR-positive celler vi påvist både uPAR-positive og uPAR-negative celler (~ 50% hver efter 16 dage i methylcellulose kultur) (data ikke vist). Analyse af kolonier afledt af uPAR-negative celler (fx H211 cellelinien) afslørede en lille del af uPAR-positive celler i disse kolonier ( 1%). Grunden til dette kunne være muligt kontaminering under sorteringen. Alternativt kan uPAR-negative cancerceller erhverve uPAR ekspression under visse dyrkningsbetingelser. Adskillige uPAR-positive kolonier er blevet opsamlet og dyrket yderligere i 2 uger i RPMI dyrkningsmedium, efterfulgt af FACS-sortering og klonogene assay. Interessant, vi har registreret en tilsvarende andel af uPAR-positive og uPAR-negative celler (1-5% og 95-99%, henholdsvis) i disse kulturer, hvilket tyder på, at uPAR-positive kolonier kan rekapitulere forældrenes celle fænotype. I kulturer afledt af uPAR-negative kolonier på den anden side har vi bemærket lavere niveauer (0,1-0,8%) af uPAR-positive celler og generelt dårlig vækst (data ikke vist).

Kolonidannende aktivitet uPAR-positive og uPAR-negative celler afledt fra SCLC-cellelinier. (A) H1417- afledt, uPAR-positive sorterede celler dannede flere kolonier i methylcellulose medier, mens uPAR-negative celler fra de samme slags viste lille eller ingen klonogene aktivitet. (B) Grafisk fremstilling af kolonidannende evne uPAR-positive og uPAR-negative celler ved forskellige plating densiteter 3000, 1000, 100 celler /6-brønds plade (H1417, H69AR, H211). (C) Fordeling af uPAR-positive celler i kolonierne afledt ud uPAR-positive celler dyrket i methylcellulose medier. I alt 20 celle kolonier fra H1417 cellelinje blev analyseret.

Co-ekspressionen af ​​uPAR med CD44 og MDR1

Vi yderligere hypotese, at hvis uPAR-positive celler repræsenterer narkotikarelaterede resistente og klonogenisk befolkning i SCLC, kan de udtrykke CD44 og MDR1 (ABCB1) gener, der er involveret i udviklingen af ​​kræft stamceller fænotype og multiresistens. Til yderligere karakterisering af uPAR-positive population Vi udførte eksperimenter dobbelt-mærkning med uPAR-FITC, og CD44-PE samt MDR1-PE på H211, H69AR, H1417 cellelinier. uPAR-positive celler afledt fra SCLC-cellelinier (H211, H69AR, H1417) udtrykte CD44 på 50-80%, hvorimod MDR1 på 10-40% af cellerne (figur 5A). Ekspression af de ovennævnte markører blev også bekræftet under anvendelse af fluorescensmikroskopi (Figur 5B). De uPAR-negative celler udtrykte også CD44 (-70% for H211 og H69AR celler ~ 10% for H1417) og MDR1 (1-10% for alle cellelinjer) (Fig 5A.). Disse data antyder en berigelse af CD44-ekspression på H1417 celler, hvorimod MDR-1 viste forøget ekspression på uPAR-positive celler afledt fra alle tre cellelinier i forhold til uPAR-negative celler (fig. 5A).

Ekspression af CD44 og MDR1 på uPAR-positive og uPAR-negative celler. (A) FACS-analyse af, H211, H69AR og H1417 SCLC-cellelinjer dobbelt-mærket med uPAR-FITC og CD44-PE, MDR1-PE. Procentdelen af ​​celler, der udtrykker CD44 og MDR1 blev beregnet separat for uPAR-positive og uPAR-negative celler. (B) Fluorescerende mikroskopisk analyse af dobbelt-mærket og FACS-sorterede celler. Eksempler på uPAR-FITC /CD44-PE dobbelt-mærkning (a, b, c) og uPAR-FITC /MDR1-PE dobbelt-mærkning (d, e, f). (Bf-indsat) H1417 cellelinje farvet med mus IgG isotypekontrol-PE (rød), isotypekontrol-FITC (grøn) og DAPI (blå).

Diskussion

vigtigste resultat af denne undersøgelse er at identificere en sjælden underpopulation af uPAR-positive celler i SCLC cellelinjer afledt af lunge og metastase til knoglemarv og hjerne. Det er veldokumenteret, at uPAR overekspression i forskellige ondartede tumorer er stærkt korreleret med de fleste invasive kræft fænotyper og dårlig prognose [2], [4], [15], [18].

Flere undersøgelser tyder på tilstedeværelse af en sjælden population af celler i faste tumorer og leukæmi, der besidder evnen til at regenerere og udbrede tumoren [19], [20], [21], [22], [23]. Disse celler kan også være ansvarlig for vedligeholdelsen af ​​tumorens maligne potentiale og fungere som den underliggende årsag til tumor tilbagefald [24], [25]. Aktuelle behandlingsstrategier kan mislykkes at målrette den lægemiddel-resistente underpopulation, og kunne forklare den initiale terapeutiske respons hos flertallet af tumorceller, som efterfølges af en senere fornyet.

Vi fandt, at uPAR-positive celler var mere resistente over for behandling med det cytotoksiske middel 5-FU, mens uPAR-negative celler blev dræbt langt mere effektivt. Den cytotoksiske virkning af 5-FU er blevet tilskrevet fejlinkorporering af fluoronucleotides til RNA og DNA og til inhibering af nukleotidet syntetisk enzym thymidylatsyntase, som primært er rettet mod de hurtigt delende celler [26]. Vi undersøgte også cisplatin og etoposid, kemoterapeutiske midler, der anvendes i behandling af SCLC patienter. Vigtigere, dyrkning af SCLC celler i nærvær af cisplatin og etoposid resulterede i selektivt drab af uPAR-negative celler med samtidig berigelse af uPAR-positive cellepopulation.

uPAR-positive celler isoleret fra tre SCLC-linier kunne at proliferere og danne flere kolonier i methylcellulose medier, mens uPAR-negative celler udviste lille eller ingen klonogene potentiale. Vi viste også co-ekspression af uPAR med CD44 og MDR1, hvilket kan forklare sammenhængen mellem fremskreden malignitet og resistens. Flere undersøgelser har undersøgt individuelt rolle uPAR, CD44 og MDR1 i forskellige maligniteter [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, imidlertid så vidt vi ved er dette den første undersøgelse, der giver evidens for ekspression af CD44 og MDR1 på uPAR-positive celler i SCLC. Vi har detekteret også CD44 og MDR1 udtryk på uPAR-negative celler, de funktionelle konsekvenser af som endnu ikke er fastlagt.

ATP-bindende kassette (ABC) narkotika transportører har vist sig at beskytte cancer stamceller fra kemoterapeutiske stoffer 33 . En væsentlig transportør af ABC familien er P-glycoprotein, produktet af MDR1-genet, som er produceret af hæmatopoietiske stamceller (HSC) 32. MDR1-genet bliver nedreguleret på HSC ved celledifferentiering 32. P-glycoprotein og CD44 er blevet karakteriseret og er kendt for at være determinanter af multiresistens på cancerceller, som medieres ved fysiske og genetiske interaktioner mellem CD44 og MDR1 30. Aktivering af CD44 sker gennem heterodimerisering af CD44 med vækstfaktorreceptorer (f.eks EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, TGF-pR), hvilket fører til aktivering af MAP-kinase og PI3K-AKT signalveje 34. CD44 stimulering med dens ligand hyaluronan opregulerer ekspressionen af ​​uPA og uPAR mRNA, gennem aktivering af MAPK-Ras-vejen , mens PI3K aktivering stimulerer MDR1 udtryk og funktion 34. PI3K også fungerer som en positiv feedback loop til at stimulere hyaluronan produktion, som aktiverer CD44 35,36. CD44-MAPK-PI3K-signalering fører til ukontrolleret ekspression af uPA /uPAR og MDR1, som fremmer invasive og multiresistent cancer cellefænotype. Ud over den CD44-MAPK-PI3K-signalering, kan uPAR overekspression inducerer celleoverlevelse ved at aktivere anti-apoptose faktor Bd-XL transkription 17.

Fremtidige studier i dyremodeller vil tage fat om uPAR-positive celler er ansvarlige for primær tumorvækst og dannelsen af ​​fjerne metastaser i SCLC. Sammenfattende har vi identificeret uPAR-positive underpopulation af SCLC celler, der besidder høj multiresistens og klonogene aktivitet, mens uPAR-negative celler er følsomme over for kemoterapeutiske lægemidler og vise lille eller ingen klonogene aktivitet. Vi leverer også dokumentation for sammenslutning af uPAR, CD44 og MDR1 udtryk på SCLC celler. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at afgøre, om målretning af denne celle population vil være afgørende for terapeutisk succes.

Tak

Vi takker Dr. Kristine A. Justus til ekspert redigering af manuskriptet, Lucy Brown for hjælpe med flowcytometri målinger og Sofia Loera om bistand med immunohistokemiske teknikker. Vi takker Dr. Kemp Kernstine til tilvejebringelse cisplatin og etoposid. Dette arbejde er dedikeret til kærlig erindring om Hrach Shahmanyan.