PLoS ONE: Tab af SIRT1 Funktion Forbedrer Intestinal Anti-Bakteriel Defense og Beskytter mod Colitis-induceret Kolorektal Cancer

abstrakt

dysfunktion af Paneth og slimceller i tarmen bidrager til inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og colitis-associerede kolorektal cancer (CAC). Her rapporterer vi en rolle for NAD

+ – afhængig histondeacetylaseaktivitet SIRT1 i kontrollen af ​​antibakteriel forsvar. Mus med en intestinal specifik

SIRT1

mangel (

SIRT1

int – /-

) har mere Paneth og bæger celler med en deraf følgende omlægning af tarmen mikrobiota. Fra et mekanistisk synspunkt er virkningerne på muse intestinal celle modning medieret af SIRT1-afhængige ændringer i acetylering status SPDEF, en master regulator af Paneth og slimceller. Vores resultater tyder på, at målrette SIRT1 kan være af interesse i forvaltningen af ​​IBD og CAC

Henvisning:. Lo Sasso G, Ryu D, Mouchiroud L, Fernando SC, Anderson CL, Katsyuba E, et al. (2014) Tab af SIRT1 Funktion Forbedrer Intestinal Anti-Bakteriel Defense og Beskytter mod Colitis-induceret kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10,1371 /journal.pone.0102495

Redaktør: Salvatore Papa, Institut for Hepatology – Birkbeck, University of London, England

Modtaget: Maj 20, 2014; Accepteret: 19. juni 2014, Udgivet: 11. juli 2014

Copyright: © 2014 Lo Sasso et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. GLS er understøttet af et udgående italiensk Association for Cancer Research (AIRC) /Marie Curie Fellowship. JA KS laboratorium er støttet af tilskud fra École Polytechnique Fédérale de Lausanne, EU programmet Idéer (AdG-231.138), den schweiziske National Science Foundation (31003A-140.780 og 310.030 til 143.748), den Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 og KFS-2809-08-2011) og NIH (R01AG043930). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Paneth og slimceller er højt specialiserede små intestinale epitelceller, som syntetiserer og secernerer antimikrobielle peptider og slim. Disse faktorer udgør den første linje i forsvaret mod patogener og er afgørende for at opretholde den subtile balance mellem forskellige bakteriearter, der koloniserer pattedyrs tarmen [1]. Dysbiotic mikrobiota indvirkning på sundheden hos værten og bidrage til patogenesen af ​​flere tarmsygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og colitis-associerede kolorektal cancer (CAC) [2].

differentiering og modning af Paneth og slimceller styres af Wnt og Notch signaleringskaskader, der samarbejder for at fremme specifikationen af ​​de forskellige cellelinier [3]. Desuden SAM pegede domæne indeholdende ETS transkriptionsfaktor (SPDEF), en nedstrøms effektor af både Wnt og Notch veje, er kendt for at forbedre differentieringen af ​​både Paneth og bæger celler fra deres fælles Stamform [4]. SPDEF blev oprindeligt identificeret som en regulator af prostata-specifikt antigen [5], men senere også forbundet til bryst-, lunge- og tarm epitel, med mulig inddragelse i cancer progression i disse væv [6], [7].

sirtuin 1 (SIRT1), en NAD

+ – afhængig deacetylase [8], er involveret i en lang række af cellulære processer, herunder metabolisme, celleproliferation og apoptose, og immunrespons [9]. Rolle SIRT1 i reguleringen af ​​intestinal homeostase er kun lige begyndt at blive belyst. For nylig er blevet foreslået en involvering af intestinal SIRT1 i systemisk galdesyre og cholesterolmetabolisme [10]. Desuden undersøgelser, der fokuserer på den rolle, SIRT1 i kolorektal udvikling af kræft ved hjælp af APC

min /+ mus som model viste modstridende resultater understøtter både tumor fremme [11] og tumor undertrykke [12], [13] funktioner.

Brug mus med en tarm-specifikke

SIRT1

sletning (

SIRT1

int – /-

), viser vi her, at SIRT1 regulerer Paneth og pokalen celle modning og produktion af anti-bakterielle proteiner. Disse virkninger afhænger SIRT1-medierede ændringer i acetylering status SPDEF. Desuden tarm

SIRT1

sletning har en stor indvirkning på tarmen microbiome og beskytter mus fra IBD og CAC. Især virkningerne af

SIRT1

mangel på produktion af anti-bakterielle proteiner er evolutionært bevaret i

C.elegans

fremhæve den gamle karakter af denne funktion af SIRT1. Tilsammen vores resultater tyder på, at målrette SIRT1 kan være af interesse for forvaltningen af ​​IBD og CAC

Materialer og metoder

Generering af SIRT1

int -. /- Og SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ert2 mus

til fremstilling af

SIRT1

floxet (

SIRT1

L2 /L2

) mus, genomisk DNA dækker

SIRT1

locus blev forstærket fra 129Sv stammen af ​​high-fidelity PCR. De resulterende DNA-fragmenter blev samlet i mål-vektoren fra Institut Clinique de la Souris (Strasbourg, Frankrig). Konstruktionen, i hvilken exon 5, 6 og 7 blev flankeret af loxP-steder blev derpå elektroporeret ind 129Sv embryonale stamceller (ES) -celler (Figur S1B). G418-resistente kolonier blev selekteret og analyseret for homolog rekombination ved PCR og positive kloner blev verificeret ved Southern blot-hybridisering. Korrekt målrettede ES-kloner blev injiceret i blastocyster og overførtes til pseudo hunner, hvilket resulterer i kimære afkom, der blev parret med C57BL /6J mus, der udtrykker Flp-rekombinasen under kontrol af den allestedsnærværende cytomegaloviruspromotor [14]. Afkom, der videregav den muterede allel, og at tabte Flp transgen (

SIRT1

L2 /WT

mus) blev derefter udvalgt, og tilbagekrydset til C57BL /6J mus i ti generationer. For tarmen mikrobiota analyse SIRT1

int – /- og SIRT1

L2 /L2 var co-opstaldet under specifikke patogenfrie forhold i samme rum. Mus behandlet med AOM /DSS blev enkeltvis opstaldet efter fravænning for at undgå forskelle i DSS indtag. Men SIRT1

int – /- og SIRT1

L2 /L2 blev behandlet under SPF forhold i samme rum. Især SIRT1

int – /- og SIRT1

L2 /L2-mus kommer fra de samme forældre. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle og schweiziske retningslinjer og godkendt af det kantonale myndigheder i kantonen Vaud. Desuden blev alle dyreforsøg tilpasset til den schweiziske Animal Welfare lovgivning og revideret af staten Etiske bestyrelse Canton de Vaud (Animal Welfare Act 2005, Project License nr 2463-2463.1-2605 licens til Prof. Johan Auwerx). Endelig blev alle dyreforsøg godkendes af den uafhængige stat Vaud Veterinary kontor etisk bord, der fungerer i overensstemmelse med dyreværnsloven, de AAALAC internationale retningslinjer, den schweiziske og EU-lovgivning. Mus blev eutaniseret ved hjælp af en kort udsættelse for CO

2. Denne metode fører til hurtig og smertefri kvælning i mus. Alle forsøg blev udført perioden fra oktober 2011 til april 2014.

plasmider

pattedyr ekspressionsvektor puse-SIRT1 blev købt fra Upstate. Den SPDEF kodende sekvens hører til muse Transcription Factor Resource [15]. Det blev amplificeret og ligeret til pCDNA3-FLAG eller pGEX-GST. pCruzHA SIRT1G261A (plasmid 10963) [16] og pGL2Basic-EcadK1 (plasmid 19290) [17] blev købt af Addgene. pGEX-GST SPDEFK294Q blev genereret ved hjælp af site-directed mutagenese.

C.elegans

analyser

C.elegans

stammer blev dyrket ved 20 ° C på nematode vækstmedier agarplader (NGM) seedet med

E. coli

stammen OP50 medmindre andet er angivet. Stammer bruges var vildtype Bristol N2, VC199

sir-2.1 (ok434)

IV, SAL129 [

pha-1 Hotel (E2123) III

lys-1

: : GFP +

pha-1 Hotel (+)], og SAL105 [

pha-1 Hotel (E2123) III

lys-7 Mærkat :: GFP +

pha- 1 Hotel (+)]. Stammerne blev leveret af

Caenorhabditis

Genetik Center (University of Minnesota). Bakterielle feeding RNAi eksperimenter blev udført som beskrevet [18].

sir-2.1

(R11A8.4) klon blev købt fra GeneService og sekventeret.

Kvantificering af GFP

ekspression blev udført ifølge beskrevne protokoller [19]. For billede erhvervelse af

lys-7 Mærkat :: GFP udtryk, dyrene blev monteret på to% agarose pads i 10 mM tetramisol (Sigma) og undersøges med Zeiss Axioplan-2 mikroskop (Carl Zeiss).

mRNA udvinding og RT-qPCR-analyse

RNA blev isoleret fra væv ved hjælp af TriPure reagenset (Roche) i overensstemmelse med producentens anvisninger. cDNA blev dannet fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). QRT-PCR blev udført under anvendelse LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) og analyseret gennem ΔΔCT beregning. Værdier blev normaliseret til cyclophilin udtryk. Primere er opregnet i tabel S1 i File S1. Salg

Luciferase assay

PC3-celler (ATCC) i 96 /brønde plader blev co-transficeret med et reporter indeholdende SPDEF responselementet af den humane E -cadherin promotor, pGL2Basic-EcadK1 og pcDNA3, pCDA3-FLAG-SPDEF eller pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q med eller uden puse-SIRT1 ekspressionsvektorer (jetPEI transfektion; POLYPLUS). Medium blev fjernet efter 24 timer, cellerne blev vasket med kold PBS, og Luciferase Substrat (Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega) blev tilsat før Luciferase måling af Victor × 3. β-galactosidase blev brugt til normalisering.

In vitro acetylering og deacetylering analyser

In vitro acetylering og deacetylering analyser blev udført som oprindeligt beskrevet [20]. Kort fortalt, 1 ug rekombinant SPDEF protein, opnået fra BL21-stammen, blev inkuberet med 500 ng rekombinant p300 i acetylering buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 1 mM natriumbutyrat og 150 uM acetyl-CoA) i 1 time ved 30 ° C. Efter inkubation blev prøverne opløst på SDS-PAGE og analyseret ved western blot eller anvendt til in vitro-deacetylering assays. For deacetylering assays blev 1 ug af acetyleret SPDEF inkuberet med 500 ng rekombinant SIRT1 protein i deacetylering puffer (50 mM Tris-HCI, pH 9, 4 mM MgCI2, 0,2 mM DTT, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 1 mM NAD

+) i 30 minutter under konstant omrøring. De inkuberede prøver blev opløst på SDS-PAGE og analyseret ved western blot eller anvendt til kortlægning et acetyleret remanensen med nano-LC-MS /MS. Rekombinante p300, SIRT1, SIRT6 og SIRT7 proteiner blev foretaget af Dr. Michael O. Hottiger (Zürich Universitet). Cellebaseret deacetylering blev analyseret i HEK293T celler transficeret med pCDA3-FLAG-SPDEF eller pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q med eller uden Puse-SIRT1 eller pCruzHA-SIRT1G261A ekspressionsvektorer ved jetPEI Transfektion kit (POLYPLUS). 22 timer senere blev medierne erstattet med frisk medium (Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g /l glucose, 10% føtalt kalveserum, 0,1 mM NEAA, 50 ug /ml gentamicin og 1 mM natriumbutyrat). Efter 2 timer blev helcelle-lysater fremstillet ved hjælp af IP lysepuffer (50 mM Tris HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM natriumbutyrat og 10 mM nicotinamid) suppleret med Complete proteaseinhibitorcocktail Tablets (Roche). 0,5 mg til 1 mg af helcelle-lysater blev anvendt til immunpræcipitering (IP). IP blev udført med FLAG-agarose Affinity Gel som beskrevet af leverandøren (A2220, Sigma-Aldrich). Efter undersøgelsesperioden blev prøver påført på SDS-PAGE og analyseret ved western blotting.

cellekultur transfektion og antistoffer

HEK293 og PC3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium, herunder 4,5 g /l glucose, 10% føtalt kalveserum, 0,1 mM NEAA og 50 ug /ml gentamicin ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære. HEK293T og PC3-celler blev transficeret under anvendelse JetPei reagens (

POLYPLUS Transfektioner

, Illkirch, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. Antistoffer: Lysozym (Abcam, Ab36362), Chra (Santa Cruz, sc-13090), Acetylated lysin (cellesignalering, 9441L), SIRT1 (Abcam, ab12193), β-catenin (Sigma, A5441), L-FABP (Santa Cruz , sc-50380), PCNA (Santa Cruz, sc-56), HSP90 (BD Transduction Laboratories, 610.418), anti-FLAG (Sigma, F1804), tubulin (Santa Cruz, sc-5286), SPDEF for western blot (Sigma , AV32533), SPDEF for IHC blev venligst stillet til rådighed af Prof. J. Whitsett.

Subcellulær fraktionering

Cytoplasma og nukleoplasma fraktioner blev opnået fra

SIRT1

L2 /L2

og

SIRT1

int – /-

isoleret krypt. Cryptocoryner blev isoleret efter en offentliggjort protokol [21]. Single crypt-afledte celler blev til sidst vasket med iskoldt PBS og inkuberet i puffer A (10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT10 mM, 10 HEPES-KOH, pH 7,4), herunder en proteinaseinhibitor cocktail (Roche) for 5 min. Efter 50 slag i en Dounce homogenisator, blev cytoplasma fraktion opsamlet ved centrifugering (1,4 k x g i 5 min, 4 ° C). Pellets blev vasket to gange med puffer A. Kerner blev inkuberet i puffer B (150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4) indeholdende en proteinaseinhibitor cocktail i 30 minutter på is. Nukleoplasma blev opsamlet ved centrifugering (2 k x g i 5 min, 4 ° C). Proteiner blev kvantificeret ved hjælp af Lowry-metoden og behandlet til Western blot analyse.

GFP

+ celler analyse

Cryptocoryner fra

SIRT1

L2 /L2-

SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ert2

tarme blev isoleret som tidligere beskrevet (se

Subcellulær fraktionering

afsnit) [22]. Enkelte celler blev analyseret ved FACS for at påvise GFP

+ -celler.

Fraktionering af celler langs krypt-villus aksen Salg

Den sekventielle isolering af muse små intestinale epitelceller langs crypt- villus aksen blev udført som beskrevet tidligere [23] med få modifikationer. Kort beskrevet blev hele tyndtarmen (duodenum til terminal ileum) fjernet, skyllet og skåret i små stykker (2-5 mm) og inkuberet ved 37 ° C i 15 minutter i 15 ml puffer A (96 mM NaCl, 1,5 mM KCI, 27 mM Na-citrat, 8 mM KH

2PO

4, og 5,6 mM Na

2HPO

4, pH 7,3). det blev derefter inkuberet i 10 min i 15 ml buffer B (PBS plus 1,5 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol og 1 mg /ml bovint serumalbumin) i en ryster 37 ° C inkubator. Ved afslutningen af ​​15 minutters inkubation blev fritliggende enterocytter opsamlet (fraktion 1) og 15 ml frisk puffer B tilsat til vævet. Denne procedure blev gentaget yderligere fire gange, de trin, der varer 25, 25, 25 og 30 min, henholdsvis (Fraktioner 2, 3, 4 og 5), i alt 120 minutters inkubation tid. Ved afslutningen af ​​den sidste inkubationstid, indsamles celler fra hver af de 5 fraktioner blev høstet ved centrifugering ved 1500 rpm ved 4 ° C i 5 min. Cellepellets blev vasket to gange og lyseret i RIPA-buffer. Alkalisk phosphataseaktivitet blev analyseret ved alkalisk phosphatase assay kit (BioVision).

massespektrometrianalyse

Gel baner blev skåret i stykker og udsat for in-gel fordøjelse med endoproteinase Glu-C eller trypsin. Peptid fordøjelser blev resuspenderet og analyseret ved nano-LC-MS /MS under anvendelse af en Orbitrap Elite Massespektrometer (Thermo Fischer Scientific) koblet til en ultraperformance LC (UPLC) systemet (Thermo Fischer Scientific Ultimate 3000 RSLC). Dataanalyse blev udført med Proteome Discoverer (v. 1.3) og søgninger blev udført med Mascot og SEQUEST mod en mus database (UniProt frigive 2013_01). Data blev yderligere behandlet, inspiceret og visualiseret ved hjælp Stillads 3 software.

In situ

hybridisering

situ

sonder anvendt i denne undersøgelse i overensstemmelse med udtrykte sekvens tags eller fuldt kædede cDNA’er opnået fra Open Biosystems. Tallene for disse prober tiltrædelse er som følger: mus

Olfm4

BC141127 (9.055.739), mus

Defa4

BC134360 (40.134.597). For at sikre specificiteten af ​​sonderne, genereret vi både sense- og antisense-prober med

in vitro

transskription hjælp DIG RNA mærkning mix (Roche) i overensstemmelse med producentens anvisninger og offentliggjorte metoder [24]. ISH blev udført ved hjælp af den fuldautomatiske instrument Ventana XT (Roche). Kemikalier var fra Roche Diagnostics. Kort fortalt blev formalinfikserede paraffinindlejrede sektioner af-paraffinized og rehydreret og forbehandles ved enzymatisk fordøjelse (protease1, 4 min ved 37 ° C). Hybridisering blev udført tilsætning til hvert objektglas 50 eller 100 ng af det fortyndet i Ribohybe ved 65 ° C i 6 timer probe.

Bakteriedræbende assay

Bakteriedræbende assays blev udført som beskrevet [25] med få modifikationer. Kort fortalt blev tyndtarmen hos voksne mus skyllet med iskold PBS og segmenter inkuberet i 30 mM EDTA til eluering epitelceller. Totale proteiner fra epitelcellerne blev ekstraheret under anvendelse NP40 lysepuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 5 mM EDTA, 5% [vol /vol] glycerol, 1% [vol /vol] NP40) suppleret med komplet proteaseinhibitor. 100 ug af proteiner blev inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C i 10 mM iPIPES buffer indeholdende eksponentielt voksende

E.coli

K12 (ATCC, 10

6 CFU /ml). 20 pi prøve blev fortyndet og udpladet i LB-agar fast medium. Overlevende bakterier blev kvantificeret som CFU på pladerne efter inkubation natten over ved 37 ° C. Bakterier inkuberet i iPIPES uden tilsatte proteiner blev betragtet som kontroller.

Colitis og Colitis-associerede kolorektal cancer modeller

DSS-induceret colitis blev induceret som tidligere beskrevet [26]. Daglige ændringer i kropsvægt blev vurderet. Rektal blødning blev scoret på en skala fra 0 til 5, hvilket indikerer ingen (0) eller meget alvorlig (5) blødning fra endetarmen. Ilea og koloner var snap-frosne eller fikseret med 4% Forma-Fixx (Thermo videnskabelig) og indlejret i paraffin.

In vivo

intestinal permeabilitet blev undersøgt i mus som beskrevet [27]. Colitis-induceret kolorektal cancer (AOM /DSS model) blev induceret som beskrevet tidligere [28]. Efter aflivning blev muse koloner åbnet på langs og efter 2 timer fiksering i 4% Formel-Fixx, kortvarigt farvet med Coomassie Blue for at visualisere tumorer. Tumorer blev talt i en blindet måde af en patolog. Tumorer størrelse blev analyseret ved gauge. Små stykker af terminal ILEA og proksimale koloner var snap-frosne og resten fikseret med 4% Forma-Fixx (Thermo videnskabelig) og indlejret i paraffin.

Statistisk analyse

Data blev kontrolleret med Shapiro-Wilk test for normalitet i R før udførelse betydning tests. Variabler med en W værdi ≥0.80 blev betragtet som tilnærmelsesvis normalfordelt. To variable sammenligninger blev beregnet ved hjælp af Welch to-tailed

t

-test. For multiple sammenligninger blev Bartlett test udføres for at kontrollere for lige varians (p 0,10) og derefter envejs ANOVA blev udført med Bonferroni post-hoc test. Variabler med en Shapiro-Wilk W værdi 0,80 blev betragtet som ikke-normal og sammenligninger blev beregnet ved anvendelse af Wilcoxon-test. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til overlevelsesanalyse i orme. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM, og for alle betydning sammenligninger,

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

* p 0,05;

** p 0,01;

*** p 0,001. Denne undersøgelse havde en sonderende karakter, og der var ingen på forhånd fastsat effekt størrelse. Prøven størrelse blev valgt på grundlag af undersøgelsen gennemførlighed og potentiel statistisk styrke. Prøve størrelser er i overensstemmelse med dem, der rapporteres i lignende undersøgelser. Statistisk analyse for tarmen mikrobiota analyse er rapporteret i supplerende Information.

Resultater

SIRT1

sletning øger anti-mikrobiel respons i pattedyr og nematoder

Vi først bestemmes lokalisering af SIRT1 protein langs villus /krypt akse. Da SIRT1 synes højt beriget i tyndtarmen krypter (Figur S1A), vi opdrættet villin-Cre transgene mus med mus, hvor exon 5-7 af

SIRT1

gen blev flankeret af loxP-sites (

SIRT1

L2 /L2

) til at generere tarm-specifikke

SIRT1

knockout-mus (

SIRT1

int – /-

) (Figur S1B-C). I modsætning til en tidligere rapporteret sletning af

SIRT1

exon 4 [29], ikke afkortede og potentielt aktive SIRT1 fragmenter blev påvist i

SIRT1

int – /-

mus (Figur S1c).

SIRT1

INT – /- Restaurant tarme viste en betydelig stigning i antallet af Paneth (lysozym

+ og Defa4

+) og bægeret (PAS

+), men ikke af enteroendokrine (Chra

+) celler (figur 1A, figur S1D). Derfor mRNA niveauer af Paneth (

Lys, Crypt1, Crypt4, DEFA-R’er

) og bæger (

Klf4, MUC2

) cellemarkører, samt lysozym protein overflod og

Defa4

mRNA detekteret gennem

in situ

hybridisering blev induceret i de proximale og distale tarm

SIRT1

int – /-

mus (figur 1B-C, figur S1D-E ).

A, Repræsentative billeder af Paneth (Lysozym

+ celler), bæger (Periodisk syre-Shiff

+ celler), og enteroendokrin (Chromogranin A

+ celler) cellefarvning. (N = 3 mus, 5-10 felt pr mus, 50-100 krypt /villi per felt). Bar = 50 um. B-C, mRNA og protein niveauer af Paneth (

Lys, MMP7, Crypt1, Crypt4, DEFA-R’er

) og bæger (

Klf4, MUC2

) markører er steget i den proksimale og distale tyndtarmen af ​​

SIRT1

int – /-

mus (N = 6-8). For RTqPCR analyse,

rps12

blev anvendt som reference gen. p-actin blev anvendt som ladningskontrol i western blot. D, Forøget ekspression af gener, der er involveret i patogen forsvar i

sir-2,1 Hotel (

ok434

)

C. elegans

mutant (N = 6; hver N: en enkelt population af ~500 orme).

Act1

og

Y45

blev brugt som reference. E,

Sir-2,1

siRNA inducerer

lys-1

og

lys-7

drevet GFP udtryk i

lys-1 :: GFP

Lys-7 :: GFP

reporter orme. I samme figur et repræsentativt billede af

lys-7 :: GFP

før og efter

sir-2.1

siRNA vises (DIC, differential interferens kontrast). Resultater er udtrykt som gennemsnit ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

Vi næste vurderet, om

SIRT1

er korreleret til de der er involveret i anti-bakteriel forsvar gener ved hjælp af BXD mus genetiske henvisning befolkning (www.genenetwork. org) [30]. Da der ikke foreligger tarm genekspression data, vi analyserede hæmatopoietiske celler, som er en del af det arsenal af celler, der beskytter mod patogener. I tråd med vores observationer,

SIRT1

udtryk korrelerer negativt med ekspression af flere defensin-relaterede gener (figur S1F).

For at teste, om sammenhængen mellem

SIRT1

anti-bakteriel forsvars evolutionære bevaret, vi brugte

C. elegans

. Bemærkelsesværdigt, ekspressionen af ​​en lang række gener involveret i antimikrobiel forsvar (

LYZ-1, LYZ-7, LYZ-8

) [31], samt den af ​​gener induceret af specifikke patogener ( F01D5.5, F56D6.2, C17H12.8, C29F3.7, K08D8.5) [32] blev forbedret i

sir-2.1

[33] mutant orm (Figur 1D). Desuden i

lys-1 :: GFP

og

Lys-7 :: GFP

reporter stammer [31], s

ir-2.1

siRNA betydeligt inducerede både

lys-1

– og

lys-7

-afhængige GFP udtryk (figur 1E). Disse data dermed viser, at effekten af ​​

SIRT1

i anti-mikrobielle reaktion er evolutionært bevaret fra pattedyr til orme.

Intestinal

SIRT1

sletning virkninger på tarmen mikrobiota

i betragtning af den grundlæggende rolle, som Paneth og bæger celler spiller i beskyttelsen af ​​pattedyr gut fra afvigende bakteriel kolonisering, vi næste analyseret konsekvenserne af en

SIRT1

sletning på tarmen mikrobiota.

SIRT1

int – /-

tarme ikke kun have en større coecum (figur 2A), tegn på en modificeret microbiome [34], de havde også en højere bakteriedræbende kapacitet (figur 2B). Anvendelse af DNA ekstraheret fra enten intraluminale coecum indhold eller colon væv, vi amplificerede V3-regionen i det bakterielle 16S rRNA-genet. Efter fjernelse af lav kvalitet læser og alle singleton operationelle Taxonomiske Units (Otus) (tabel S2 i File S1), 98% af den læser faldt i Core Målbar microbiome (CMM-se metoder). Den mikrobielle samfund var domineret af 4 phyla,

Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, og Verrucomicrobia

(Figur 2C) [35]. At kortlægge de mikrobielle samfund sammensætning og struktur på tværs af

SIRT1

mutation vi brugte en OTU-baserede metode. I netværksbaserede analyser, coecum mikrobielle samfund af

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus fremhævet community forskelle mellem genotyper (figur 2D), en observation understøttes yderligere af Principal koordinater Analysis (PCA, figur 2E). Indikator mikrobielle arter, der bidrager til lokalsamfundet forskelle mellem

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /- iBooked.dk mus blev identificeret og Otus vist i figur 2F og tabel S3 i fil S1. Interessant, et flertal af beriget Otus i

SIRT1

int – /- iBooked.dk mus var af slægten

Barnesiella

,

Bacteroides

, og

Prevotella

(phylum

Bacteroidetes

), der findes i den normale menneskelige og mus tarmen, som er især faldet i IBD [36], [37]. I modsætning hertil slægten

Clostridium

(phylum

Firmicutes

) blev udvidet i

SIRT1

L2 /L2

mus (figur 2F og tabel S3 i File S1). Disse resultater viser, at tarm

SIRT1

sletning og de deraf følgende ændringer i Paneth og slimceller ændre tarmens microbiome.

A, repræsentant billede, der viser en betydelig stigning i coecum størrelse i

SIRT1

int – /-

mus. B, Bakteriedræbende kapacitet tyndtarmen (duodenum) i

SIRT1

int – /-

SIRT1

L2 /L2

mus blev analyseret ved kolonidannende enhed assay. Resultater er udtrykt som% af kontrol (ingen proteiner) (N = 7). C, Fordeling af mikrobiel phyla i colon væv og cecum indhold

af SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus. D, Netværk-baserede analyser af cecale bakterielle samfund i

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus. Hver stor cirkel repræsenterer et dyr og hver af de mindre prik repræsenterer en OTU;

SIRT1

L2 /L2

(blå) og

SIRT1

int – /-

(Red). E, Principal Koordinere Analysis (PCA) (PERMANOVA p = 0,012, og ANOSIM p = 0,007), der viser signifikant adskillelse af de mikrobielle samfund mellem

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus. F, Heatmap viser top 20 forskellige Otus mellem

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus. De overflod værdier blev log transformeret og standardiseret og plottet inden Matlab. * Angiver

Barnesiella

,

Bacteroides

, og

Prevotella

; ° angiver

Clostridum

slægten (se også tabel S3 i File S1). Resultater er udtrykt som gennemsnit ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

Intestinal

SIRT1

sletning beskytter mod colitis og colitis-induceret kolorektal cancer

På baggrund af disse sidste observationer, vi studerede virkningen af

SIRT1

om patogenesen af ​​både colitis og CAC.

SIRT1

int – /- iBooked.dk mus, der udsættes for dextransulfat natrium (DSS), viste en mildere colitis karakteriseret ved lavere vægttab, blødning score, en tendens til reduceret tarm permeabilitet, og en nedsat udtryk af inflammatoriske gener (figur S2A-D). Disse resultater opildnet os til at undersøge, hvordan

SIRT1

int – /-

mus reagerer på CAC. Mus blev derfor injiceret med AOM (azoxymethan) kræftfremkaldende før en efterfølgende udsættelse for tre cyklusser af DSS (figur 3A). Bemærkelsesværdigt, antallet og størrelsen af ​​tumorer i

SIRT1

int – /-

indvolde var mindre (figur 3A-B). Jo bedre sundhedstilstand

SIRT1

int – /-

mus blev yderligere understreget af længere kolon længde og hurtigere kropsvægt opsving efter den sidste DSS cyklus (figur 3C-D)

A-B, Skematisk repræsentation af AOM /DSS protokol (øverst til venstre panel) og repræsentativt billede af koloner fra

SIRT1

int – /- iBooked.dk og kontrol mus efter CAC induktion (Bar = 200 um) (nederst til venstre panel).

SIRT1

int – /- iBooked.dk mus viser signifikant færre tumorer (højre panel). B, Repræsentant billede af et kolon sektion fra en

SIRT1

int – /-

og kontrol mus efter CAC induktion (venstre paneler). Tumorstørrelse (højre panel). C, Colon længde på tidspunktet for offer (AOM /DSS). D, Procentdel af kropsvægten forandring. For AOM /DSS eksperiment anvendtes 8 mus for hver genotype. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. E-F, Principal Koordinere Analysis (PCA) af bakterielle sekvenser fra kolon væv udføres ved hjælp af uvægtede UniFrac afstand matrix. E,

SIRT1

int – /-

kolon væv før og efter AOM behandling (PERMANOVA p = 0,003, ANOSIM p = 0,016). F,

SIRT1

L2 /L2

colon væv med og uden AOM behandling (PERMANOVA p = 0,067, ANOSIM p = 0,038). G-H, Most statistisk signifikant Otus før og efter AOM i både

SIRT1

L2 /L2

(G), og

SIRT1

int – /-

(H), colonvæv; * Angiver

Helicobacter

Desulfovibrio

(se også tabel S4 i File S1). Jeg, PCA af bakterielle sekvenser fra colon væv efter AOM (PERMANOVA p = 0,767, ANOSIM p = 0,167).

Analyse af den mikrobielle samfund efter DSS /AOM eksponering afslørede væsentlige ændringer i

SIRT1

int – /- iBooked.dk mus (figur 3E), mens ændringen var mindre i

SIRT1

L2 /L2

mus (Figur 3F). Indikator mikrobielle arter, før og efter DSS /AOM, blev identificeret (figur 3G-H og tabel S4 i File S1). Notatet Otus tilhører slægten

Helicobacter

Desulfovibrio

kun blev forøget efter DSS /AOM i

SIRT1

L2 /L2

mus (figur 3G og Tabel S4 i File S1). Interessant, selvom den rolle,

Helicobacter

i colorektal cancer forbliver kontroversiel [38],

Desulfovibrio

anses for at tage del i patogenesen af ​​colitis ulcerosa og Crohns sygdom [39]. Mikrobielle samfund i

SIRT1

L2 /L2

SIRT1

int – /-

mus efter DSS /AOM behandling var ikke signifikant forskellige (figur 3I). Alt i alt, vi hypotesen, at ændringer i det generelle mikrobielle samfund under normale forhold (Figur 2), samt i specifikke slægter efter DSS /AOM, kunne bestemme forskellige modtagelighed af de to genotyper til colitis og CAC.

Hyper-acetyleret SPDEF drev Paneth og pokalen celle modning på tarm-specifikke

SIRT1

sletning

for at forstå de molekylære forandringer bag disse prominente fænotyper, vi udforskede forskellige mulige veje, der bidrager til Paneth og bæger celle udvikling og modning. Da de intestinale celletyper skelne fra tarm stamceller (ISC) [3], vi først vurderet, om

SIRT1

sletning kunne påvirke den ISC befolkning. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Bar = 50 um. Bar = 50 um.