PLoS ONE: Øget Niveauer af NF-kB-afhængige Markers i Cancer-associerede dyb venøs Thrombosis

Abstrakt

Flere undersøgelser fremhæve den rolle af inflammatoriske markører i trombose samt i kræft. Men deres kombinerede rolle i cancer-associeret dyb venetrombose (DVT) og de molekylære mekanismer, der er involveret i dens patofysiologi, behov yderligere undersøgelser. I den foreliggende undersøgelse, C-reaktivt protein, interleukin-6 (IL-6), tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1β), matrixmetalloproteaser-9 (MMP-9), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), vævsfaktor (TF), fibrinogen og opløseligt P-selectin, blev analyseret i plasma og i monocyt prøver fra 385 kræftpatienter, hvoraf 64 blev samtidig påvirket af DVT (+). Alle disse markører var højere i kræft patienter DVT + end i dem DVT-. Derfor var signifikant højere NF-kB-aktivitet observeret i kræft patienter DVT + end DVT-. Signifikant korrelation mellem data opnået i plasma og monocyt prøver blev observeret. NF-kB hæmning var forbundet med en nedsat mængde alle molekyler i både kræft DVT + og DVT-. For yderligere at demonstrere involveringen af ​​NF-KB-aktivering af de ovennævnte molekyler, behandlede vi monocyt afledt fra raske donorer med en pulje af sera fra cancerpatienter med og uden DVT. Disse sæt af eksperimenter yderligere foreslå den betydelige rolle, som nogle molekyler, der reguleres af NF-kB spillet, og påvises hos kræftpatienter med DVT. Vore data understøtter den opfattelse, at NF-kB kan betragtes som et terapeutisk mål for kræftpatienter, især dem kompliceret af DVT. Behandling med NF-kB-hæmmere kan udgøre en mulig strategi for at forebygge eller reducere risikoen for DVT hos kræftpatienter

Henvisning:. Malaponte G, Signorelli SS, Bevelacqua V, Polesel J, Taborelli M, Guarneri C, et al. (2015) forhøjede niveauer af NF-kB-afhængige Markers i Cancer-associerede dyb venøs trombose. PLoS ONE 10 (7): e0132496. doi: 10,1371 /journal.pone.0132496

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Modtaget: 14. marts 2015; Accepteret: 15 Juni 2015; Udgivet: 20 Jul 2015

Copyright: © 2015 Malaponte et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er frit tilgængelige i papiret og i støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den relative risiko for at udvikle dyb venetrombose (DVT) er cirka syv gange højere hos patienter med cancer [1,2] tyder en tovejs sammenhæng mellem trombose og betændelse i kræft. Kemoterapi er en af ​​de vigtigste risikofaktorer for øget risiko for DVT [3,4]. Trombose og cancer er forbundet af talrige patofysiologiske mekanismer, der generelt relateret til værtens respons på cancer. Disse mekanismer omfatter aktivering af koagulationssystemet og fibrinolytiske systemer, akut fase reaktion, inflammation og cytokinproduktion [5]. Den systemiske aktivering af koagulation, der forekommer i malignitet er velkendt og er blevet beskrevet under navnet Trousseau syndrom [6,7]. Systemisk inflammation er en potent prothrombotic stimulus fører til en opregulering af prokoagulationsfaktorer, nedregulering af antikoagulanter og hæmning af fibrinolytiske aktivitet [8,9]. Kronisk inflammation er ofte forbundet med øget risiko for kræft [10,11]. Rudolf Virchow viste tilstedeværelsen af ​​leukocytter i tumorer og foreslog, at tumorer opstår på steder med kronisk inflammation, og at inflammatoriske mediatorer, ved at øge celleproliferation, kan tjene som tumorpromotorer [12]. Inflammatoriske celler, cytokiner i maligne tumorer påvirker stromale mikromiljø, tyder på, at betændelse og kræft kan være forbundet gennem den angiogene proces [13-15]. Under inflammation, angiogenese ofte er sammenfaldende med infiltration af inflammatoriske celler, såsom neutrofiler, monocytter /makrofager, som udskiller cytokiner og vækstfaktorer [13,16,17]. Det blev vist, at mange mediatorer spiller en kritisk rolle i inflammation, cancer og trombose, såsom C-reaktivt protein, interleukin-6 (IL-6) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β ) (markører for inflammation), matrix-metalloproteaser-9 (MMP-9), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) (reflekterende angiogenese), vævsfaktor (TF) og fibrinogen (koagulationsmarkører) og opløselig P-selectin (mærkning blodpladeaktivering) . Inflammatoriske cytokiner opregulere forskellige angiogene faktorer, såsom VEGF og MMP-9, i vaskulære endotelceller, cancerceller, og monocytter /makrofager [18-35]. Monocytter deltage i de patologiske processer i inflammation og trombose gennem deres evne til at syntetisere TF og udtrykke P-selectin ved stimulering [36-38]. Vævsfaktor (TF), som er den primære cellulære initiator af blodkoagulering, bidrager til det tumor-relaterede patologiske processer, såsom hyperkoagulabilitet, tumorvækst, angiogenese og metastase [39-40]. Interessant nok alle disse molekyler er reguleret af NF-KB [41,42]. Dette er en inducerbar transkriptionsfaktor styres af signal aktiveringskaskader. NF-kB regulerer en række gener, der er involveret i inflammatoriske responser, cellecyklusprogression, inhibering af apoptose og celleadhæsion, hvilket vil fremme tumorangiogenese, carcinogenese og cancer progression. Forebyggelse og behandling af DVT hos kræftpatienter kan påvirke patientens behandling, prognose, og livskvalitet betydeligt. Der er derfor et behov for at identificere hidtil ukendte biomolekylære markører, der kan genkende cancerpatienter med høj risiko for DVT. Selv om flere undersøgelser undersøgt rollen som forskellige biomarkører og /eller cytokiner i cancer og /eller trombose, har ingen tidligere studier analyseret helt disse NF-kB-regulerede markører, som igen regulerer NF-kB selv hos kræftpatienter med og uden thrombose. Identifikationen af ​​disse markører kan anerkende NF-kB som en tiltalende mål for terapeutisk intervention.

I den foreliggende undersøgelse en brøkdel af NF-kB-regulerede markører er blevet målt i perifert blod fra cancerpatienter med og uden DVT . Endvidere er virkningerne af dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ), en NF-kB-inhibitor [43,44], blev vurderet til at påvise den direkte rolle NF-kB-regulerede markører i trombose udvikling blandt kræftpatienter. Endvidere kan identificere biomolekylære markører for DVT i kræftpatienter understøtte betydningen af ​​farmakologisk tromboseprofylakse.

Metoder

studiepopulation

Perifere blodprøver fra tre faggrupper var indsamlet i de sidste 10 år ved Institut for Bio-medicinske Sciences, University of Catania, Catania, Italien. Disse grupper omfattede: 64 kræftpatienter med samtidig DVT (DVT +) (gennemsnitsalder 64 ± 10 år); 321 kræftpatienter uden tidligere DVT (DVT-) (gennemsnitsalder 62 ± 9 år); 100 raske kontrolpersoner (gennemsnitsalder 61 ± 12 år), modsvares af køn og alder (tabel 1). Patienterne blev diagnosticeret som ramt af DVT baseret på ingen komprimering af en dyb vene af underekstremiteterne ved doppler-probe og /eller ved tilstedeværelsen af ​​den ekkogene mønster i en dybe vener i underekstremiteterne. DVT patienter blev rekrutteret på tidspunktet for den DVT forekomst. Perifere blodprøver fra disse patienter blev indhentet før antagelsen af ​​et specifikt antitrombotisk lægemiddel. Detaljerede oplysninger om undersøgelsen blev givet til patienterne. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke før indskrivning. Vores undersøgelse blev godkendt af University of Catania etiske komité. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Alle personer i dette håndskrift har givet skriftligt informeret samtykke (som skitseret i PLoS samtykkeerklæring) at deltage i denne undersøgelse. Patienter behandlet med anti-inflammatoriske lægemidler, statiner og anticancerforbindelser, såsom, bevacizubam, thalidomid, lenalidomid og /eller strålebehandling blev udelukket. Andre udelukkelseskriterier inkluderet: BMI 35 kg /m

2, svær systemisk depression, diabetes, dyslipidæmi, hypertension, kroniske inflammatoriske sygdomme, hjertesvigt på forskellige trin, mild eller alvorlig nyresvigt (kreatinin ≥ 2,0 mg /dl), pancytopeni og nyere kirurgiske indgreb ( ≤ 3 måneder). Venøse blodprøver blev opsamlet mindst efter 3 måneder af sidste anticancer behandling for både kræft patienter DVT + og DVT-

Forkortelser:. DVT, dyb venetrombose; BMI, body mass index.

Blodtapningsprocedurerne og laboratorie

Blod blev opsamlet fra hver patient og raske kontrolpersoner trukket i til pyrogenfrie blodtagningsglas med og uden tilsætningsstoffer. Citreret blodpladefattigt plasma blev fremstillet under anvendelse af to centrifuge trin: 5 min ved 4000 olm og 10 minutter ved 11000 rpm Flere portioner af serum og plasma blev opbevaret ved-80 ° C. Blodprøver blev anvendt til de følgende analyser: 1) CRP, fibrinogen, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF, TF-antigen og SP-selectin plasmaniveauer; 2) monocytter isolation. Plasma fibrinogen niveauer og høj følsomhed C-reaktivt protein blev målt med standard teknikker, der anvendes i den centrale laboratorium Catania Universitetshospital. IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF og SP-selectin blev målt ved enzym-bundne immunosorbent assays (ELISA’er; R thiazolylblåt) og dimethylsulfoxid (DMSO) blev erhvervet fra Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Iscoves medium og Polymyxin B fra Gibco, Life Technologies Inc (Milano, Italien).

DHMEQ (dehydroxymethylepoxyquinomicin), syntetiseret som beskrevet tidligere, [43] blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration på 10 ug /ml og opbevaret ved 20 ° C. Denne stamopløsning blev fortyndet i dyrkningsmedium til en slutkoncentration på 0,1%. Agenter. DHMEQ blev venligst stillet til rådighed af Dr. Kazuo Umezawa, Institut for Anvendt Kemi, Det Naturvidenskabelige Fakultet og Teknologi, Keio Universitet, Yokohama, Japan.

Isolering af humane monocytter

Perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev isoleret fra citratblod af kræft patienter DVT + og DVT- og raske kontrolpersoner af Ficoll-Paque. Til isolering af monocytter, blev PBMC anbringes i 2 timer i kultur plade, og de ikke-adhærente celler blev fjernet med tre skift af varm PBS. Rene monocytter blev derefter positivt udvalgt af anti-CD14-overtrukne magnetiske mikroperler (Mini MACS adskillelse kolonne; Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) ved at følge producentens instruktioner. Monocyt renhed var 98%, som bedømt ved flowcytometri (data ikke vist). Cellerne blev samlet og resuspenderet i en endelig koncentration på 1×10

6 celler /ml i en fastfrysning medium bestående af 30% autologt citratplasma, 60% Iscoves og 10% DMSO. Næste cellerne blev frosset i portioner på 1 ml i sterile kryohætteglas (Greiner, Tyskland) under anvendelse af en standard kontrolleret frysning procedure og derefter opbevaret i flydende nitrogen.

Behandling og dyrkning af humane monocytter Salg

Efter optøning ved stuetemperatur, de kryopræserverede monocytter havde en levedygtighed på 85%, som vist ved trypanblåteksklusion. Humane monocytter blev analyseret for NF-KB-aktivering, til cytokiner produktion og for TF-aktivitet-assay (se efterfølgende tekst). Kort fortalt, monocytter (5 x10

5 /ml) blev høstet, vasket og podet på brønde i RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS, L-glutamin (2 mM), penicillin (100 IE /ml), streptomycin (100 ug /ml) og forbehandlet med DHMEQ (10 ug /mL) i 2 timer og hvorefter inkuberet i 24 timer. Derefter blev cellekultursupernatanter opsamlet til kvantificering af cytokin proteinniveau med et enzym-koblet immunosorbent assay (ELISA). Endotoksinkontaminering af cellekulturer blev rutinemæssigt udelukket med det kromogene limulus amebocytlysat-assay (Sigma). Endvidere i alle cellekulturer blev tilsat 10 ug /ml polymyxin B til at neutralisere enhver potentiel LPS kontaminering.

ELISA for aktiv NF-kB p65 subunit

Til måling NF-kB p65 subunit aktivering , kerneekstrakter blev fremstillet fra 5×10

5 monocytter, forbehandlede og ikke med DHMEQ (10 ug /mL) i 2 timer og hvorefter stimuleret med 100 ng /ml LPS for den ønskede tidsperiode, under anvendelse af et kerneekstrakt Kit ( aktiv Motif, Rixensart, Belgien) ifølge fabrikantens protokol. Niveauer af koncentrationer nukleare p65 blev bestemt ved en følsom ELISA-assay (TRANS-AM, Aktiv Motiv, Rixensart, Belgien).

Påvisning af TF-aktivitet i monocytter ved et kromogent assay

I cellelysater aktiviteten af ​​TF blev målt ved actichrome1 TF-aktivitet kit (American diagnostiske, Pfungstadt, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Kort om. prøver blev coinkuberet med faktor VII og Spectrozyme fVIIa. TF-FVIIa komplekse spalter Spectrozyme fVIIa som en yderst specifik kromogent substrat frigive en paranitroanilin-chromophor med en specifik ændring af absorptionen ved 405 nm. Resultater udtrykkes i picomol per liter (pM) af peptidyl aktivitet af lipideret TF kløve Spectrozyme fVIIa komplekset.

Serum-afhængig aktivering af cytokiner og NF-kB i monocytter Salg

Monocytter (5×10

5) fra 25 raske donorer blev dyrket i 20 timer i medium (RPMI 1640) suppleret med enten 40% serum fra 64 kræftpatienter DVT + og 257 DVT- med de højeste cytokiner plasmakoncentrationer (≥ 75

percentil) eller 40% serum fra 100 raske donorer med de laveste cytokiner værdier (≤ 25

percentil). Til forarbejdning af serum, blev 80 pi af serum fra hver kræftpatient DVT + og DVT- og fra hver rask donor tilsættes til monocyt dyrkningsmediet umiddelbart efter optøning. Cellerne blev behandlet med DHMEQ (10 ug /ml) i 2 timer, og efter hvilken stimuleret med 100 ng /ml LPS i den ønskede tidsperiode. Behandling af monocytter med LPS blev anvendt som positiv kontrol. I LPS eksperimenter blev tilsat nogen polymixin B. Efter inkubation blev cellekultursupernatanter indsamles også til kvantificering af cytokin proteinniveau og NF-KB-aktivering ved hjælp af ELISA.

MTT assay

Virkninger af DHMEQ på cellelevedygtigheden blev analyseret ved 3- ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetranatrium (MTT) metoden [45]. Monocytterne (3×10

5) blev podet i 96-brønds plader i 48 timer for cytostatisk DHMEQ. Serielle fortyndinger af DHMEQ (ved 2 ug /ml, 5 ug /ml, 10 ug /ml) blev dannet og tilsat til cellerne. Efter inkubering med DHMEQ eller DMSO ved de angivne koncentrationer og tidspunkter. Celler behandlet ved MTT-opløsning (1 mg /ml) i 4 timer blev målt ved en mikropladelæser (Bio-Rad, Richmond, CA) ved en referencebølgelængde på 630 nm og en test bølgelængde på 570 nm. Cellelevedygtigheden blev udtrykt som en procentdel af de DMSO-behandlede kontrolprøver.

Statistisk analyse

I kontinuerte variable, forskel i den gennemsnitlige mellem studiegrupper blev evalueret gennem en analyse af varians (ANOVA, i tilfælde af tre grupper) eller t-test (to grupper). For diskrete variable, blev forskellen i fordelingen på tværs af studiekredse evalueret gennem testen χ

2 test. Sammenhængen mellem kontinuerlige variabler blev evalueret gennem Spearman rank korrelationskoefficient

r

.

Resultater

Baseline karakteristika raske kontroller og kræft patienter med og uden DVT er vist i tabel 1. Ingen signifikante forskelle blev observeret blandt grupper med hensyn til alder, køn, nuværende rygning, og BMI. Hyppigheden af ​​lokaliserede cancere var ens blandt kræftpatienter med og uden DVT, samt fordelingen af ​​cancertype /site (tabel 1).

Biomarker plasmaniveauer af inflammation, angiogenese og koagulation i cancer patienter DVT + og DVT-

Mean plasmaniveauer af forskellige biomarkører, herunder inflammation, angiogenese og koagulation, analyseret i kontrolgruppen og hos kræftpatienter med og uden DVT er rapporteret i tabel 2. i forhold til kontrolgruppen, højere plasma niveauer af CRP, fibrinogen, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, blev VEGF, TF-antigen, og sP-selectin observeret hos cancerpatienter med og uden DVT (P 0,01). Som forventet, koncentrationen af ​​alle markører i DVT + gruppen var signifikant højere end i DVT- (p 0,01) med den eneste undtagelse af fibrinogen (p = 0,35). Korrelation af alle markører med hinanden er rapporteret i (S1 tabel). Positive korrelationer (| r | 0,45) blandt CRP, IL-6, TNF-a, IL-1, MMP-9, VEGF og TF antigen blev fundet i begge grupper af kræftpatienter, hvorimod fibrinogen korrelerede kun DVT + gruppe. Ingen sammenhæng mellem markører blev observeret hos raske kontroller (S1 tabel)

Forkortelser:. DVT, dyb venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF α, tumornekrosefaktor-α; IL-1β, interleukin-1β; CRP, C-reaktivt protein; MMP-9, matrixmetalloproteinase-9; VEGF, vaskulær endotelvækstfaktor; TF, tissue factor; opløseligt P-selectin (SP-selectin). Væsentlige forskelle mellem inflammatoriske, angiogene og koagulationsmarkører var tydelige hos kræftpatienter med og uden DVT forhold til kontrolgruppen med yderligere stigninger i patienter DVT cancer. P-værdi er givet ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA test, i tilfælde af tre grupper) eller t-test (to grupper).

Cytokiner og MMP-9-sekretion i humane monocytter

udskillelsen af ​​disse markører analyseret i monocytter supernatant viste samme tendens som i plasma. Spontan produktion af cytokiner, såsom IL-6, TNF-α, IL-1β og VEGF var signifikant højere i begge grupper af kræftpatienter med og uden DVT end dem fra raske kontroller (p 0,0001) (fig 1). Sammenlignet med DVT- kræftpatienter, DVT + viste en øget gange ændring på 1,28 (95% CI: 1,20-1,37; p 0,0001), 1,34 (95% CI: 1,23-1,46; p 0,0001), 1,41 (95% CI: 1,30-1,54; p 0,0001), og 1,61 (95% CI: 1,45-1,78; p 0,0001) for IL-6, TNF-α, IL-1β, og VEGF hhv. Foruden cytokiner, også MMP-9 produktion og TF-aktivitet var højere i DVT + cancerpatienter end hos dem, DVT- og i raske kontroller (middelværdi ± SD, 103 ± 23, 73 ± 24, 8,8 ± 4, for MMP-9 og middelværdi ± standardafvigelse, 35,6 ± 6,4, 28 ± 5, 3,3 ± 0,7 for TF-aktivitet, henholdsvis). Som forventet stærke korrelationer mellem niveauer af IL-6, TNF-α, IL-1β, VEGF, MMP-9 og TF i plasma fra cancerpatienter DVT + og DVT- og dem frigivet fra monocytter af de samme patienter blev observeret (Tabel 3 ).

Niveauer af IL-6, TNF-α, IL-1β, og VEGF blev målt i supernatanter af rensede monocytter fra cancerpatienter med og uden DVT af en følsom enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA). Resultaterne er vist som middel ± SD.

DVT, dyb venetrombose. En positiv stærk korrelation mellem plasma cytokiner, angiogene og koagulationsmarkører og sekretion

in vitro

af de samme markører i to grupper af kræftpatienter med og uden DVT.

Effekt af DHMEQ på NF-kB p65 subunit aktivitet i monocytter Salg

Aktivering af NF-kB p65 subunit i ikke-stimulerede monocytter, fra kræftpatienter DVT + og DVT- og fra raske kontrol blev analyseret ved en følsom ELISA-assay. Dette assay har fordelen af ​​at være 10 gange mere følsom end elektroforese mobility shift assay (EMSA) og tillader større fleksibilitet i den eksperimentelle trin. Som vist i figur 2, NF-kB p65 subunit aktivitet i monocytter varierede i alle undersøgte grupper. Højere NF-kB p65 subunit aktivitet blev observeret hos cancerpatienter DVT + og DVT- end hos raske kontroller (p 0,0001). Der blev også påvist betydelige forskelle i NF-kB p65 aktivitet mellem kræftpatienter DVT + og DVT- (p 0,0001). Det blev allerede vist, at NF-kB regulerer flere molekyler, herunder dem der er analyseret i den foreliggende undersøgelse [41,42]. Således er alle disse markører positivt korreleret med NF-kB-aktivitet (tabel 4). Identifikationen af ​​disse markører kan anerkende NF-kB som et attraktivt mål for terapeutisk intervention. Derfor troede vi at hæmme NF-kB ved DHMEQ, en kendt NF-kB-hæmmer [46,47]. Virkningen af ​​DHMEQ, i en dosis på 10 ug /ml, på NF-kB p65 subunit aktivitet inhibering i monocytter fra de to grupper af kræftpatienter, blev undersøgt (figur 2). Kontrol eksperimenter med DMSO er medtaget (figur 2). Især DHMEQ var ikke effektive i monocytter fra raske kontroller på anden dosis og tid (S1 Fig). Selv DHMQ forårsagede reduktion af cellelevedygtighed af monocytter afledt fra kræftpatienter DVT + og DVT-, blev denne effekt ikke observeret i monocytter fra raske kontroller (S2 Fig).

Den aktiverede NF-kB p65 subunit var signifikant højere i kræft patienter DVT + og DVT- end hos raske kontroller (P 0,0001). (ANOVA test). NF-kB p65 subunit var signifikant højere i cancer patienter DVT + end i dem DVT- (P 0,001) (t-test). For at undersøge effekten af ​​DHMEQ blev monocytter behandlet med 10 ug /ml DHMEQ. Som kontrolforsøg blev DMSO anvendt i stedet for DHMEQ. Monocytter fra kræftpatienter DVT + var mere lydhøre over for DHMEQ end dem fra DVT-. Interessant nok ingen virkning af DHMEQ var der hos raske monocytter. Resultaterne er vist som de middelværdier ± SD. OD, optisk densitet; DVT, dyb venetrombose; DMSO, dimethylsulfoxid; . DHEMQ, dehydroxymethylepoxyquinomicin

Forkortelser: DVT, dyb venøs trombose. En positiv korrelation blev fundet mellem NF-kB p65 subunit aktivitet og alle molekyler i cancerpatienter med og uden DVT. blev anvendt Spearman Rank korrelationsanalyse.

Effekt af LPS og DHMEQ om nuklear faktor-kB p65 i monocytter

Som vist i figur 3, behandling af monocytter med LPS på 100 ng /mL stærkt aktiveret NF-kB p65 på 46%, 73% og 35% i løbet af den basale værdi i forhold til ikke-stimulerede celler i kræft patienter DVT +, DVT- og raske kontroller (p 0,0001). Præinkubering med DHMEQ, før LPS-stimulering, stærkt reduceret NF-kB p65 subunit aktivitet af 4,5-fold, 3-fold og 3,2 gange i cancer DVT + og DVT- og hos raske kontroller (p 0,0001), sammenlignet med LPS alene. For at styrke vores resultater på NF-kBp65 nedregulering af DHMEQ i LPS-aktiverede monocytter, blev mængden af ​​NF-kB p65 subunit aktivitet med nukleare ekstrakter fra de samme eksperimenter efterfølgende målt ved ELISA. Som forventet, behandling med DHMEQ i LPS-stimulerede monocyt inducerede formindskelse af NF-kB-aktivitet blandt de tre grupper analyseres (Fig 3).

Nukleare ekstrakter blev fremstillet ud fra monocytter, forbehandlet og ikke med DHMEQ (10 ug /ml) i 2 timer og hvorefter stimuleret med 100 ng /ml LPS i 24 h, under anvendelse af et kerneekstrakt Kit. Den stimulering af monocytter med LPS på 100 ng /mL fremkalde un betydelig stigning i den nukleare NF-kB p65 protein niveau i alle grupper eller kræftpatienter DVT +, DVT- og hos raske kontroller, sammenlignet med ikke-stimulerede celler, (P 0,0001). NF-kB p65 subunit var signifikant højere i cancer patienter DVT + end i dem DVT- (P 0,0001) (t-test). DVT, dyb venetrombose.

Effekter af DHMEQ på markører fra monocytter

DHMEQ behandling blev brugt til at vurdere, om NF-kB er direkte forbundet med udgivelsen af ​​alle markører, registreres ovenfor, fra monocytter for kræft patienter DVT + og DVT-. The Fig 4 viser, at behandling med DHMQ drastisk formindsker niveauerne af IL-6, TNF-alfa, IL-1 beta og VEGF i begge grupper af kræftpatienter sammenlignet med ubehandlede celler. blev observeret lignende tendens for MMP-9 og TF. I modsætning hertil blev der ikke observeret forskelle i kontrolgruppen, hvor konstitutiv NF-KB-aktivering var til stede.

Monocytter blev behandlet eller ikke med 10 ug /ml DHMEQ, hvorefter mængderne af interleukiner (IL) -6 , tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), IL-1β og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) secernerede blev målt ved enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA). Monocytter blev inkuberet i 24 timer. Behandlingen med DHMEQ inducerer reduktion af alle molekyler i begge grupper af kræftpatienter med og uden DVT sammenligning med ubehandlede celler (P 0,0001), (t-test). Resultaterne er vist som de middelværdier ± SD. DVT, dyb venetrombose;

Serum-afhængig aktivering af NF-KB i raske monocytter Salg

Som vist i figur 5, inkubationen af ​​sunde monocytter med poolede sera, fra kræft patienter DVT + eller DVT- med de højeste værdier af cytokiner, inducerede en signifikant stigning af NF-kB-aktivering sammenlignet med poolet sera, der stammer fra de raske kontrolpersoner med de laveste værdier af de samme cytokiner, (p 0,0001). Desuden blev en højere NF-KB-aktivering observeret i monocytter stimuleret med sera afledt af kræftpatienter DVT + sammenlignet med den stimuleres af sera afledt af DVT- (p 0,001) (figur 5). For yderligere at udelukke den mulighed, at nogle LPS kontaminering kan bidrage til NF-KB-aktivering, blev 10 ug /ml polymyxin B tilsat i alle cellekulturer for at neutralisere enhver potentiel LPS kontaminering. I stedet som positiv kontrol af NF-KB-aktivering, blev LPS overvejes. LPS-stimulerede kulturer inducerede en højere NF-kB-aktivitet statistisk signifikant sammenlignet med cancer afledt Sera-stimulerede kulturer (p 0,001), mens ingen signifikant forskel var tydelig mellem LPS-stimulerede kulturer og DVT cancer afledte sera- stimulerede kulturer. I LPS eksperimenter blev tilsat nogen polymixin B. NF-KB-aktivering, stimuleret med sera afledt af cancerpatienter med og uden DVT eller LPS, blev delvist blokeret af DHMEQ (10 ug /ml), når det tilsættes i begge kulturer og LPS-stimulerede kulturer.

Monocytter fra 25 raske kontroller blev bedømt for NF-kB-aktivering efter de var dyrket i 20 timer i medium suppleret med enten 40% serum fra tre grupper. Monocytter (5×10

5) fra 25 raske donorer blev dyrket i 20 timer i medium (RPMI 1640) suppleret med enten 40% serum afledt af 64 kræftpatienter DVT + og 257 DVT- med de højeste cytokiner plasmaniveauer ( 75. percentil ) eller 40% serum afledt fra 100 raske donorer med de laveste cytokiner værdier ( 25. percentil). Inkubationen af ​​sunde monocytter med samlede sera afledt af kræftpatienter DVT + (sCADVT +) eller DVT- (sCADVT-) inducerede en signifikant forøgelse af NF-kB-aktivitet sammenlignet med dem, der hidrører fra raske kontroller (HM) efter behandling med sera fra raske kontroller ( SH) (P 0,0001). En højere NF-kB p65 subunit aktivering blev observeret i monocytter stimuleret med sera fra cancerpatienter DVT + sammenlignet med den stimuleres af sera afledt af DVT- (P 0,001) (t-test). Ingen NF-kB p65 subunit aktivering blev observeret i monocytter stimuleret med sera stammer fra raske kontrolpersoner.

Serum-afhængig aktivering af cytokiner produktion hos raske monocytter

Ud over NF-kB aktivitet, vi undersøgt aktivering af cytokiner hos raske monocytter behandlet med samlede sera opnået fra kræftpatienter DVT + og DVT- og fra raske kontroller. Højere gennemsnitlige niveauer af IL-6, TNF-a, IL-1, VEGF, MMP-9 og TF blev udskilt fra sunde monocytter behandlet med seraene afledt af kræftpatienter DVT sammenlignet med dem fra DVT- (p 0,01). Tværtimod sunde monocyt behandlet med sera fra raske kontroller, viste ingen signifikante virkninger (tabel 5). Når raske monocytter blev inkuberet med sera afledt af patienter med og uden DVT i nærvær af DHMEQ, kraftigt cytokiner produktionen faldt i forhold til ubehandlede celler (p 0,0001). (Tabel 6)

HM, monocytter fra raske forsøgspersoner; SH, sera fra raske individer; LPS, lipopolysaccharid; sCaDVT-, serum fra kræftpatienter uden dyb venetrombose; sCADVT +, serum fra kræftpatienter med dyb venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF α, tumornekrosefaktor alfa; IL-1β, interleukin-1 beta; VEGF, vaskulær endotelvækstfaktor; MMP-9, matrixmetalloproteinase-9; TF, vævsfaktor. Alle p-værdier blev beregnet ved Wilcoxon Matched-Par Signed-Ranks Test

HM, monocytter fra raske forsøgspersoner.; SH, sera fra raske individer; LPS, lipopolysaccharid; sCaDVT-, serum fra kræftpatienter uden dyb venetrombose; sCADVT +, serum fra kræftpatienter med dyb venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF α, tumornekrosefaktor alfa; IL-1β, interleukin-1 beta; VEGF, vaskulær endotelvækstfaktor; MMP-9, matrixmetalloproteinase-9; TF, vævsfaktor. Alle p-værdier blev beregnet ved Wilcoxon Matched-Par Signed-Ranks Test.

Kontrol eksperimenter, udført med LPS, viste, at en bemærkelsesværdig betydelig forøgelse af alle markører produktion, sammenlignet med dem stimuleret med sera stammer fra cancerpatienter DVT- (p 0,0001). Som forventet blev der ikke observeret signifikante forskelle i produktionen af ​​alle markører mellem gruppe raske monocytter behandlet med LPS, og at behandling med sera stammer fra kræftpatienter DVT + (S2 tabel).

Diskussion

Patienter med kræft kan opleve komplikationer, herunder trombose, blødning, og dissemineret intravaskulær koagulation. Identifikationen af ​​nye terapeutiske mål hos kræftpatienter med høj risiko for DVT kan tilskynde yderligere beskyttelsesforanstaltninger undersøgelser for at forbedre forvaltningen af ​​disse patienter. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der analyserer flere NF-kB-afhængige markører hos cancerpatienter med og uden DVT.

Desuden blev proteinsekretion også testet for at finde ud af, om ændringerne i cytokin plasmaniveauer blev forbundet med ændringer i cytokiner produktion. Som forventet blev plasmaniveauerne af markører analyseres opreguleret i cancerpatienter med og uden DVT sammenlignet med raske kontroller, selv om de var statistisk højere i DVT +, med undtagelse af fibrinogen, der var ens i begge grupper. Cytokinerne målt i vore forsøg er i vid udstrækning involveret i opregulering af inflammatoriske reaktioner og dermed i talrige maligniteter. Når vi har undersøgt proteinets sekretion blev den samme plasma tendens også observeret i monocytter fra patienter.