PLoS ONE: Gain af ALK Gene Copy Number Kan Forudsige Manglende Benyt Anti-EGFR behandling hos patienter med fremskreden kolorektal cancer og RAS-RAF-PI3KCA Wild-Type Status

Abstrakt

Introduktion

Selvom

cetuximab og panitumumab viser øget

effekt for patienter med KRAS-nationale tilsynsmyndigheder-BRAF og PI3KCA vildtype metastatisk kolorektal cancer, primær resistens sker i en relevant delmængde af molekylært beriget befolkninger.

patienter og metoder

Vi evaluerede resultatet af 68 patienter med fremskreden kolorektal cancer og RAS, BRAF og PI3KCA status ifølge ALK gen status (disomic vs gevinst på ALK genkopital – defineret som middelværdien af ​​3 til 5 fusion signaler i ≥10% af cellerne). Alle konsekutive patienter fik cetuximab og irinotecan eller panitumumab alene for chemorefractory sygdom.

Resultater

Der blev ikke påvist ALK translokationer eller amplifikationer. ALK genkopiantallet gevinst blev fundet i 25 (37%) tumorer. Reaktion var signifikant højere hos patienter med disomic ALK i forhold til dem med gevinst på genkopital (70% vs. 32%, p = 0,0048). Ligeledes progressionsfri overlevelse var signifikant forskellig, når man sammenligner de to grupper (6,7 vs. 5,3 måneder; p = 0,045). En tendens blev observeret også for samlet overlevelse (18,5 vs. 15,6 måneder; p = 0,885).

Konklusion

Gain af ALK genkopital kunne repræsentere en negativ prognostisk faktor i mCRC og kan have en rolle i resistens over for anti-EGFR terapi

Henvisning:. Pietrantonio F, Maggi C, Di Bartolomeo M, Facciorusso MG, Perrone F, Testi a, et al. (2014) Gain af

ALK

Gene Copy Number Kan Forudsige Manglende Benyt Anti-EGFR behandling hos patienter med fremskreden kolorektal cancer og

RAS-RAF-PI3KCA

Wild-Type Status. PLoS ONE 9 (4): e92147. doi: 10,1371 /journal.pone.0092147

Redaktør: John Souglakos, University Hospital of Heraklion og Laboratoriet for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Grækenland

Modtaget: December 23, 2013; Accepteret: 18 februar 2014; Udgivet: April 1, 2014

Copyright: © 2014 Pietrantonio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af midler opnået gennem italienske lovgivning lov 12 november 2011 n. 183, der giver skattepligtige mulighed for at afsætte 0,5 procent andel af deres indkomst skat bidrag til en forskningsinstitution efter eget valg. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Behandling med anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) monoklonale antistoffer – cetuximab og panitumumab – forbedret resultatet af patienter med fremskreden KRAS vildtype kolorektal cancer (CRC) i kombination med første- eller anden-line fluoropyrimidin -baseret kemoterapi eller i fastsættelsen af ​​chemorefractory sygdom [1] -. [6]

Flere modstand biomarkører ud

KRAS

blev undersøgt for at forbedre udvælgelse patienter. Det blev tidligere vist, at svarprocenten på cetuximab nåede værdien af ​​41,2% for patienter med

KRAS

,

BRAF

,

De nationale tilsynsmyndigheder

og exon 20

PI3KCA

“firedobbelt vildtype” status [7]. Men selv i molekylært berigede populationer, er der stadig en relevant delmængde af ikke responderer [8]. Identifikationen af ​​yderligere modstand biomarkører er et udækket behandlingsbehov for anti-EGFR behandling personalisering i denne indstilling.

Anaplastisk lymfom kinase (ALK) er et medlem af insulinreceptorfamilien med tyrosinkinaseaktivitet, som kan aktivere signal transduktion ved ligandbinding, genamplifikation eller mutation [9]. Opdagelsen af ​​et nyt potentielt relevant onkogenisk begivenhed i lungekræft,

EML4-ALK

translokation, og udvikling af ALK-hæmmere med lovende resultater i prækliniske modeller og randomiserede kliniske forsøg giver begrundelsen for den omfattende karakterisering af

ALK

abnormiteter hos patienter med andre solide tumorer, såsom CRC [10], [11]. Ændringer af ALK kan interferere med den biologiske aktivitet af EGFR gennem krydstale af signalveje. Faktisk onkogen

ALK

kan aktivere uafhængigt nedstrøms veje herunder

PI3KCA

/Akt og

RAS-RAF-MAPK

, selv i tilstedeværelse af EGFR blokering [12].

Formålet med vores analyse var at vurdere betydningen af ​​gevinst på

ALK

genkopiantallet i form af svarprocenten, progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) i patienter behandlet med irinotecan og cetuximab eller panitumumab monoterapi for avanceret, chemorefractory CRC og vildtype

RAS-RAF-PI3KCA

status.

patienter og metoder

Patient befolkning

Sixty-otte konsekutive patienter med histologisk påvist metastaserende CRC med

KRAS

,

NTM

,

BRAF

,

PI3KCA

vildtype status blev prospektivt indsamlet 2007-2013 på “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” og blev berettiget til denne undersøgelse. Patienterne fik en kombination af cetuximab og irinotecan eller panitumumab efter klinisk tegn på resistens til standard kemoterapi herunder fluoropyrimidiner, oxaliplatin og irinotecan. Den Institutional Review Board of “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” godkendt denne undersøgelse og alle er underlagt underskrevet skriftligt informeret samtykke.

Mutationsanalyse af RAS-RAF-PI3KCA

formalin-fikseret paraffinindlejret tumorvæv blev gennemgået for kvalitet og tumor indhold. En væv, der indeholder mindst 80% af neoplastiske celler blev valgt for hvert tilfælde. Macrodissection af 7 um methylenblåt-farvede snit tillod adskillelse af neoplastiske og normale celler. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiamp FFPE DNA (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Mutationsanalyse af

KRAS

exoner 2, 3 og 4 blev udført som tidligere beskrevet [13], [14].

KRAS

exon 2 status blev yderligere bekræftet gennem en særlig mutant beriget polymerasekædereaktion (PCR), der er kendt for at være en mere følsom tilgang [15].

BRAF

(exon 15),

NTM

(exon 2 og 3) og

PI3KCA

(exon 9 og 20) mutationsanalyse blev udført ved hjælp af PCR ved hjælp af specifikke primere tidligere beskrevet [13], [15]. PCR-produkterne blev underkastet direkte sekventering under anvendelse af en ABI Prism 3500 DX Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og derefter bedømt ved hjælp af ChromasPro software.

ALK genkopital status

Tre til fire um tykke snit blev skåret fra paraffinblokke og monteret på positivt ladede objektglas og tørret i mindst 1 time ved 56 ° C. Vævssnit blev afparaffiniseret i xylen (3 gange hver på 10 minutter), hydreret med en ethanol-til-vand-serien (100% -85% -70%). Efterfølgende blev snittene forbehandlet i TE (Tris 5 mM-EDTA 1 mM, pH = 7) ved 96 ° i 15 minutter, skyllet i destilleret vand og enzymatisk fordøjet med pepsin 0,4% i 0,01 N HCI i 6 til 10 minutter ved 37 ° C, med overvågning af progressionen af ​​den enzymatiske nedbrydning ved anvendelse et fasekontrastmikroskop.

Objektglas blev derefter vasket i destilleret vand i to gange hver 5 minutter, dehydreret i 96% ethanol i 3 minutter, lufttørret. Efter påføring af proben (ALK FISH DNA Probe, Split signal Dako) af det område af interesse enhederne blev codenatured ved 85 ° C i 1 minut og derefter hybridiseret ved 37 ° C natten over under anvendelse af en Hybridizer (Dako). Den følgende dag blev dækglassene fjernet, og objektglas blev nedsænket i posthybridization opløsning 2XSSC /0,3% NP40 (73 ° C i 2 minutter) derefter i 2XSSC /0,1% NP40 (1 minut ved stuetemperatur) og endelig brifly skyllet i destilleret vand. Objektglassene blev derefter efterladt for at tørre i mørke ved stuetemperatur, og kerner blev modfarvet i Vectashild antifade opløsning med DAPI (4,6-diamino-2-phenyindole-2-hydroklorid) (Vector Laboratories, Inc. Burlingame CA).

et minimum af 60 ikke-overlappende kerner af invasive tumorceller blev scoret med Olympus epifluorescensmikroskop udstyret med en 100 × olie nedsænkning objektiv og 4,6-diamidino-2-phenylindole /Spectrum Grøn /Orange single og triple bandpass filtre. De to DNA-proben i ALK FISH DNA Probe, Split Signal, er designet til at hybridisere opstrøms og nedstrøms for breakpoint cluster region. Co-lokalisering af sonder resulterer i et gult signal, hvorimod translokation begivenheder i breakpoint klynge regionen vil opdele én signal i separat grøn (fluorescin) og rød (Texas Red) signaler. Kriterierne for ALK translokation positivitet var tilstedeværelsen af ​​opdelingen af ​​sonderne ind på lest 15% af cellerne.

Som kriterier for kopital afvigelser af

ALK

er ikke fastlagt, vi vilkårligt brugt følgende cut-offs tilpasset fra de fastlagte kriterier for

EGFR

og

HER-2

i ikke-småcellet lungekræft prøver [16], [17]. Ifølge Cappuzzo et al. [16], patienter kan klassificeres i seks FISH strata med stigende antal kopier af EGFR-genet pr celle ifølge frekvensen af ​​tumorceller med bestemt antal kopier af EGFR-genet. I vores undersøgelse, vedtog vi cut-offs til klassificering ALK genkopiantal ændringer som tidligere beskrevet for ikke-småcellet lungecancer [18]. Kort beskrevet gevinst på

ALK

genkopital (herunder både lav og høj genomisk gevinst) blev defineret som en middelværdi kopital på 3 til 5 fusion signaler i ≥10% af celler og amplifikation som tilstedeværelsen af ​​≥6 kopier af

ALK

per celle i ≥10% af analyserede celler. I de tilfælde, hvor der blev observeret klynger, rapporterede vi procentdelen af ​​celler med klynger og betragtes forstærkede sager med ≥10% af

ALK

klynger [18] (Figur 1).

Gain ALK GCN (herunder både lav og høj genomisk gevinst) blev defineret som en middelværdi på 3 til 5 fusion signaler i ≥10% af cellerne (figur til højre). Disomic celler er vist i figur til venstre.

Statistisk analyse

Beskrivende statistisk metode blev anvendt til at analysere resultaterne og kvalitative data blev sammenlignet ved chi-square test, som er relevant.

PFS blev defineret som tiden fra datoen for tilmelding til datoen for den første dokumenterede progressiv sygdom (PD) eller død for enhver årsag. OS blev beregnet ud fra datoen for tilmelding til datoen for død på grund af enhver årsag, eller censureret på datoen for sidste opfølgning for at leve patienter. Overlevelseskurver blev afbildet ved Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. For ordinale variabler, blev en log-rank test af trend anvendt. Data, analyserede var hjælp SPSS-version 16,0 til Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Resultaterne blev rapporteret med 95% konfidensintervaller (CI). Alle de statistiske test blev udført på to-sidet 0,05 signifikansniveau.

Resultater

Patient befolkning

Sixty-otte konsekutive patienter med fremskreden vildtype

RAS-RAF-PI3KCA

CRC blev inkluderet i denne prospektive datasæt på Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori i Milano. Patient og sygdom egenskaber er vist i tabel 1 og opsummeret i figur 2. De fleste af patienterne (n = 60, 88%) blev klassificeret som chemorefractory og blev tidligere behandlet med både oxaliplatin-baserede og irinotecan-baseret kemoterapi, og efter svigt af mindst to tidligere linjer af kemoterapi. Men 8 (12%) af patienterne blev anset irinotecan støtteberettigede og modtog panitumumab som anden linie behandling efter svigt af oxaliplatin kemoterapi. Samlet, vi observerede et partielt respons i 34 patienter (50%), og progressiv sygdom i 17 tilfælde (25%). Yderligere 17 patienter (25%) viste stabil sygdom (SD), hvorimod der ikke blev opnået nogen komplet remission. Median opfølgning af hele serien var 32,5 måneder. Samlet, 67 patienter havde en dokumenteret PD, og ​​i alt 41 (60%) patienter døde. Alle dødsfald skyldtes PD, mens én patient var tabt for opfølgning. Median PFS og OS var 6.3 og 16,4 måneder. De OS kurver blev afkortet på 3 år, nemlig på et tidsinterval lidt længere end den median opfølgning.

Patienter udfald ifølge ALK genkopiantallet status

Nej

blev påvist ALK

translokationer eller amplifikationer.

ALK

genkopital gevinst blev fundet i 25 (37%) tumorer, med en median antal

ALK Salg signaler per celle med unormale FISH resultater var 3,52 (område, 3,0-5,8); disomic

ALK

status blev fundet i 43 (63%) prøver, som vist i figur 1. Med hensyn korrelation af

ALK

status med resultater, kun 8 af 25 (32%) patienter i gruppe med øget

ALK

genkopitallet viste et partielt respons efter RECIST 1.1 kriterier [19], mens op til 30 af 43 (70%) patienter med disomic

ALK

status reagerede. Denne forskel var statistisk signifikant (p = 0,0048). PFS blev betydeligt forværret i tilstedeværelse af forhøjet

ALK

genkopitallet vs. disomic

ALK

status (5,3 vs. 6,7 måneder; Hazard Ratio [HR] = 1,759, 95% CI, 1.013- 3.053; p = 0,045, figur 3). OS var lidt forværret i patienter med øget

ALK

genkopiantal, selv om denne forskel ikke nåede statistisk signifikans (15,6 vs. 18,5 måneder HR = 1,181, 95% CI, 0,623-1,738; p = 0,885; Figur 4)

Kaplan-Meier-kurver for progressionsfri overlevelse efter ALK status:.. forøgelse af genkopital vs. disomic status

Kaplan-Meier kurver for samlet overlevelse ifølge ALK status:. forøgelse af genkopital vs. disomic status

diskussion

Internationale retningslinjer anbefaler

KRAS

mutation test forud for ordination anti-EGFR den monoklonale antistoffer cetuximab og panitumumab for patienter med fremskreden CRC og angiver, at alternativ behandling bør ordineres, når der registreres mutationer [20]. Faktisk

KRAS

mutationer er blevet valideret som prædiktive biomarkører for resistens over for anti-EGFR behandling [4] – [7]. en betydelig procentdel af patienter med vildtype

KRAS

tumorer imidlertid ikke, at reagere på behandlingen. Derfor er identifikation af yderligere biomarkører køre “negative” udvælgelse af patienter med fremskreden CRC er en udækket behandlingsbehov. En mere nøjagtig behandling personalisering kan bidrage til at undgå unødvendig toksicitet og sociosanitary omkostninger for patienter, der ikke vil nyde godt af behandlingen. De fleste biologiske faktorer analyseret i forsøget på at forbedre patienternes valg i denne indstilling fokuseret enten på EGFR nedstrøms signalvejen eller på selve receptoren. For nylig, en bredere mutation test af

RAS

gen (ved exon 2, 3 eller 4 i begge

KRAS

NTM

) er blevet valideret for behandling personalisering i avanceret kolorektal cancer gennem støtte til flere undersøgelser [21]. Svarende til Ras gener,

BRAF

også koder proteiner, der handler i RAS-RAF-MAPK signalvejen og kan være involveret i resistens mod anti-EGFR behandling. disse første observationer var imidlertid ofte modstridende og begrænset til en lille del af patienterne. For eksempel, syntes lovende for en enkel anvendelse i klinisk praksis [22], men en stor efterfølgende analyse fra CRYSTAL foreløbige oplysninger om betydningen af ​​BRAF status ( “Cetuximab Kombineret med irinotecan i First-line terapi for metastatisk colorectal cancer”) knytnæve -line forsøg har vist, at BRAF mutation er en dårlig prognostisk faktor, men ikke en prædiktiv on [23]. Det blev også vist, at i lighed med, hvad der er observeret for den onkogene aktivering af MAPK-vejen, den konstitutive dereguleringen af ​​

PI3KCA

kunne omgå EGFR signalvejen og være ansvarlig for klinisk resistens [13]. En tidligere systematisk gennemgang viste, at

PI3KCA

exon 20 mutationer var forbundet med en lavere responsrate, kortere progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse, og dermed kan være en potentiel biomarkør for resistens over for anti-EGFR monoklonale antistoffer i

KRAS

vildtype metastaserende CRC, mens

PI3KCA

exon 9 mutationer syntes at have nogen sådan rolle [24].

Da svarprocenten på cetuximab er 41,2% i patienter med “firedobbelt vildtype” tumorer [7], er det klart, at andre biomarkører skal inddrages i behandlingen primær resistens. Ændringer af membranen tyrosinkinasereceptorer “konkurrerende” med EGFR – såsom HER-3, MET eller IGFR – kan spille en rolle i behandlingen ildfasthed, skyldes krydstale i signalering nedstrøms [25] – [27]. På trods af den relevante række prækliniske observationer, er blevet udført få kliniske undersøgelser for at udforske den formodede funktion af vækstfaktor receptor indbyrdes afhængighed og komplementaritet i at påvirke kliniske resultat med anti-EGFR behandling. Desuden resultater på dette forskningsområde ofte har været selvmodsigende og ikke nemt overføres til klinisk praksis. Faktisk kan tidligere undersøgelser i denne indstilling har betydelige bias som følge af analyse af serier med tilbagevirkende kraft-identificerede undergrupper og inddragelse af RAS, BRAF og PI3KCA mutant tumorer. Dette kan i væsentlig grad påvirke resultaterne, da den lille stikprøve kunne have været klart statistisk utilstrækkelig for flere sammenligninger af samtidige faktorer.

For nylig har ALK translokation blevet rapporteret hos ca. 2,5% af CRC præget af C2orf44-ALK og EML4-ALK genfusioner [28], [29]. Imidlertid har andre ALK fusionspartnere blevet beskrevet i ikke-småcellet lungekræft og andre typer tumorer, begrænsning af muligheden for at fandt alle ALK translokationer, der kan være til stede i CRC prøver. Desuden er signalet opregningen i solide tumorer sektioner ved FISH udfordrende at fortolke og retningslinjer for analysemetoder og pointsystemer er ikke tilgængelige for CRC, dels forklare, hvorfor

ALK

gen kopi nummer som biomarkør er ikke blevet grundigt undersøgt endnu. Med hensyn til rolle ALK i udviklingen og progressionen af ​​CRC, en nylig undersøgelse fra Aisner et al. fundet markeret intratumoral heterogenitet for både KRAS mutation og ALK omlægning i CRC og i regionen i højt differentieret dysplasi [30]. Forfattere foreslå som dette bevis kan skabe basis for flere hypoteser forklarer mekanismer, som kombinationer af KRAS og ALK status kan eksistere gennem klonal kræft evolution [30]. Med hensyn til den prognostiske rolle ALK blev sammenhængen mellem kopital ombygninger og klinisk resultat ikke grundigt undersøgt i CRC. For nylig blev stigningen i ALK genkopital anerkendt som en selvstændig dårlig prognostisk faktor i en retrospektiv serie af 770 patienter med CRC [31]. ALK genkopiantallet (forstærkning /gevinst) blev fundet kun i 3,4% af alle CRC prøver undersøgte, hvilket muligvis afspejler den relativt lave antal stadie IV patienter inkluderet og på grund af den statistisk signifikant sammenhæng for ALK kopi antal ændringer med mere fremskreden sygdom stadie [31].

til vores viden, vores undersøgelse er den første til at undersøge betydningen af ​​ALK som prognostisk faktor hos patienter med fremskreden CRC, der modtager cetuximab eller panitumumab. I vores analyse, undergruppen af ​​patienter med chemorefractory CRC og øget ALK genkopital havde ha signifikant lavere sandsynlighed for at reagere på anti-EGFR behandling på trods af en RAS-RAF-PI3KCA vildtype status. ALK status syntes at påvirke kun responsraten og PFS, men ikke OS varighed, hvilket begrænser den logiske begrundelse for dets anvendelse som en prognostisk faktor. Dog skal det påpeges, at potentielle forskelle i OS efter ALK status kan være blevet forvekslet med post-progression behandlinger normalt ordineret på vores videregående kræft center – herunder kemoterapi genbehandling, regorafenib, anti-EGFR genbehandling, temozolomid i MGMT methylerede tumorer og molekylær profilering til optagelse i fase i forsøg med målrettede midler [32] – [34]. Desuden er lille prøvestørrelse og manglen på en kontrolgruppe af vores undersøgelse give mulighed at ALK kopital ændringer kan være en prognostisk faktor snarere end en prædiktiv én, da der ikke er nogen måde at dissekere den prædiktive fra prognostisk betydning. Faktisk skal yderligere bekræftet gennem tilstrækkeligt drevne, randomiserede undersøgelser mulige forudsigende rolle ALK gen status som centrale vej af resistens over for anti-EGFR behandling. trods nogle iboende begrænsninger, inkluderet dog patienter i denne analyse blev opnået fra en prospektiv database og blev behandlet homogent med anti-EGFR monoklonale antistoffer til chemorefractory sygdom. Alle patienter blev udvalgt gennem en “molekylær berigelse” proces -. Og dem med mulige confounding RAS, BRAF, og /eller PI3KCA mutationerne blev anset støtteberettigede

Endelig, uanset om høj

ALK

genkopital kan repræsentere en sand prædiktiv faktor reaktion på ALK-hæmmere er ikke undersøgt i CRC. Interessant nok kan ALK være en mulig molekylært mål som del af en behandling protokol fokuseret på kontrol med enten EGFR og ALK-receptorer, eller PI3KCA pathway. Muligheden for at anvende ALK-hæmmere i biologisk udvalgte anti-EGFR-resistente tumorer lover at være en afgørende udfordring for den fremtidige udvikling af målrettet terapi i CRC patienter. Manglen på ALK translokeres tilfælde sammen med den lave procentdel af celler med amplifikation i alle tilfælde, viser, at forstærkningen af ​​genkopital måske ikke en biologisk relevant begivenhed eller forudsige respons til ALK målretning molekyler. Desuden

ALK

gen kopi gevinst kan være forbundet med kopi nummer aberration af andre konkurrerende gener, såsom MET eller EGFR selv [35], [36]. Ikke desto mindre er disse observationer ikke helt udelukke den potentielle fordel for ALK-inhibitorer i denne population, som påvist i kolorektale patienter uden EGFR protein udtryk, der reagerer på terapeutiske monoklonale antistoffer rettet mod EGFR [37].

Tak

Disclaimer: manuskriptet er ikke blevet offentliggjort eller indsendt til offentliggørelse andre steder. Alle forfattere har bidraget væsentligt, og er i overensstemmelse med indholdet af manuskriptet.