PLoS ONE: lokal applikation af en blodpladeaktiveringsfaktor receptor agonist blænder phorbolester-induceret akut og kronisk inflammation og har kræft kemoforebyggende aktivitet i mus Skin

Abstrakt

blodpladeaktiveringsfaktor (PAF) har længe været forbundet med akut ødem og inflammatoriske reaktioner. PAF virker ved at binde til en specifik G-protein-koblet receptor (PAF-R,

Ptafr

). Men rollen som kronisk PAF-R-aktivering på vedvarende inflammatoriske reaktioner er stort set blevet ignoreret. Vi viste for nylig, at mus, som mangler PAF-R (

Ptafr

– /- mus) udviser øget kutan tumorigenese som reaktion på en to-trins kemisk carcinogenese protokol.

Ptafr Salg – /- mus udviste også øget kronisk inflammation som reaktion på phorbolester ansøgning. I denne foreliggende undersøgelse viser vi, at topisk anvendelse af det ikke-hydrolyserbare PAF mimetisk (carbamoyl-PAF (CPAF)), udøver en potent, dosisafhængig, og kortvarig ødem reaktion i WT-mus, men ikke

Ptafr

– /- mus eller mus mangelfuld c-

Kit

(c-

Kit

W-sh /W-sh mus). Ved hjælp af en øre betændelse model, samtidig administration af aktuel CPAF behandling resulterede i en paradoksal fald i både akutte øre ændringer tykkelse forbundet med en enkelt PMA ansøgning, samt den vedvarende inflammation i forbindelse med kroniske gentagne PMA-applikationer. Desuden mus behandlet topisk med CPAF udviste også en signifikant reduktion i kemisk carcinogenese. Evne CPAF at undertrykke akutte og kroniske inflammatoriske ændringer som reaktion på PMA ansøgning (er) var PAF-R afhængig, som CPAF havde ingen virkning på basal eller PMA-induceret inflammation i

Ptafr Salg – /- mus. Desuden c-

Kit

synes at være nødvendig for de anti-inflammatoriske virkninger af CPAF, da CPAF havde ingen observerbar effekt i c-

Kit

W-sh /W-sh mus. Disse data giver yderligere beviser for, at PAF-R-aktivering udøver komplekse immunmodulerende effekter i en model af kronisk betændelse, der er relevant for neoplastisk udvikling

Henvisning:. Sahu RP, Rezania S, Ocana JA, DaSilva-Arnold SC, Bradish JR, Richey JD, et al. (2014) lokal applikation af en blodpladeaktiveringsfaktor receptor agonist blænder phorbolester-induceret akut og kronisk inflammation og har kræft kemoforebyggende aktivitet i Mouse Skin. PLoS ONE 9 (11): e111608. doi: 10,1371 /journal.pone.0111608

Redaktør: Paul Proost, University of Leuven, Rega Institute, Belgien

Modtaget: Februar 11, 2014 Accepteret: 2 oktober 2014; Udgivet: November 6, 2014

Copyright: © 2014 Sahu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (www.nih.gov) (R01 HL062996, R21 ES017497, og R21 ES020965), Veterans Administration (www.research.va.gov/funding)(VA Merit 510BX000853), og Prevent Cancer Foundation (www.preventcancer.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

blodpladeaktiverende faktor (1-alkyl-2-acetyl glycerophosphocholine, PAF) er et bioaktivt lipid molekyle produceret af både enzymatiske og ikke-enzymatiske mekanismer [1]. Ikke-enzymatisk produktion af PAF er afhængig af fri radikal-medieret modifikation af sn-2 polyumættet fedtsyre af glycerophosphocholines til dannelse PAF selv og andre oxiderede glycerophosphocholines (ox-GPCs), som udviser evnen til at aktivere PAF-receptoren [1] – [5]. Den biologiske aktivitet af PAF medieres ved binding til et enkelt G-protein-koblet receptor (PAF-R), der udtrykkes på en lang række celler, herunder keratinocytter [1], [6], [7]. Når der produceres, PAF fremkalder en række fysiologiske og patologiske virkninger der spiller en rolle i akut inflammation, sårheling og angiogenese. Imidlertid er PAF måske bedst kendt for sine pro-inflammatoriske virkninger, som medierer den systemiske reaktion på shock, allergiske reaktioner og anafylaksi [1]. I denne rolle, er PAF handlinger menes at være medieret af dets evne til at stimulere vasodilation og vaskulær permeabilitet, blodpladeaggregering, bronkokonstriktion, og ændringer i leukocyt- funktion [1]. Disse virkninger på leukocytter omfatter evnen af ​​PAF til at stimulere mastcelleaktivering og migration [8] – [10], mononukleare og neutrofile fagocytose [11] – [13]., Og M2 polarisering af makrofager [14]

Selv om det er klart, at PAF virker til at fremme akutte inflammatoriske virkninger, især dem der er forbundet med anafylaksi og chok, nyere tyder på, at PAF kan spille en mere kompleks rolle i immunforsvaret. PAF produktion gennem enzymatiske og oxidation synes at spille en rolle i keratinocyt reaktioner på genotoksiske midler, såsom ultraviolet B, cigaretrøg eller kemoterapeutiske midler [3], [15] – [18]. Undersøgelser af mekanismerne i ultraviolet B (UVB) -induceret systemisk immunosuppression har vist et krav for PAF-R-aktivering [3], [10], [19], [20]. Denne UVB-fremkaldt systemisk immunsuppression er kendetegnet ved en antigenspecifik suppression af adaptive T-celle-medierede immunresponser [21], [22]. Derudover har vi for nylig demonstreret, at

Ptafr

– /- mus udviser en stigning i kutant kemisk carcinogenese, der er forbundet med en tilsvarende stigning i phorbolester (PMA) -inducerede kutan inflammation [7]. Disse data antyder, at PAF-R-aktivering kan være også være vigtig i regulering af medfødte immunsystem. Men down-stream cellulære mediatorer af denne immunmodulerende aktivitet er ukendte.

c-

Kit

gen koder for en receptortyrosinkinase, der binder liganden, stamcellefaktor (SCF), og er vigtig i [23]. C-

Kit

W-sh

(skærf) mutationen er en inversion af en 3,1 Mbp segment, der forstyrrer promotorregionen af ​​c-

Kit

genet [23]. Mus homozygote for c-

Kit

W-sh

mutation udviser en dyb tab af mastceller, men mangler også melanocytter og interstitielle celler af Cajal [23], [24]. Således c-Kit

W-sh /W-sh mus udgør en fælles redskab til at vurdere mast celle funktion. Mastceller er væv resident knoglemarvsceller afledte celler, der ligesom PAF, er velkendte mediatorer af allergiske og anafylaktiske reaktioner [25]. Mastceller er strategisk lokaliseret i subepiteliale og submukøse mellemrum udsat for miljømæssige og smitsomme fornærmelser [25]. Endvidere evne PAF at fremme anafylaktiske reaktioner afhænger af aktivering mastcelle [8]. PAF er også en kendt aktivator og kemotaktisk middel for mastceller [9]. Ud over deres rolle ved at fremme hjulet og flare reaktion associeret med type I-hypersensitivitetsreaktioner, har mastceller også blevet vist at undertrykke kronisk inflammation samt adaptive immunreaktioner [26] – [31]. Af særlig relevans, mastceller handle for at begrænse murine modeller af kontakt hypersensitivitet og kronisk UVB-induceret inflammation [32]. Desuden har den rolle, som PAF-R i UVB-induceret immunsuppression vist sig at resultere fra PAF-R-afhængig migration af mastceller til lymfeknuderne, hvor de udøver en interleukin (IL) -10-afhængig immunosuppressiv virkning [ ,,,0],10].

Mens vi for nylig dokumenteret, at PAF har anti-inflammatoriske virkninger på kronisk PMA-induceret tumorpromotion [7], er det muligt, at virkningerne af kim-line tab af PAF-R kunne være på grund af kompenserende embryonale eller postnatale forandringer i hud udvikling [7]. Således er en demonstration af, at PAF-R-agonist behandling resulterer i undertrykkelse af DMBA /PMA-induceret carcinogenese og inflammation ville give yderligere støtte til ideen om, at PAF-R har vigtige antineoplastiske og immunmodulerende effekter. Vores nuværende fundet studier rolle PAF-R i PMA-induceret inflammation øger vores tidligere rapport og afslører en kompleks immunomodulatorisk rolle for PAF-R-signalering. Desuden vores resultater ved hjælp af c-

Kit

W-sh /W-sh

mus demonstrerer en rolle for

c-Kit

og muligvis mastceller i immunmodulerende virkninger af PAF.

Metoder

Etik erklæring

de protokoller blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Indiana University School of Medicine (Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) .. (protokol nummer: 3841 og 10639) blev gjort Ethvert forsøg på at minimere dyrenes lidelser

Reagenser og kemikalier

Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) blev købt fra Promega, Madison, WI. 7,12-dimethylbenz (a) anthracen (DMBA) blev opnået fra Acros Organics, Fair Lawn, NJ. Carbamyl-PAF blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Dyr

Ptafr

knockout (

Ptafr

– /-) i C57BL /6 baggrund oprindeligt blev opnået fra Dr. Satoshi Ishii (Institut for Biokemi og Molekylær Biologi, Faculty of Medicine , The University of Tokyo), afledt som tidligere beskrevet [33]. Alder (8-12 uger) -matched

Ptafr

+ /+ C57BL /6 (WT) blev anvendt som kontroller (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). SKH-1 hårløse, albinomus blev opnået fra Charles Rivers (Wilmington, MA). Mus indeholdende W-vinduesramme (W-sh) inversion mutation i promotorregionen af ​​

c-kit

genet (

Kit

W-sh

) blev opnået fra Jackson Laboratories i C57BI /6 baggrund (B6.Cg-

Kit

W-sh

/HNihrJaeBsmGlliJ). Musene blev opstaldet under specifikke patogenfrie forhold på Indiana University School of Medicine.

målinger Ear tykkelse

venstre øre af hver mus blev behandlet med 20 ul cPAF (0,1, 0,3, eller 1 mM i acetone). Det højre øre blev behandlet med 20 pi køretøj (acetone) alene. For PMA-behandlinger, blev det venstre øre behandlet med 10 ug PMA i 20 ul acetone, og det højre øre blev behandlet med vehikel (VEH) alene 3 gange om ugen (pile) i 16 dage. For PMA og CPAF behandlinger blev musene behandlet med PMA først, derefter 20 ul 0,3 mM CPAF (i acetone) blev straks tilsat efter PMA-behandling. Ear tykkelse blev målt ved de angivne tidspunkter efter behandling med et konstant tryk analog tykkelse gauge (Peacock Model G, 0,4 N).

Epidermistykkelse målinger

Mus ører blev behandlet i 18 dage tre gange ugentligt med bærer, CPAF (6 nmol), PMA, eller PMA og CPAF blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin (FFPE), og farvet med hematoxylin eosin (H 1 mm i største diameter blev talt. Efter 25 ugers PMA-behandling, blev musene aflivet og tumorstørrelse (størrelse på største dimension) blev målt for hver tumor. FFPE tumor sektioner fra WT og

Ptafr

– /- mus blev farvet med H 0,05

resultater

CPAF er topisk aktiv og resulterer i en dosis- afhængig forbigående stigning i øretykkelse, som er afhængig af mastceller Salg

i en tidligere undersøgelse [7] og i fig 1A, viser vi, at en enkelt topisk påføring af stigende doser af den ikke-hydrolyserbare PAF-R-agonist, CPAF, resulterer i en dosisafhængig stigning i øretykkelse på to timer efter påføring. I figur 1B, viser et tidsforløb undersøgelse, CPAF-inducerede ændringer tykkelse øre forekomme hurtigt, med betydelige stigninger i øret tykkelse bemærket af 1 time efter påføring og peak øre tykkelse blev bemærket på 2 timer. Vigtigere er det, efter en enkelt anvendelse af CPAF ændringerne i øret tykkelse var forbigående og faldt til nær baseline med 8 timer efter påføring. Den hurtige og forbigående karakter af svaret tyder stærkt på, at ændringer i vaskulær permeabilitet, der fører til ødem dannelse er i vid udstrækning ansvarlige for ændringerne i øret tykkelse. Dette er i overensstemmelse med den velkendte evne PAF at inducere vasodilation og vaskulær permeabilitet [37]. For at udelukke PAF-R uafhængige virkninger [38], mus med kimcellelinje tab af

Ptafr

gen (

Ptafr

– /- mus) blev også behandlet med CPAF. Ved alle doser undersøgt, aktuelt CPAF applikation undladt at fremkalde en inflammatorisk reaktion i

Ptafr

– /- mus (fig 1A B), kontrollere specificiteten af ​​den farmakologiske effekt

. 1A

.

Aktuel CPAF dosisafhængigt inducerer hurtige inflammatoriske reaktioner målt ved øre tykkelsesmålinger

ene øre af WT og

Ptafr

. (- /-) Blev behandlet med en af ​​tre doser af CPAF (20 pi af en 0,1, 0,3, og 1,0 mM opløsning for en total dosis behandling af 2, 6 eller 20 nmol CPAF pr øre). Den kontralaterale øre blev behandlet med acetone alene (VEH). Øretykkelse blev målt før behandling og 2 timer efter behandling. Efter forbehandling øretykkelse værdier blev trukket, blev middelværdien og SEM plottet (n = 4 for 20 nmol og n = 8 for 2 6 nmol CPAF VEH behandlede mus ører).

1B

.

Aktuel CPAF behandling inducerer en hurtig, men transient stigning i inflammation som målt ved øre ændringer tykkelse Salg One øre af vildtype (WT) og

Ptafr

. (- /-) Mus blev behandlet med 20 pi CPAF (20 nmol en 0,1 mM opløsning i acetone) og 20 pi af acetone (VEH) blev påført på det kontralaterale øre. Øretykkelse blev målt umiddelbart før reagens anvendelsen og ved 1, 2, 4 og 8 timer efter påføring. Resultaterne repræsenterer middelværdien og SEM (n = 4 mus) efter subtraktion tykkelse forbehandlingen øre. CPAF inducerede en betydelig stigning i øretykkelse i WT-mus i forhold til WT + VEH behandlede ører. *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***;

s

0,001; 2-tailed

t

-test.

Endelig har evne CPAF at inducere hurtig ødem reaktioner været knyttet til mastcelleaktivering [8], [9]. Vi afgøres derfor, om evne CPAF til at fremkalde en tidlig ødem reaktion på 2 timer kunne blive blokeret i mus mangler mastceller (c-Kit

W-sh /W-sh mus). I figur 2 Vi kontrollere, at mastceller er faktisk kræves for den tidlige stigning i øret tykkelse medieret af CPAF applikation.

WT og c-Kit

W-sh /W-sh mus blev behandlet med vehikel ( VEH) alene på det ene øre, og 20 ml 0,3 mM CPAF (6 nmol) på den kontralaterale øre. Øretykkelse blev målt både før og 2 timer efter påføring reagens. Efter fratrækning af tykkelsen af ​​øret på tidspunkt 0 blev middelværdien og SEM plottet (n = 5 for WT mus, n = 4 for Kit

W-sh /W-SH-mus). *,

s

0,05; 2-tailed

t

-test.

Aktuel CPAF beskytter mod kutan kemisk carcinogenese

Undersøgelserne i figur 1 viser, at CPAF udviser specifik dosisafhængig farmakologisk aktivitet efter lokal applikation. Anvendelsen af ​​en topisk levering, undgås også potentielle toksiciteter forbundet med systemisk PAF-R agonist behandling [37]. Derudover PAF-R er tilbøjelig til fænomenet ligand-induceret nedregulering og desensibilisering [1], [39]; denne regulerende funktion er karakteristisk for G-proteinkoblede receptorer og kan føre til en paradoksal tab af receptoraktivering ved efterfølgende ligandbinding [1], [40]. Således eftersom karcinogenicitetsundersøgelserne ville kræve langsigtede gentagne anvendelse af CPAF, vi udnyttet 0,3 mM koncentration af CPAF som inducerede en mellemliggende, men signifikant stigning i tykkelse øre målinger (figur 1A). Til disse undersøgelser blev CPAF umiddelbart efter DMBA eller PMA ansøgning om varigheden af ​​undersøgelsen

I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse, der viste, at

Ptafr

-. /- Mus udviser øget DMBA /PMA -induceret tumordannelse i fig 3A viser vi, at topisk behandling af CPAF resulterede i en signifikant reduktion i DMBA /PMA-induceret tumorbyrde. CPAF behandling også vist en beskeden, men signifikant beskyttende virkning på tumorincidensen (Fig 3B). Endvidere medens

Ptafr

– /- mus udviste en betydelig stigning i hyppigheden af ​​større tumorer [7], mus behandlet med topisk CPAF udviste en betydelig stigning i mindre tumorstørrelser (fig 3C). Desuden har vi tidligere vist, at

Ptafr

– /- mus udviser en stigning i SCC-dannelse i forhold til WT mus [7]. Men i denne aktuelle undersøgelse blev der ikke ligefremme SCC’er observeret og mus behandlet topisk undladt at udvise en signifikant ændring i andelen af ​​grad 1-3 papillom eller microinvasive SCC’er (Figur S1 i File S1). Endelig tumor-fri områder af huden behandles med CPAF udviste en markant reduktion i DMBA /PMA-induceret inflammation, som vurderet ved anvendelse myeloperoxidase (MPO-aktivitet), en markør for granulocytiske celleinfiltrater (Fig 3D) [41]. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere resultater i

– /- iBooked.dk mus, der udviste en forøgelse af MPO aktivitet efter kroniske, gentagne PMA-behandlinger [7]

3A.. Topisk behandling med CPAF undertrykker DMBA /PMA-induceret tumor mangfoldigheden.

SKH-1-mus blev behandlet en gang med DMBA +/- CPAF, derefter med PMA eller PMA + CPAF i 25 uger. Holdbare tumorer blev talt på en ugentlig basis. Tumor mangfoldighed (Gennemsnitlig tumor antal pr mus blev plottet ved hver uge Resultater repræsenterer middelværdien og SEM for n = 19-20 mus /gruppe

s

. . 0,05 for uge 9-12,14-25;

s

0,01 for uge 13. Mann-Whitney U test

3B Aktuel CPAF forsinket tumorincidensen i mus behandlet med DMBA /PMA

procent af mus resterende tumor gratis over.. 25 uger kemisk tumorigenese studie blev plottet ved hjælp af en overlevelse kurve. behandlingen med CPAF resulterede i en betydelig ændring i tumorincidensen, med en median tid indtil første tumor forekomst af 8 uger for DMBA /PMA behandlet og 9 uger for DMBA /PMA + CPAF behandlede mus *,

s

. 0,05;.. Log-rank (Mantel-Cox) Test

3C

Aktuelle CPAF behandling resulterer i et mindre antal store tumorer ( ≥3 mm i største diameter) efter 25 ugers behandling.

Tumor størrelsesfordeling blev plottet som antal tumorer i hver størrelsesfordeling for hver behandlingsgruppe. Histopatologisk undersøgelse viste ingen signifikant forskel i hyppigheden af ​​papilloma og SCC-dannelse mellem behandlingsgrupperne (ikke vist). ***,

s

= 0,0001 Fishers eksakte test.

3D

.

DMBA /PMA-induceret MPO-aktivitet undertrykkes af CPAF.

Efter musene blev aflivet efter 25 ugers DMBA /PMA +/- CPAF behandling, tumor gratis hudområder blev skåret ud og MPO aktivitet blev vurderet i væv lysater. Efter normalisering for totalt protein, blev MPO aktivitet afbildet som middelværdien og SEM (n = 5-9 mus pr gruppe). **,

s

0,05; ***,

s

0,001; 2-tailed

t

-test.

Aktuel CPAF behandling undertrykker inflammation induceret af gentagne anvendelser af tumor promotor PMA

I vores tidligere rapport [7], vi viste, at en første PMA ansøgning inducerede en betydelig stigning i øretykkelse i WT-mus 2 dage efter behandlingen. En anden PMA ansøgning resulterede i en yderligere stigning i øretykkelse, der delvist løst. Derefter efterfølgende PMA applikationer undladt at fremkalde yderligere stigninger i øret tykkelse. I modsætning hertil blev en betydelig og vedvarende stigning i øret tykkelse observeret under de 18 dage af PMA behandlinger (vedvarende kronisk inflammatorisk fase). Som i vores tidligere undersøgelse, tab af PAF-R resulterede i en afstumpning af toppen øretykkelse observeret efter den anden PMA ansøgning, men et højere vedvarende kronisk inflammation efter fortsat tre gange ugentligt PMA applikationer (figur S2 i File S1 og [ ,,,0],7]). Vi undersøgte derfor, om lokal CPAF administration ville have den modsatte virkning og undertrykke den vedvarende kronisk inflammation induceret af PMA behandling. I fig 4A viser vi, at anvendelsen af ​​topisk CPAF umiddelbart efter hver påføring af PMA resulterer i en signifikant reduktion i både top inflammatoriske respons på dag 4, såvel som en reduktion af den vedvarende inflammatoriske respons, der blev bemærket under hele PMA applikation (18 dage). Interessant, ved disse senere tidspunkter, CPAF havde ingen virkning på øretykkelse målinger i WT mus ikke behandlet med PMA, hvilket antyder at topisk CPAF er ineffektiv i at inducere et signifikant vedvarende inflammatorisk respons ved den testede dosis (0,3 mM). Endelig har vi næste viste, at effekten af ​​CPAF var helt afhængig af PAF-R, som CPAF og VEH applikationer viste næsten identiske tykkelse øre målinger på alle tidspunkter efter PMA ansøgning til

Ptafr – /-

mus ( fig 4B). Mens CPAF betydeligt blokeret PMA-induceret tykkelse øre i WT mus (Fig 4A), blev dette svar helt tabt i

Ptafr

– /- mus behandlet med PMA (Fig 4B). Endelig i fig 4C viser vi, at evnen hos CPAF at undertrykke PMA-inducerede ændringer hudens tykkelse ikke var afhængig af anatomisk site. CPAF betydeligt undertrykt PMA-inducerede stigninger i dorsal tilbage tykkelse hud efter 18 dages tre gange ugentlig behandling.

4A. Topisk CPAF behandling undertrykker PMA-inducerede ændringer i øretykkelse i WT mus.

CPAF (6 nmol) alene eller PMA +/- CPAF blev påført på WT musen ører tre gange ugentligt i 18 dage. målinger Hudtykkelsen blev taget ved tiden 0 og lige før hvert reagens ansøgning. Efter subtraktion af øretykkelse tiden 0 blev øre ændringer tykkelse afbildet som gennemsnit og SEM (n = 4-5 mus pr gruppe). PMA i forhold til PMA + CPAF (

a), PMA + CPAF forhold til CPAF (

b); *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001; 2-tailed

t

-test.

4B. Aktuel CPAF behandling er ineffektiv i at ændre PMA-induceret øre ændringer tykkelse i Ptafr – /- mus. Ptafr

– /- mus blev behandlet og vurderet som i 4A ovenfor. Af hensyn til sammenligning er data for PMA + CPAF behandling i WT mus medfølger. (Middelværdi og SEM, n = 4-5 mus pr gruppe). WT mus behandlet med PMA + CPAF udviser et signifikant fald i øret tykkelsesmålinger forhold til

Ptafr

– /- mus behandlet med PMA + CPAF (*,

s

0,05; **,

s

0,01, ***,

s

0,001; 2-tailed

t

-test).

4C. Topisk CPAF behandling undertrykker PMA-inducerede hudtykkelse stigninger i dorsale epidermis følgende 18 dages behandling.

Den dorsale epidermis af SKH-1-mus blev behandlet tre gange ugentligt med bærer, CPAF, PMA, eller PMA + CPAF. Doser af PMA og CPAF var den samme som anvendes til tumorigenese studier i Fig 3. ***,

s

0,05 i forhold til PMA behandlede hud; 2-tailed

t

-test (n = 3 pr gruppe).

Vi næste bestemmes histopatologiske forandringer i øre hud, der skyldes flere PMA applikationer med eller uden CPAF behandlinger. Multiple PMA ansøgninger til musehud er kendt for at inducere epidermal hyperplasi og leukocytinfiltration [42], [43]. I figur 5A-I, viser vi, at flere PMA applikationer til at WT mus ører resulterer i en klar stigning i øret tykkelse ledsaget af dermal ekspansion, leukocyt infiltration og epidermal hyperplasi. Endvidere co-behandling af WT mus ører med CPAF resulterede i en reduktion i PMA-induceret leukocyt infiltrater mens

Ptafr

– /- mus udviste en markant stigning i øretykkelse, dermal ekspansion, inflammatoriske celleinfiltrater, og epidermal hyperplasi (fig 5A-H). I forhold til WT-mus,

Ptafr

– /- mus udviste en markant stigning i granulocytiske infiltrater efter kronisk PMA-behandlinger (fig 5 og fig S3 i File S1). Desuden CPAF behandling undertrykt de observerede PMA-inducerede inflammatoriske infiltrater i WT, men ikke

Ptafr

– /- mus. Disse data er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse demonstrerer, at

Ptafr

– /- mus udviser en markant stigning i MPO aktivitet efter PMA-behandling [7], samt vores data i figur 3D, der viser, at CPAF behandling undertrykker MPO-aktivitet i DMBA /PMA-behandlede mus. Da neutrofiler er vist at spille en vigtig rolle i musehud photocarcinogenesis [35], kan denne reduktion i granulocytiske infiltrater spille en vigtig rolle i de observerede antitumorvirkninger af topisk CPAF behandling i kemisk carcinogenese (Fig 3A B). Eftersom graden af ​​kronisk inflammation almindeligvis er forbundet med epidermal hyperplasi, er det noget overraskende, at mens CPAF behandling undertrykt PMA-induceret granulocytisk inflammation i WT mus, havde CPAF behandling ikke ændre PMA-induceret epidermal hyperplasi i enten WT eller

Ptafr – /-

mus (fig 5I)

5A

-.

H. Inflammatoriske infiltrater øges i Ptafr – /- mus behandlet med PMA, mens CPAF undertrykker inflammatoriske celle infiltrater i PMA behandlede WT mus

Efter behandling WT og

Ptafr

-. /- Mus ører i 18 dage med VEH , CPAF, PMA, eller PMA + CPAF som beskrevet i figur 4, blev musene aflivet, og ørerne udskåret for formalinfiksering, paraffinindlejring og hematoxylin eosin (H B. Epidermal tykkelse i mm udtrykkes i middelværdien og SEM for 3-4 ører pr forsøgsgruppe. Signifikant forskellig fra WT VEH kontrol (

a), signifikant forskelligt fra

Ptafr

– /- VEH kontrol (

b). *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001; 2-tailed

t

-test.

PAF udøver komplekse effekter på den indledende inflammatorisk respons på PMA ansøgning

pro-inflammatoriske tumor promotor PMA er kendt for at inducere en hurtig ødem reaktion i musen ører [42], [43]. Dette er efterfulgt af en gradvis stigning i leukocytinfiltration målt ved MPO og /eller N-acetylglucosaminidase (NAF) aktivitet, der topper ved omkring 24 hrs [42], [43]. I betragtning af, at PAF er en potent vasoaktive lipid mediator, der fremmer hurtige ødem reaktioner [37], vi næste undersøgt, hvordan CPAF ville påvirke tidlige inflammatoriske forandringer efter den første PMA ansøgning i WT og

Ptafr

– /- mus. Som det ses i fig 6A, PMA-behandling inducerer en hurtig stigning i øretykkelse, som først blev observeret to timer efter påføring. Øre ændringer tykkelse toppede med ca. 24 til 48 timer. I modsætning hertil

Ptafr

– /- mus udviste en reduktion i de indledende forandringer øretykkelse bemærkes 2 8 timer, hvilket antyder, at PMA-inducerede ødem responser var PAF-afhængig. Det var derfor overraskende at finde, at WT mus behandlet med CPAF umiddelbart efter PMA ansøgning også udviste et tab på ca. 50% af PMA-induceret tidlig øre ændringer tykkelse observeret ved 2 timer (Fig 6B). Dette tyder på en kompleks rolle for PAF-R i reguleringen indledende vasoaktive ødem ændringer i respons på PMA

For alle studier i figurerne 6, WT og

Ptafr

-. /- Mus blev behandlet med VEH, PMA, CPAF (6 nmol) eller PMA + CPAF som beskrevet i fig 4A B. Øremålinger tykkelse blev foretaget umiddelbart før reagens anvendelse samt på det angivne tidspunkter op til 48 timer.

6A. Ptafr – /- mus udviser en reduktion i tidlige og forsinkede tykkelse øre stiger efter en enkelt PMA ansøgning

Ear tykkelse grunde til WT og

Ptafr

-. /- Mus behandlet med og uden PMA vises. Statistisk signifikante ændringer er noteret til WT mus behandlet med PMA i forhold til

Ptafr

– /- mus behandlet med PMA. Resultaterne repræsenterer middelværdien og SEM af øretykkelse efter subtraktion af øretykkelse ved tiden 0 (n = 4-12 mus pr gruppe). *,

s

0,05; **,

s

0,01;

t

-test.

6B. Samtidig administration af topiske CPAF blokke PMA-inducerede stigninger i øre tykkelse på alle tidspunkter (2-48 timer)

PMA-induceret øre ændringer tykkelse blev vurderet i WT eller

Ptafr

-. /- Mus behandlet med PMA eller PMA + CPAF. Efter subtraktion af øretykkelse ved tid 0, evnen af ​​CPAF undertrykke PMA-induceret øre ændringer tykkelse blev beregnet som en procentdel inhibering af PMA-induceret øretykkelse stiger. CPAF behandling resulterede i en signifikant inhibering af PMA-inducerede ændringer øretykkelse på alle tidspunkter (p 0,01-0,05;% inhibering signifikant forskellig fra ingen inhibering, Wilcoxon-test). CPAF behandling havde ingen signifikant effekt på PMA-induceret øre ændringer tykkelse i

Ptafr

– /- mus (En prøve analyse, Wilcoxon-test). Den procent hæmning af PMA-inducerede ændringer tykkelse øre ved CPAF i WT mus var også signifikant anderledes end den, der ses i

Ptafr

– /- mus (*,

s

0,05; ** ,

s

0,01;

t

-test)

Mens ovenstående data tyder på en kompleks rolle for PAF-R i reguleringen indledende PMA-.