PLoS ONE: Co-ekspression af IQ-Domain GTPase-aktiverende protein en (IQGAP1) og Dishevelled (Dvl) er korreleret med dårlig prognose i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

IQ-domæne GTPase-aktiverende protein 1 (IQGAP1) binder til Dishevelled (Dvl) og fungerer som en modulator af Dvl kernelokalisering i Xenopus embryoer. Men forholdet mellem IQGAP1 og Dvl i tumorvæv er uklar.

Materialer og metoder

Vi brugte immunhistokemi til at vurdere udtryk for IQGAP1 og Dvl i en kohorte af 111 ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) patienter. blev også analyseret Foreningen af ​​deres lokalisering udtryk med klinisk-patologiske faktorer.

Resultater

Den positive sats på IQGAP1 i primære tumorer var 48,6% (54/111) for sin cytoplamic udtryk, 9,0% (10 /111) for nuklear udtryk og 31,5% (35/111) for membranøs udtryk; den positive sats på Dvl var 65,8% (73/111) for cytoplamic udtryk, 9,9% (11/111) for nuklear udtryk og 10,8% (12/111) for membranøs udtryk. Coekspression på IQGAP1 og Dvl var 77,8% (42/54) i cytoplasmaet, 80,0% (8/10) i kernen og 8,6% (3/35) i membranen. Coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var signifikant korreleret (P 0,05), men ikke i membranen (P 0,05). De positive ekspressionshastigheder af cyclin D1 og c-myc var signifikant højere i gruppen af ​​IQGAP1 og Dvl coekspression i kernen end i cytoplasmaet. Coekspression på IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var signifikant højere i lymfeknuder nodal metastaser (63,3%, 19/30) end i primære vækster (38,3%, 31/81), hvilket korrelerede med dårlig prognose. Fem års overlevelsen tid efter resektion i gruppen med deres co-ekspression i cytoplasmaet og kernen var signifikant lavere end uden co-ekspression (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 måned, p 0,05).

Konklusioner

Co-ekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var korreleret med lymfeknuder nodal metastase og dårlig prognose for NSCLC, og co-ekspression i kernen kan spille en afgørende rolle i aktiveringen af ​​kanoniske Wnt vej.

Henvisning: Zhao H, Xie C, Lin X, Zhao Y, Han Y, Fan C, et al. (2014) Co-ekspression af IQ-Domain GTPase-aktiverende protein en (IQGAP1) og Dishevelled (Dvl) er korreleret med dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (12): e113713. doi: 10,1371 /journal.pone.0113713

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Juli 3, 2014 Accepteret: 27 Oktober 2014; Udgivet: December 1, 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

IQGAP familie proteiner findes i talrige organismer, herunder gær, fisk og pattedyr. Der er tre isoformer af IQGAP hos mennesker: IQGAP1, IQGAP2 og IQGAP3. IQGAP1 er bedst karakteriseret og mest undersøgte medlem af IQGAP familien. Det er et stillads protein, der binder til filamentøs actin og funktioner til tværbinding og stabilisering af actinfilamenter via sin calponin homologi (CH) domæne ved N-terminus [1]. Tidligere rapporter viste, at IQGAP1 påvirket celle motilitet på forkant af migrerende celler, ved at øge niveauet af aktiv Rac1 og Cdc42 [2]. IQGAP1 viser forhøjede niveauer i en række forskellige cancertyper, herunder pancreascancer [3]. Ekspressionen og subcellulære lokalisering af IQGAP1 i lungeadenocarcinom var forbundet med histologisk differentiering og kan anvendes til at forudsige overlevelse hos patienter [4]. Nyere forskning tyder på, at IQGAP1 er en risikofaktor for lymfeknude metastaser af lunge planocellulært karcinom [5].

Dvl er blevet identificeret som en vigtig regulator af Wnt signalering (herunder kanoniske og noncanonical veje), som er en centralt element i fysiologisk proces involveret i fosterudviklingen og tumor progression [6], [7]. Mange rapporter har vist rolle Dvl i tumorer. DVL overekspression er signifikant korreleret med dårlig differentiering og lymfeknudemetastaser i NSCLC [8]. DVL-1 og DVL-3 påvirker NSCLC celleinvasion hovedsagelig gennem kanoniske og noncanonical Wnt veje, henholdsvis [9]. Wnt5a fremmer brystcancer cellemigrering via Dvl-2 [10].

IQGAP1 fungerer som en modulator af Dvl kernelokalisering i Wnt signalering [11]. Men sammenhængen mellem IQGAP1 og Dvl i tumorer er uklar. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi en immunhistokemisk analyse for at identificere de udtryk og placeringer af IQGAP1 og Dvl i NSCLC. Desuden har vi analyseret deres tilknytning til klinisk-patologiske parametre.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle humane væv blev opnået i overensstemmelse med menneskelige Emne Research protokoller godkendt af China Medical University Review Board. Tumorvæv blev opnået med skriftligt informeret samtykke fra voksne patienter med NSCLC.

Vævsprøver og patientdata

Vi indsamlede 111 prøver fra NSCLC patienter, som gennemgik fuldstændig resektion i First Affiliated Hospital i Kina Medical University fra januar til december 2008. Ingen af ​​patienterne havde fået strålebehandling eller kemoterapi før kirurgisk resektion. Opfølgning oplysninger blev indhentet fra gennemgang af patienternes journal. Det pTNM iscenesættelse system Den Internationale Union Against Cancer (7. udgave) blev anvendt i vores undersøgelse. Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af den lokale institutionelle gennemgang bord Kina Medical University. De vigtigste kliniske og patologiske variabler af alle patienter er som følger: 46 tilfælde af pladecellecarcinom, 65 tilfælde af adenocarcinom; 38 tilfælde af godt differentiering, 73 tilfælde af moderat-dårlig differentiering; 67 tilfælde i fase I, 20 tilfælde i fase II, 24 tilfælde var fase III; 70 tilfælde af mandlige patienter, 41 tilfælde af kvindelige patienter; den gennemsnitlige alder er 57 år.

Immunhistokemi

Kirurgisk udskårne tumor prøver blev fikseret med 10% neutral formalin, indlejret i paraffin og 4 um tykke sektioner blev forberedt. Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks-metoden (UltrasensitiveTM, MaiXin, Fuzhou, Kina). Snittene blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret med gradueret alkohol, og derefter kogt i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 2 minutter med en autoklave. Hydrogenperoxid (0,3%) blev anvendt til at blokere endogen peroxid aktivitet og sektionerne blev inkuberet med normalt gedeserum for at reducere ikke-specifik binding. Vævssnit blev derefter inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Primære antistoffer (muse-anti-humane) er som følger: IQGAP1 monoklonalt antistof (1:40, sc-376.021, Santa Cruz Biotechnology, USA), Dvl monoklonalt antistof (1:25, sc-166.303, Santa Cruz), cyklin D1 monoklonalt antistof (1:100, sc-20044, Santa Cruz), c-myc monoklonalt antistof (1:500, cat.ab32, Abcam). Biotinyleret gede-antimuse serum-IgG blev anvendt som et sekundært antistof. Som en isotypekontrol, muse-IgG (Maixin Biotechnology, Fuzhou, Fujian, Kina, ved den samme koncentration af det primære antistof) blev anvendt i stedet for det primære antistof (fig S1). Efter vask blev sektionerne inkuberet med streptavidin-biotin konjugeret med peberrodsperoxidase, og peroxidase reaktionen blev fremkaldt med 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid. Kontrastfarvning blev gjort med hæmatoxylin, og sektionerne blev derefter dehydreret med ethanol, før de monteres.

Evaluering af farvning

farvning intensitet og procentdelen af ​​celler farvet i repræsentative områder af hvert dias blev uafhængigt evalueret og scoret af to efterforskere, der var blindet til de kliniske data om patienter. Fem synspunkter blev undersøgt per dias, og blev observeret 100 celler per view på 400 × forstørrelse. For IQGAP1 eller Dvl viste immunohistokemiske resultater som positiv farvning lokaliseret i kernen, cytoplasmaet, og (eller) membran. Tumorer blev defineret som cytoplasmatisk udtryk, når 20% eller mere tumorceller viste cytoplasmatisk farvning; tumorer blev defineret som nuklear udtryk, når 20% eller mere tumorceller viste nuklear farvning, hvad enten cytoplasmatisk farvning eller ej; tumorer blev defineret som membranøs udtryk, når 20% eller mere tumorceller viste membranøs farvning, hvad enten cytoplasmatisk farvning eller ej. Regionerne med positivt udtryk var gul eller brun-gul, og regionerne med negativ udtryk var ingen farvning. For cyclin D1 eller c-myc, viste immunohistokemiske resultater som positiv farvning lokaliseret i kernen eller kerne /cytoplasma.

Statistisk analyse

SPSS-version 16.0 for Windows blev anvendt til alle analyser. Chi-squared test blev anvendt til at undersøge forskellige mulige sammenhænge. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev anvendt til at estimere sandsynligheden for patienternes overlevelse, og forskellene for overlevelse mellem undergrupperne af patienter. Cox proportional hazard regression model blev anvendt til at estimere den mulige prognostiske betydning af klinisk-patologiske variabler. Alle P-værdier var baseret på to-sidet statistisk analyse, og P 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant i forskel

Resultater

1.. Coekspression af IQGAP1 og Dvl hovedsageligt i cytoplasmaet og kernen

Den positive udtryk på IQGAP1 var 89,2% (99/111), og 48,6% (54/111) for sin cytoplamic udtryk, 9,0% (10 /111) for nuklear udtryk og 31,5% (35/111) for membranøs udtryk. Den positive udtryk på Dvl var 86,5% (96/111), og 65,8% (73/111) for cytoplamic udtryk, 9,9% (11/111) for nuklear udtryk og 10,8% (12/111) for membranøs udtryk (tabel S1).

Coekspression på IQGAP1 og Dvl var 77,8% (42/54) i cytoplasmaet (tabel 1, figur 1), 80,0% (8/10) i kernen (tabel 1, figur 2A -D). Coekspression i cytoplasmaet var signifikant korreleret (tabel 1, P = 0,009, r = 0,246), også i kernen (tabel 1, P = 0,000, r = 0,738); coekspression på IQGAP1 og Dvl i membranen var kun 8,6% (3/35), og co-ekspression i membranen var ikke korreleret (tabel 1, P 0,05, figur S2)

A-B:. adenocarcinom ; C-D: pladecellekarcinom. Oprindelig forstørrelse, 400 ×; skala bar, 20 pm.

Co-ekspression af IQGAP1 (A) og Dvl (C) i kernen af ​​lunge adenocarcinom. Coekspression af IQGAP1 (B) og Dvl (D) i kernen af ​​lunge pladecellekræft. Positiv ekspression af cyclin D1 (E) og c-myc (G) i lunge adenocarcinom. Positiv ekspression af cyclin D1 (F) og c-myc (H) i lunge pladecellekarcinom. Oprindelig forstørrelse, 400 ×; skala bar, 20 pm.

udtryk for cyklin D1 og c-myc var signifikant positiv i gruppen af ​​IQGAP1 og Dvl coekspression i kernen (Figur 2E-H), og deres positivt udtryk satser var 100% (8/8) og 87,5% (7/8), hhv. I gruppen af ​​IQGAP1 og Dvl coekspression i cytoplasmaet, de positive ekspressionshastigheder af cyclin D1 og c-myc var 52,4% (22/42) og 35,7% (15/42), hhv. De positive ekspressionshastigheder af cyclin D1 og c-myc i gruppen af ​​nukleare coekspression var signifikant højere end for cytoplasmatisk co-ekspression (P 0,05)

2.. Coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet eller cellekernen blev korreleret til lymfatiske metastase af NSCLC

Som vist i tabel 2, coekspression på IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var 63,3% (19/30) i gruppe med lymfeknuder nodal metastaser (N1-3) og 38,3% (31/81) i gruppen med primære vækster (N0). Nodal metastaser viste højere co-ekspression på IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen end primære vækster (P 0,05). Ingen statistisk signifikant forskellig sats blev vist mellem gruppen af ​​T1 og T2-4 (tumor status) (P 0,05, tabel S2), også mellem gruppen af ​​adenocarcinom og pladecellekræft (histologiske typer) (P 0,05, tabel S3 ).

3. Coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet eller cellekernen var korreleret til dårlig prognose af NSCLC

Kaplan-Meier overlevelse analyse viste en signifikant lavere overlevelse tid i patienter med coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen end dem med ingen co-ekspression. Fem års overlevelsen tid efter resektion i gruppen med deres co-ekspression i cytoplasmaet og kernen var signifikant lavere end uden co-ekspression (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 måned, p 0,05, figur 3A), og gruppen af ​​nukleare co-ekspression var signifikant lavere end for cytoplasmatisk co-ekspression (36,000 ± 6.329 vs 46.528 ± 3.758 måneder, P 0,05, figur 3B).

(A) A.Den gruppe med IQGAP1 og Dvl noncoexpression i cytoplasmaet og kernen ( 61 tilfælde); b.The gruppe med IQGAP1 og Dvl coekspression i cytoplasmaet og nucleus (50 tilfælde) (B) A.Den gruppe med IQGAP1 og Dvl noncoexpression i cytoplasmaet og kernen (61 tilfælde); b.The gruppe med IQGAP1 og Dvl coekspression i cytoplasmaet (42 tilfælde); c.The gruppe med IQGAP1 og Dvl coekspression i kernen (8 sager).

For at afklare, om coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen uafhængigt var forbundet med prognosen for patienter med NSCLC, vi ansat Cox proportional hazard regressionsmodel. Resultatet viste, at cytoplasmatiske og nukleare coexpressions var uafhængige risikofaktorer for prognosen for patienter med NSCLC (P 0,05; tabel 3).

Diskussion

Som en vigtig effektor af Rho GTPaser, IQGAP1 er et stillads protein og spiller grundlæggende funktion i celle bevægelse ved modulering aktincytoskelettet gennem Rac1 og Cdc42 [12] – [14]. DVL er en væsentlig mediator af den kanoniske Wnt signalvejen, og dets nukleare lokalisering er påkrævet for kanonisk Wnt signalering [15], [16]. I Xenopus embryoner IQGAP1 interageret med Dvl og reguleret sit nukleare lokalisering til moderat ekspression af Wnt målgener under tidlig embryogenese [11]. Men forholdet mellem IQGAP1 og Dvl i tumorer ikke er blevet rapporteret,.

Den foreliggende undersøgelse undersøgte IQGAP1 og Dvl udtryk for NSCLC (adenokarcinom og planocellulært karcinom). Vi fandt, at IQGAP1 og Dvl primært var placeret i cytoplasmaet. Coekspression på IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet eller cellekernen var signifikant højere end i membranen; coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var signifikant korreleret (P 0,05), men ikke i membranen (P 0,05). Den coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen var forbundet med lymfeknudemetastaser og dårlig prognose i NSCLC. Overlevelsen i gruppen af ​​nukleare co-ekspression var betydeligt værre end for cytoplasmatisk co-ekspression. Den membranøs coekspression af IQGAP1 og Dvl var ikke korreleret (P 0,05). Disse resultater antydede, at IQGAP1 interagerede med Dvl i cytoplasmaet og kernen af ​​NSCLC, og den rolle i cytoplasmaet kan være en af ​​de kritiske trin i modulering Dvl kernelokalisering, men ikke i membranen. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelse [11].

Nuklear lokalisering af Dvl er nødvendig for kanonisk Wnt signalering [15]. DVL samarbejder med c-Jun til at regulere gentranskription stimuleret af den kanoniske Wnt signalvejen i kernen [16]. I denne undersøgelse fandt vi, at de målgener af kanoniske Wnt signalering, cyclin D1 og c-myc, de positive satser af dem i gruppen med IQGAP1 og Dvl coekspression i kernen var meget højere end i cytoplasmaet. Survival-analyse viste også, at patienter med coekspression af IQGAP1 og Dvl i kernen havde en signifikant lavere overlevelsestid end patienter med at i cytoplasmaet (P 0,05). Disse resultater antyder, at nuklear coekspression af IQGAP1 og Dvl er associeret med aktiveringen af ​​kanoniske Wnt pathway.

Baseret på de ovenstående resultater konkluderer vi, at coekspression af IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og kernen er korreleret med lymfeknudemetastase og dårlig prognose i NSCLC. IQGAP1 modulerer Dvl kernelokalisering i cytoplasmaet, men ikke i membranen. Den coekspression af IQGAP1 og Dvl i kernen er forbundet med ekspressionen af ​​cyclin D1 og c-myc, som tyder på, at nuklear coekspression af IQGAP1 og Dvl er associeret med aktiveringen af ​​kanoniske Wnt-vejen. Derfor hæmning af bindingen af ​​IQGAP1 og Dvl i cytoplasmaet og forhindre Dvl nuklear translokation, kan være en af ​​de strategier for forebyggelse og behandling af lungekræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

validering af antistof (IQGAP1, A og D, Dvl, B og E) til immunhistokemi. A-C: adenocarcinom; D-F: pladecellecarcinom; C og F: muse-IgG blev anvendt i stedet for det primære antistof. Oprindelig forstørrelse, 400 ×; . Skala bar, 20 pm

doi: 10,1371 /journal.pone.0113713.s001

(TIF)

Figur S2.

Co-ekspression af IQGAP1 (A, C) og Dvl (B, D) i membranen af ​​NSCLC. A-B: adenocarcinom; C-D: pladecellekarcinom. Oprindelig forstørrelse, 400 ×; . Skala bar, 20 pm

doi: 10,1371 /journal.pone.0113713.s002

(TIF)

tabel S1.

IQGAP1 og Dvl udtryk i NSCLC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s003

(DOC)

tabel S2.

IQGAP1 og Dvl coekspression i forskellige tumor status

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s004

(DOC)

tabel S3.

IQGAP1 og Dvl coekspression i forskellige histologiske typer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113713.s005

(DOC)

Tak

Forfatterne ønsker at takke Dr. Weinan Li, for fremragende teknisk bistand.