PLoS ONE: Kræft Stem Cell Gene Profil som Predictor af tilbagefald i High Risk fase II og fase III, radikal resektion Colon Cancer Patients

Abstrakt

Kliniske data indikerer, at prognostisk lagdeling af radikalt resektion kolorektal cancer baseret på sygdom stadium kun kan ikke altid være tilstrækkelig. Prækliniske resultater antyder, at cancer stamceller kan påvirke den biologiske adfærd kolorektal cancer uafhængigt af etape: Formålet med undersøgelsen var at vurdere, om et panel af stemness markører blev korreleret med kliniske resultater i opereret fase II og III tyktarmskræft patienter. Et panel af 66 markører for stemness blev analyseret og dermed patienter blev delt i to grupper (A og B) med de fleste patienter Clustering i overensstemmelse med forskellig tid til tilbagefald ved hjælp af en statistisk algoritme. Der blev analyseret i alt 62 patienter. Tredive-seks (58%) fik tilbagefald under opfølgningsperioden (interval 1.63-86.5 måneder). Tolv (19%) og 50 (81%) patienter blev tildelt i gruppe A og B, hhv. En væsentlig forskellig median tilbagefald overlevelse blev observeret mellem de 2 grupper (22.18 vs 42.85 måneder, p = 0,0296). Blandt af alle testede gener, dem med den højere “vægt” i fastlæggelsen anderledes prognose var CD44, ALCAM, DTX2, HSPA9, CCNA2, PDX1, MYST1, COL1A1 og ABCG2. Denne analyse understøtter ideen om, at, bortset fra scenen, biologiske variabler, såsom ekspressionsniveauer for tyktarmskræft stamceller gener, kan være relevante for fastlæggelsen af ​​en øget risiko for tilbagefald i reseceret kolorektal kræftpatienter

Henvisning:. Giampieri R, Scartozzi M, Loretelli C, Piva F, Mandolesi A, Lezoche G, et al. (2013) Cancer Stem Cell Gene Profil som Predictor af tilbagefald i High Risk fase II og fase III, radikal resektion tyktarmskræft patienter. PLoS ONE 8 (9): e72843. doi: 10,1371 /journal.pone.0072843

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Marts 18, 2013; Accepteret: 16. juli 2013; Udgivet: 4. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Giampieri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af AIRC (italiensk sammenslutning af kræftforskning). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kirurgi er fortsat grundpillen i behandlingen af ​​ikke-metastatiske patienter kolorektal cancer og i omkring 50% stadie III resekterede patienter, helbrede opnås ved kirurgi alene. Adjuverende behandling forsøg såsom MOSAIC [1] eller XELOXA forsøg [2] viste, at kombinationskemoterapi med 5-FU /Capecitabine og Oxaliplatin giver en overlevelse fordel i intervaller af 10-15% for fase III resektion patienter.

i fase II-patienter, data er endnu mere begrænset: adjuverende kemoterapi ordineres sædvanligvis på baggrund af risikofaktorer eller “onkolog valg”: den andel af stadie II patienter i kliniske forsøg, er for lille til at gøre endelige antagelser om fordelen ved adjuverende behandling i denne undergruppe af patienter [3] -. [5]

for at datere TNM cathegories er den mest pålidelige måde at imødegå patienternes risiko for tilbagefald for beslutninger om kliniske behandling. En mulig rolle for cancer stamceller er blevet foreslået som potentielle indikator for høj risiko for tilbagefald i reseceret patienter med tarmkræft. Disse celler er blevet identificeret som prædiktorer for dårligt resultat og stiltiende at have en rolle i cancer progression og udvikling af metastaser, muligvis som følge af deres hypotetiske høj replikation potentiale [6], [7].

canonically, kolorektal cancer stamcellepopulation kan primært opdelt i 2 hovedklasser: en typisk undertype af kolorektal cancer stamceller, som normalt identificeres gennem CD133 positive plet og en heterogen population af ikke-CD133 positive stamceller. Men begge klasser synes at besidde en lige så effektiv evne til at proliferere under visse betingelser [8] – [10]. På grund af deres biologiske karakteristika cancer stamceller repræsenterer en næsten ubegrænset ressource for tumorvækst og progression og menes at være ansvarlig for at opretholde en slags beskyttet reservat niche for kræftceller. En yderligere ejendommelighed ved cancer stamceller er deres relative evne til at undslippe kemoterapi-induceret celledød og dermed styrke deres rolle som en selvfornyende cancerceller kilde til tumorer [11] – [13]

Baseret på disse. antagelser kan vi hypotese, at kræften stamcellepopulation kan være ansvarlige for de biologiske karakteristika af tumorceller og kan i sidste ende påvirke klinisk opførsel af faste tumorer, selv under kemoterapi behandling.

i en tidligere analyse af Gerger et al. [14] forfatterne var i stand til at identificere fælles cancer stamceller celle genvarianter som forudsigende faktorer for tilbagefald i radikalt resektion patienter med tyktarmskræft. I denne undersøgelse er blevet analyseret germlinie polymorfismer af et begrænset antal af formodede stamceller markører. Det er dog muligt, at stamceller gen profil i tumorer kan afvige fra, hvad der kan observeres på kønscellelinie niveau. Desuden stamcelle genekspression i tumorer kan også være biologisk relevant.

I vores undersøgelse vurderede vi, om et panel af 66 gener, angivet at have en rolle i vækst og proliferation af tyktarmskræft stamceller, kan tillade at gøre en mere præcis forudsigelse af sandsynligheden for tilbagefald i reseceret ikke-metastatiske patienter med tyktarmskræft. Det endelige mål var at identificere en stemness-baserede risikogruppe og angive mulige stamceller forbundne molekylære mål for den fremtidige udvikling af stamcelle-rettet behandlingsstrategier.

Materialer og Metoder

Patienter Selection

en radikal resektion kolon kræftpatienter, der fik adjuverende kemoterapi på vores afdeling 2005-2007 blev anset berettiget til vores undersøgelse.

patienterne skal have præsenteret enten med en klinisk defineret høj risiko fase II eller med en fase III helt reseceret kolon tumor

høj risiko fase II blev defineret i nærværelse af mindst ét ​​af følgende:. pT4, dårligt differentieret histologi, tarmobstruktion eller perforation ved præsentationen, histologisk påvist vaskulær, lymfe eller perineurale invasion . Vi er udelukket fra analyse patienter, der fik adjuverende kemoterapi alene på grundlag af en ikke tilstrækkelig lymfeknude prøvetagning (lymfeknude prøveudtagning mindre end 12).

Enten enkeltstof 5FU (eller capecitabin) eller 5FU (eller capecitabin) i kombination med oxaliplatin blev betragtet som acceptable alternativer. Opfølgning opstod efter institutionelle retningslinier. Historie, fysisk undersøgelse, en komplet blodtælling, CEA og CA 19-9 beslutsomhed blev udført ved tre-måneders intervaller i tre år, så i seks måneder mellemrum år 4 og 5 efter operationen. CT-scanning af brystet og maven blev gjort hver 6. måned ved årets 1 til 3, og årligt derefter med år 4 og 5. koloskopi blev udført ved år 1 og derefter hver 3 og 5 år. Stedet og tidspunktet for første tilbagefald og datoen for død blev registreret. Henblik på studier blev retrospektivt analyseret patienternes data. Denne undersøgelse blev godkendt af vores Institutional komitésystem (Comitato Etico Azienda Ospedaliera – Ospedali Riuniti, Ancona, Via Conca 71, Italien). Alle patienter gav deres skriftlige samtykke til undersøgelsen.

Prøver Behandling og kvantitativ PCR analyse

Genekspression profil analyse blev udført af laboratoriepersonale blindet til patienternes status.

Multiple sektioner af formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke (25 til 30 mg af primær tumor, manuel mikrodissekeret væv) blev opsamlet; paraffinvoks blev fjernet, og totalt RNA blev ekstraheret ved RT

2 FFPE RNA Extraction Kit (SABiosciences Corporation, Frederick, MD, USA), ifølge producentens instruktioner. RNA-prøver blev kvantificeret og kvalitet-testes for tilstedeværelse af protein og /eller organiske forureninger opløsningsmiddel ved en spektrofotometrisk assay.

Fem hundrede nanogram fra hver prøve blev revers transkriberet til cDNA og præ-amplificeret under anvendelse af RT2 FFPE PREAMP cDNA Synthesis Kit og primerblanding specifik for den tilpassede Stem Cell RT2Profiler PCR Array (SABiosciences Corporation).

Kvantitativ realtids-PCR analyse blev udført på en 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA) ved en SYBR® Green metode. Target og reference- gener og kontroller udvalgt til genekspression analyse kom fra stamcelle generne, der er af Stamceller RT2Profiler PCR Array (# CAPH09495-PAH’er-405, SABiosciences Corporation). Også på grund af manglen på standard PCR vifte af stamceller genmarkører mere ordentlig til kolorektal cancer stamceller, de specifikke gener Alcam (også kendt som CD166), PROM1 (CD133), CD24 og LGR5 blev tilsat.

En komplet liste over de testede gener kan findes i tabel 1.

Databehandling og statistisk analyse

Relativ genekspression blev kvantificeret ved hjælp af den sammenlignende ACt metoden. Vi brugte af “PCR Array Dataanalyse Web Portal” (https://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) på producentens websted for at udføre data kvalitetstest, beregninger på qPCR data og data normalisering. Især alle tærskel cyklusser værdier større end 35, eller ikke detekteret, blev betragtet som negative opkald. Vi beholdt prøver med negativ genomisk DNA-kontrol, konkret revers transkription kontrol og positive PCR kontrolværdier, i henhold til producentens angivelser.

For at vurdere forskellige mønstre af genekspression, gennemførte vi klyngedannelse analyse af K-midler (K ​​= 2 ) metoden [15]. Denne særlige clustering analyse algoritme blev valgt til at teste den mulige eksistens af 2 forskellige mønstre af genekspression, relateret til forskellige prognose. Især K-midler fremgangsmåde har til formål at danne foruddefinerede antal (K) fordeler sig i en klynge af forskellige observationer i et datasæt, ved fremgangsmåden ifølge den nærmeste middelværdi. Clustering analyser blev udført af MEV (MultiExperiment Viewer) værktøj.

Statistisk analyse blev udført med MedCalc Package (MedCalc® v9.4.2.0)

Primært endpoint i undersøgelsen var at identificere mellem 2 prognostiske grupper en betydelig forskel i median tid til tilbagefald (TTR), beregnet som intervallet fra datoen for diagnosen til datoen for tumor tilbagefald. TTR blev censureret på dødstidspunktet eller sidste opfølgning, hvis patienten ikke havde vendt tilbage.

I den primære hypotese, at patienter med opereret højrisiko stadie II-fase III kolorektal cancer har omkring 60% tilbagefald-fri risiko på 2-års observation tid, og at patienter med dårlig prognostisk score har 30% tilbagefald-fri risiko på 2-års, under forudsætning af alpha-sandsynlighed fejl på 0,05 og beta-sandsynlighed fejl på 0,10, er et minimum af 53 patienter havde brug for at teste hypotesen.

Sammenhængen mellem TTR og cancer stamceller genetisk profil blev anslået af Kaplan-Meier-metoden. Væsentlige forskelle i sandsynligheden for tilbagefald mellem lagene blev evalueret af log-rank test

For hvert gen identificeret ved K-midler clustering analyse blev efterfølgende evalueret korrelationen med tiden til tilbagefald:. Medianen af ​​den samlede specifikke gen koncentration blev anvendt som cut-off, på grund af manglen på andre mere pålidelige og reproducerbare midler til estabilish en hensigtsmæssige afskæringsfrekvens.

Resultater

i alt 62 patienter blev analyseret. Blandt dem, 36 havde en trin II tyktarmskræft (58%), mens de resterende 26 (41%) havde en stadium III-sygdom (tabel 2). Median opfølgningsperiode var 44 måneder (interval 12.5-86.5 måneder). I løbet af denne opfølgningsperiode tilbagefald 36 (58%) patienter.

Blandt 26 stadie III patienter, 10 (38%) tilbagefald under opfølgningsperioden hvorimod i de resterende 36 fase II patienter, 26 (72%) tilbagefald blev set.

median TTR for stadie II patienter var 23,3 måneder, mens median TTR ikke blev nået til stadie III patienter. Denne forskel var ikke statistisk signifikant (p = 0,0696).

Når du udfører K-betyder analyse (K = 2), gener, der havde en stor rolle i at bestemme fordelingen i en af ​​de 2 forudbestemte grupper var CD44 (p = 0,0004), ALCAM (p = 0,003), DTX (p = 0,005), HSPA9 (p = 0,012), CCNA (p = 0,03), PDX1 (p = 0,04), MYST1 (p = 0,04), COL1A1 ( p = 0,03), ABCG2 (p = 0,04). En sammenligning af de forskellige udtryksformer af disse gener i gruppe A og B kan findes i figur 1.

Forskellige genekspression betyder mellem patienter med radikalt resektion patienter tyktarmskræft viser en ugunstig kræft stamceller gen profil, GRUPPE a, (rød) og radikalt resektion tyktarmskræft patienter, der viser en positiv cancer stamceller gen profil, GRUPPE B (blå) som stratificeret efter K-midler (K ​​= 2) metode.

efter clustering analyse to grupper af patienter blev identificeret:. gruppe A (ugunstige kræft stamceller gen profil) og gruppe B (positiv cancer stamceller gen profil)

Tolv patienter (19%) blev tildelt af K-midler analyse i gruppe A, mens de resterende 50 patienter (81%) blev tildelt i gruppe B. i gruppe A blev tildelt to fase III (17%) og 10 fase II (83%) patienter, mens der i gruppe B de resterende 24 (48 blev tildelt%) fase III og 26 (52%) stadie II patienter. Alle andre kliniske karakteristika analyserede resulterede velafbalanceret mellem de 2 grupper (tabel 2).

Eleven (91%) patienter i gruppe A fik tilbagefald i observationsperioden mens 25 (50%) patienter i gruppe B tilbagefald under i samme periode. Denne forskel var statistisk signifikant ved chi-square test (p = 0,0214). En signifikant forskellig median TTR mellem de 2 grupper blev observeret: 22,18 vs 42,85 måneder (HR: 0,46, 95% CI: 0,15 til 090, p = 0,02). (Figur 2) Salg

Kaplan-Meier-kurver for median for tilbagefald (TTR) radikalt resektion patienter tyktarmskræft viser en ugunstig kræft stamceller gen profil, GRUPPE a (-) vs. radikalt resektion tyktarmskræft patienter, der viser en positiv cancer stamceller gen profil, GRUPPE B (—- —) (22,1 måneder vs 42,8 måneder, p = 0,02).

ved analyse af virkningen af ​​hver enkelt gen identificeres ved K-betyder analyse taget enkeltvis, nogen signifikant sammenhæng med median TTR var observeret. Et resumé af disse resultater kan findes i tabel 3.

Diskussion

Identifikation af en delmængde af radikalt resektion, ikke-metastatiske kolorektal cancer patienter med højere sandsynlighed til tilbagefald har dybe implikationer. TNM, selv om der tegner sig for tumor diffusion som den vigtigste faktor risiko for tilbagefald tager ikke højde for biologiske karakteristika af selve svulsten.

En mulig rolle for cancer stamceller er blevet hypotese som potentiel indikator for høj risiko for tilbagefald i resektion patienter med tyktarmskræft [6] – [13]. Disse celler er blevet sædvanligvis identificeret som prædiktorer for dårligt resultat og underforstået at spille en rolle i cancer progression og udvikling af metastaser. I vores analyse foreslog vi, at kræft stamceller gen profil kan være relevant i fastlæggelsen TTR i trin II og fase højrisiko-III radikalt resektion kolon tumorer. Desuden risikoen for tilbagefald i vores serie syntes ikke korreleret med sygdom fase, tyder på, at biologien mere end trin guider naturhistorie for tyktarmskræft. Ved udførelse K-betyder analyse (K = 2), gener, der havde en væsentlig rolle for tildeling til et af de 2 forudbestemte grupper var CD44 (p = 0,0004), ALCAM (p = 0,003), DTX (p = 0,005 ), HSPA9 (p = 0,012), CCNA (p = 0,03), PDX1 (p = 0,04), MYST1 (p = 0,04), COL1A1 (p = 0,03), ABCG2 (p = 0,04).

En rolle for CD44, ALCAM, DTX, HSPA9, CCNA, PDX1, MYST1, COL1A1 og ABCG2 udtryk påvirke tumor resultat, eventuelt gennem interaktion med befolkningen stamceller, er blevet særskilt beskrevet i fortiden, men dette er, at vores viden , første gang, at flere markører er blevet undersøgt samtidigt, hvilket bekræfter den relative betydning af hver enkelt af dem.

blandt de molekylære determinanter dukket op som betydningsfulde i vores undersøgelse, Men vi mener, at resultaterne vedrørende CD44, ABCG2 og CD133 bør drøftes yderligere, især på grund af den biologiske ejendommelighed de besidder.

i særdeleshed CD44 genekspression syntes at repræsentere den vigtigste faktor, der påvirker sandsynligheden for tilbagefald i vores gruppe af reseceret patienter. CD44 er også kendt som receptoren for hyaluronsyre og har en vigtig rolle i celler til stroma interaktion [16] – [19]. Selvom der allerede rapporteret som en prædiktiv faktor for tilbagefald i kolorektal cancer patienter, eksisterer betydelig kontrovers om den faktiske virkning af forskellige niveauer af CD44 genekspression. I et tidligere arbejde af Huang et al. [20] stamceller fra patienter med tyktarmskræft blev bedømt for genekspression af CD44 og CD133 og tumorer huser højere niveauer af både CD44 og CD133 var relateret til højere risiko for udvikling af tidlige levermetastaser.

Tværtimod , i et værk udgivet af Dallas et al. [21] -celler som blev gensplejset til at være knock-down for CD44-ekspression havde næsten 10 gange stigning i metastatisk potentiale i både lever og lunge. Ud over det, CD44 negative celler udviste en større “mekanisk overholdelse” (evnen til cytosol komponenter til at bevæge sig frit gennem cytosolen selv), en egenskab, der anses afgørende i processen for ekstravasation og migration gennem blod-stream. Globalt disse resultater synes at gå sammen med vores observation, at lave niveauer af CD44 er relevante for tid til tilbagefald i tyktarmskræft.

Tværtimod højere udtryk for ABCG2 resulterede oftere til stede i gruppe A-patienter, der med dårligere prognose. ABCG2 (også kendt som CDw338) er et protein på celleoverfladen, involveret med transport af molekyler over cellemembraner. Ekspression af dette protein er blevet relateret med multiresistens og i en nyere arbejde Oh et al. [22] kolorektal cancer celler bliver resistente over for FOLFOX kemoterapi udviste høje niveauer af ABCG2. Dette kunne forklare den tilsyneladende reduceret effekt af adjuverende kemoterapi i vores gruppe af patienter med dårligere prognose.

Selvom publicerede data hidtil synes at antyde, at CD133 er et vigtigt biomarkør i tyktarmskræft stamceller, dens rolle er langt i at blive fuldt forstået. Dette protein (også kaldet Prominin-1 eller i forkortet form PROM-1) har en rolle i dannelsen af ​​membran fremspring og blæreudslæt handel [23]. Andre end denne temmelig basis funktion, postuleres det, at PROM-1 interagerer med andre godt og-ikke-så-kendte intracellulære messangers såsom dem involveret i WNT /Beta-catenin, PI3K-Akt-mTOR, HIF-1alfa og CXCR4 veje [24], [25].

i særdeleshed høj CD133 udtryk synes at være relateret til dårligere prognose i kolorektal cancer på grund af sin højere forekomst i metastaser snarere end i primær tumor [17].

i vores analyse blev forskellige niveauer af CD133 ikke knyttet til en højere sandsynlighed for tilbagefald. Faktisk patienter i gruppe A og B havde heterogene niveauer af CD133 udtryk, med ingen signifikante forskelle mellem de to grupper. Også, når man analyserer virkningen af ​​høj vs lav koncentration af CD133 blev observeret nogen signifikant forskel med TTR.

Disse data synes at være i modsætning til dem, der præsenteres af Artells et al. [26] tyder på, at høje niveauer af CD133-genekspression blev korreleret med en højere sandsynlighed for tilbagefald i reseceret patienter med tarmkræft. Vores resultater kan forklares ved det faktum, at i vore analyse flere forskellige faktorer blev taget i betragtning, og ikke bare en markør af stemness: på grund af karakteren af ​​K-betyder analyse, i tilstedeværelsen af ​​flere biologiske faktorer med en mere konkret indflydelse på TTR , effekten af ​​CD133 som markør for tilbagefald kunne fortyndes.

Vi ved også, at CD133 IHC udtryk kan være inducerbare og at selv tidligere CD133 null stamceller kan udtrykke

de novo

CD133 i forskellige kultur betyder og på særlige betingelser [27]. Dette kunne i det mindste hensyn til modstridende resultater af analyser udført på CD133 IHC udtryk og prognose.

Desuden i en anden oplevelse af Shmelkov et al. [8] CD133 null celler blev antaget at have endnu en mere aggressiv fænotype end deres modpart CD133 positive. Især når inokuleret i SCIV mices, tumorvækst fra CD133 negative stamceller var markant større end CD133 positive cellepopulation.

Globalt vore resultater tyder for første gang en potentiel rolle for cancer stamceller gen profil i diskriminerende forskellige risici for tilbagefald uanset sygdom fase. Disse resultater kan også være relevant, efter yderligere bekræftelse, til identifikation af mulige stamceller-linked molekylære mål for den fremtidige udvikling af stamcelle-rettet behandlingsstrategier.